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| 核封入エンドペプチダーゼ | |||||||||
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 TEV プロテアーゼ (白) は、活性部位の 3 残基 (赤) を持つペプチド基質 (黒) と複合しています。 ( PDB : 1lvb ) | |||||||||
| 識別子 | |||||||||
| EC番号 | 3.4.22.44 | ||||||||
| CAS番号 | 139946-51-3 | ||||||||
| データベース | |||||||||
| インテンズ | IntEnzビュー | ||||||||
| ブレンダ | BRENDAエントリー | ||||||||
| エクスパス | NiceZyme ビュー | ||||||||
| ケッグ | KEGGエントリー | ||||||||
| メタサイク | 代謝経路 | ||||||||
| プリアモス | プロフィール | ||||||||
| PDB構造 | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
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TEVプロテアーゼ（EC 3.4.22.44、タバコエッチウイルス核封入αエンドペプチダーゼ）は、タバコエッチウイルス（TEV）由来の高度に配列特異性のシステインプロテアーゼです。 [1]これは、キモトリプシン様プロテアーゼのPA群のメンバーです。[2] TEVプロテアーゼは、その高い配列特異性のため、 in vitroおよびin vivoでの融合タンパク質の制御された切断に頻繁に使用されます。[3] TEVプロテアーゼによって認識されるコンセンサス配列は、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-|-Serであり、ここで「|」は切断されたペプチド結合を示します。[4]
起源
タバコエッチウイルスは、ゲノム全体を単一の巨大なポリタンパク質（350 kDa）としてコード化しています。これは、P1プロテアーゼ（1つの切断部位）、ヘルパーコンポーネントプロテアーゼ（1つの切断部位）、TEVプロテアーゼ（7つの切断部位）の3つのプロテアーゼによって機能単位に切断されます。[1]ネイティブTEVプロテアーゼには、内部自己切断部位も含まれています。この部位はゆっくりと切断され、酵素を不活性化します（この生理学的理由は不明です）。
構造と機能
TEVプロテアーゼの構造は、X線結晶構造解析によって解明されている。[5] TEVプロテアーゼは、2つのβバレルと柔軟なC末端テールで構成されており、キモトリプシンスーパーファミリーのプロテアーゼ（MEROPS分類ではPAクラン、C4ファミリー）と構造的に相同性を示している。 [2] TEVプロテアーゼは、細胞性セリンプロテアーゼ（トリプシン、エラスターゼ、トロンビンなど）と相同性があるが、その触媒求核剤としてシステインを使用する[6]（他の多くのウイルスプロテアーゼも同様）。
共有結合触媒は、2つのバレル（β1にAsp、β2にHisとCys）に分割されたAsp-His-Cysトライアドによって行われます。 [7]基質はβシートとして保持され、バレル間の溝と反平行相互作用を形成し、C末端テールと平行相互作用を形成します。[8]したがって、酵素は基質の周囲に結合トンネルを形成し、側鎖相互作用が特異性を制御します。[5]
特異性
好ましいネイティブ切断配列は、ネイティブポリタンパク質基質の切断部位を反復配列について調べることによって最初に特定されました。これらのネイティブ切断部位のコンセンサスは ENLYFQ\S であり、ここで '\' は切断されたペプチド結合を示します。[4]基質の残基は、切断部位の前では P6 から P1、切断部位の後では P1' とラベル付けされています。初期の研究では、プロテアーゼがネイティブ配列に対してどの程度特異性があるかを調べるために、類似の基質の配列の切断も測定されました。[9] [10]
その後の研究では、ランダム化された配列のプールから切断された基質の配列決定を使用して、好みのパターンを決定しました。[11] [12] ENLYFQ\Sは最適な配列ですが、プロテアーゼはさまざまな基質に対して多かれ少なかれ活性があります（つまり、ある程度の基質の乱用を示します）。最も切断されるのは、コンセンサスEXLYΦQ\φに最も近い配列です。ここで、Xは任意の残基、Φは任意の大型または中型疎水性残基、φは任意の小型疎水性または極性残基です。この配列は最適ですが、一部の位置に好ましくない残基がある配列でも、配列の残りの部分が最適であれば切断される可能性があります。[10] [12]
特異性は、酵素と基質の接触面積が大きいことによってもたらされます。トリプシンなどのプロテアーゼは、基質側鎖を結合するポケットが 1 つまたは 2 つしかない浅い結合溝のため、切断された結合の前後の 1 つの残基に対して特異性があります。対照的に、TEV プロテアーゼなどのウイルス プロテアーゼは、基質を完全に覆って結合トンネルを形成する長い C 末端を持っています。このトンネルには、基質ペプチドの各側鎖 (P6 から P1') が相補的な部位 (S6 から S1') に結合するように、一連の密な結合ポケットが含まれています。[5]
特に、ペプチド側鎖P6-Gluは3つの水素結合のネットワークに接触します。P5-Asnは溶媒に向かって伸びており、特異的な相互作用は起こりません（したがって、この位置では基質コンセンサスが存在しません）。P4-Leuは疎水性ポケットに埋め込まれています。P3-Tyrは、末端に短い水素結合を持つ疎水性ポケットに保持されています。P2-Pheも、ヒスチジン三重鎖の面を含む疎水性物質に囲まれています。P1-Glnは4つの水素結合を形成し、P1'-Serは浅い疎水性溝に部分的にのみ囲まれています。[5]
生化学ツールとしての応用
このタンパク質の主な用途の1つは、精製された組み換え融合タンパク質から親和性タグを除去することです。TEVプロテアーゼが生化学ツールとして使用される理由は、その高い配列特異性です。この特異性により、優先配列が柔軟なループに挿入されると、タンパク質の制御された切断が可能になります。また、認識される配列がタンパク質にほとんど存在しないため、TEVプロテアーゼは生体内で比較的無毒です。[13]
合理的設計はプロテアーゼ特異性を変えることに限られた成功しか収めていないが、指向性進化は切断部位の 前[14]または後[15] [16]で好ましい残基を変えるために使用されてきた。
しかし、TEVプロテアーゼは生化学的ツールとしては限界があります。自己分解（自己分解）によって不活性化されやすいのですが、これは内部切断部位のS219V変異によって解消することができます。[17]単独で発現したプロテアーゼも溶解性が低いですが、指向性進化と計算設計によって溶解性を改善する試みがいくつか行われてきました。また、溶解性を高めるパートナーとして機能するマルトース結合タンパク質（MBP）との融合によって発現を改善できることも示されています。[3]
TEVプロテアーゼは4℃で活性が10分の1に低下することが報告されている。[18] TEVプロテアーゼは34℃を超える温度で活性が低下する。[19]元のTEVプロテアーゼは高活性を得るために還元剤の存在を必要とし、ジスルフィド結合を含むタンパク質の機能を妨げる可能性がある。さまざまな変異が組み込まれた後、後の「スーパーTEVプロテアーゼ」バージョンは還元剤の有無にかかわらず非常に活性である。[20] [21] [22]
この酵素の分子量は、使用される特定の構造に応じて 25 ～ 27 kDa の間で変化します。
参考文献
- ^ ab UniProt: TEVポリタンパク質: "P04517"。
- ^ ab Rawlings ND、Barrett AJ、 Bateman A (2012 年 1 月)。「MEROPS: タンパク質分解酵素、その基質および阻害剤のデータベース」。Nucleic Acids Res . 40 (データベース号): D343–50。doi :10.1093/nar/gkr987。PMC 3245014。PMID 22086950。
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外部リンク
- UniProt 上の TEV ポリタンパク質
- MEROPS の TEV プロテアーゼは、Wayback Machineで 2016-03-03 にアーカイブされています。
- 国立がん研究所 TEV FAQ
