走査型電子顕微鏡

走査型電子顕微鏡( SEM )は、電子の集束ビームで表面を走査してサンプルの画像を作成するタイプの電子顕微鏡です。電子はサンプル内の原子と相互作用し、サンプルの表面形状や組成に関する情報を含むさまざまな信号を生成します。電子ビームはラスタースキャンパターンで走査され、ビームの位置と検出された信号の強度が組み合わされて画像が作成されます。最も一般的な SEM モードでは、電子ビームによって励起された原子から放出された二次電子が、二次電子検出器 ( Everhart–Thornley 検出器)を使用して検出されます。検出できる二次電子の数、つまり信号強度は、とりわけ、試料の形状に依存します。一部の SEM は、1 ナノメートルを超える解像度を実現できます。

試料は、従来のSEMでは高真空下で観察されるか、可変圧力SEMや環境SEMでは低真空または湿潤状態で観察され、特殊な機器では広範囲の極低温または高温下で観察されます。^[1]

走査型電子顕微鏡の初期の歴史については、マクマランが解説している。^{[2] [3]}マックス・ノールは電子線スキャナを使用してチャネリングコントラストを示す 50 mm の物体視野幅の写真を作成したが、 ^[4]縮小され細かく焦点を絞った電子線で非常に小さなラスターを走査することで高解像度の顕微鏡を1937 年に発明したのはマンフレッド・フォン・アルデンヌであった^[5]。同年、セシル・E・ホールも、トロント大学の上司である EF・バートンから依頼されてからわずか 2 年後に、北米初のエミッション顕微鏡の構築を完了した。^{[6]アルデンヌは、}透過型電子顕微鏡(TEM)の解像度を超え、TEM での実際の画像化に固有の色収差に関する重大な問題を軽減するために、電子線の走査を適用した。彼はさらに、SEM のさまざまな検出モード、可能性、理論について論じ、^[7]最初の高解像度 SEMの構築についても論じた。^[8]ツヴォルキンのグループによってさらなる研究が報告され、 ^[9] 1950年代から1960年代初頭にはチャールズ・オートリー率いるケンブリッジのグループによっても研究が続けられ、 ^{[10] [11] [12] [13]最終的に}ケンブリッジ・サイエンティフィック・インストゥルメント社によって最初の商用機器「ステレオスキャン」が1965年にデュポン社に納入されて販売されることとなった。

SEM が画像を生成するために使用する信号は、サンプル内のさまざまな深さにある原子と電子ビームの相互作用から生じます。生成される信号には、二次電子(SE)、反射または後方散乱電子(BSE)、特性 X 線と光 (カソードルミネッセンス) (CL)、吸収電流 (試料電流)、透過電子など、さまざまな種類があります。二次電子検出器はすべての SEM の標準装備ですが、1 台のマシンに他のすべての可能性のある信号用の検出器が搭載されていることはまれです。^{[引用が必要]}

二次電子のエネルギーは 50 eV程度と非常に低く、固体内での平均自由行程が制限されます。そのため、SE はサンプル表面の上部数ナノメートルからしか逃れることができません。二次電子からの信号は、一次電子ビームの衝突点で高度に局在する傾向があるため、1 nm未満の解像度でサンプル表面の画像を収集できます。後方散乱電子 (BSE) は、弾性散乱によってサンプルから反射されたビーム電子です。BSE は SE よりもはるかに高いエネルギーを持っているため、サンプル内のより深い場所から放出され、その結果、BSE 画像の解像度は SE 画像よりも低くなります。ただし、BSE 信号の強度はサンプルの原子番号 (Z) と強く関連しているため、BSE は特性 X 線から作成されたスペクトルとともに分析 SEM でよく使用されます。BSE 画像では、サンプル内のさまざまな要素の分布に関する情報は得られますが、その同一性に関する情報は得られません。生物標本など、主に軽元素で構成されるサンプルでは、​​BSEイメージングにより、二次電子画像では検出が困難または不可能な直径5または10nmのコロイド状金 免疫標識を画像化できます。 ^[14]特性X線は、電子ビームがサンプルから内殻電子を除去し、より高エネルギーの電子が殻を満たしてエネルギーを放出するときに放出されます。これらの特性X線のエネルギーまたは波長は、エネルギー分散型X線分光法または波長分散型X線分光法によって測定でき、サンプル内の元素の量を識別および測定し、その分布をマッピングするために使用できます。

非常に細い電子ビームにより、SEM顕微鏡写真は被写界深度が深く、特徴的な3次元画像が得られ、サンプルの表面構造を理解するのに役立ちます。^{[15]これは、上に示した花粉の顕微鏡写真で例示されています。約10倍（強力な手持ちレンズとほぼ同等）から、最高の}光学顕微鏡の倍率限界の約250倍にあたる500,000倍以上まで、幅広い倍率が可能です。

SEM サンプルは、試料台に収まる程度の大きさでなければならず、高真空状態や高エネルギー電子ビームに耐えられるように、電気伝導性を高めて安定化させるための特別な準備が必要になる場合があります。サンプルは通常、導電性接着剤を使用して試料ホルダーまたはスタブにしっかりと固定されます。SEM は半導体ウェーハの欠陥分析に広く使用されており、メーカーは 300 mm の半導体ウェーハのどの部分でも検査できる装置を製造しています。多くの装置には、そのサイズの物体を 45 度傾け、360 度連続回転できるチャンバーが備わっています。^[要出典]

非導電性の試料は、電子ビームでスキャンされると電荷を集め、特に二次電子イメージングモードでは、スキャン障害やその他の画像アーティファクトの原因となります。 SEM での従来のイメージングでは、試料は少なくとも表面が導電性で、静電気の蓄積を防ぐために電気的に接地されている必要があります。 金属物体は、洗浄と試料スタブへの導電マウントを除いて、SEM 用の特別な準備はほとんど必要ありません。 非導電性材料は通常、低真空スパッタコーティング、無電解メッキ^[要出典]、または高真空蒸着によって試料上に堆積された導電性材料の極薄コーティングでコーティングされます。 試料コーティングに現在使用されている導電性材料には、金、金/パラジウム合金、白金、イリジウム、タングステン、クロム、オスミウム^[14]、グラファイトなどがあります。 重金属でコーティングすると、原子番号 (Z) の低い試料の信号/雑音比が向上する場合があります。この改善は、高 Z 材料の二次電子放出が強化されることによって生じます。^{[引用が必要]}

いくつかの生物学的サンプルに対するコーティングの代替法としては、OTO染色法（O-四酸化オスミウム、T-チオカルボヒドラジド、O-オスミウム）の変種を使用してオスミウムを含浸させることにより、材料のバルク導電性を高める方法がある。^{[16] [17]}

非導電性の試料は、環境 SEM (ESEM) または低電圧モードの SEM 操作を使用して、コーティングなしで画像化できます。ESEM 機器では、試料は比較的高圧のチャンバー内に配置され、電子光学カラムは差動ポンプで電子銃の真空を十分に低く保ちます^{[明確化が必要]}。ESEM 内のサンプル周囲の高圧領域は電荷を中和し、二次電子信号を増幅します。^{[引用が必要]}低電圧 SEM は通常、低い加速電位でも高い一次電子輝度と小さなスポットサイズを生成できる電界放出銃(FEG) を備えた機器で実行されます。非導電性の試料の帯電を防ぐには、入射ビーム電流が出射する二次電子電流と後方散乱電子電流の合計に等しくなるように操作条件を調整する必要があります。この条件は、加速電圧 0.3～4 kV で最もよく満たされます。^{[引用が必要]}

樹脂に埋め込み、さらに研磨して鏡のような仕上がりにすることで、後方散乱電子でイメージングする場合や定量的 X 線マイクロ分析を行う場合に、生物試料と材料試料の両方に使用できます。

以下に概説する環境 SEM では主な準備技術は必要ありませんが、一部の生物標本では固定が効果的です。

従来、SEM標本は、標本室が高真空下にあるため、完全に乾燥している必要があります。木材、骨、羽毛、乾燥した昆虫、または殻（卵殻を含む^[18]）などの硬くて乾燥した材料は、ほとんど処理せずに検査できますが、生きた細胞や組織、および軟体生物全体は、その構造を保存および安定化するために 化学固定が必要です。

固定は通常、グルタルアルデヒドなどの緩衝化学固定液中での培養によって行われますが、ホルムアルデヒド^{[19] [20] [21]}や他の固定液^[22]と組み合わせて使用​​されることもあります。その後、必要に応じて四酸化オスミウムで後固定します。^[19]固定された組織は次に脱水されます。空気乾燥は組織を崩壊させたり収縮させたりするため、一般的には細胞内の水分をエタノールやアセトンなどの有機溶媒に置き換え、次にこれらの溶媒を臨界点乾燥によって液体二酸化炭素などの遷移流体に置き換えます。^[23]二酸化炭素は最終的に超臨界状態で除去されるため、乾燥中にサンプル内に気体と液体の界面は存在しません。

乾燥した標本は通常、エポキシ樹脂や導電性両面粘着テープなどの接着剤を使用して標本スタブに取り付けられ、顕微鏡で検査する前に金または金/パラジウム合金でスパッタコーティングされます。生物の内部超微細構造に関する情報を画像化するために露出する必要がある場合は、サンプルを切片化（ミクロトームを使用） することもあります。

SEMにクライオ顕微鏡用のコールドステージが装備されている場合は、クライオ固定法を使用して、低温で固定された標本に対して低温走査型電子顕微鏡検査を行うことができます。^[19]クライオ固定された標本は、内部構造を明らかにするために特殊な装置で真空下でクライオフラクチャリングされ、スパッタコーティングされて、凍結したままSEMクライオステージに移されます。^{[24]低温走査型電子顕微鏡（LT-SEM）は、氷[25] [26]や脂肪[27]}などの温度に敏感な材料の画像化にも適用できます。

フリーズフラクチャリング、フリーズエッチング、またはフリーズアンドブレークは、脂質膜とそこに組み込まれたタンパク質を「正面」から調べるのに特に役立つ準備方法です。この準備方法により、脂質二重層に埋め込まれたタンパク質が明らかになります。

試料の後方散乱電子イメージング、定量的 X 線分析、および X 線マッピングでは、表面を非常に滑らかな表面になるまで研削および研磨することがしばしば必要になります。WDSまたはEDS分析を受ける試料は、多くの場合カーボン コーティングされています。一般に、金属は導電性があり、接地への独自の経路を提供するため、SEM でイメージングする前にコーティングされません。フラクトグラフィは、光学顕微鏡または一般的には SEM で実行できる破面の調査です。破面は適切なサイズに切断され、有機残留物がすべて除去され、SEM で観察できるように試料ホルダーに取り付けられます。集積回路は、SEMで観察できるように、集束イオン ビーム(FIB) またはその他のイオン ビームミリング装置で切断される場合があります。前者の場合、SEM は FIB に組み込むことができ、プロセスの結果を高解像度でイメージングできます。金属、地質学的試料、および集積回路はすべて、SEM で観察できるように化学的に研磨することもできます。無機薄膜の高倍率画像化には、特殊な高解像度コーティング技術が必要です。

典型的なSEMでは、タングステンフィラメントカソードを備えた電子銃から電子ビームが熱電子放出される。タングステンは、すべての金属の中で最も融点が高く、蒸気圧が最も低いため、電気的に加熱して電子を放出することができ、コストも低いため、熱電子銃でよく使用される。その他のタイプの電子放出源には、六ホウ化ランタン（LaB
₆) カソードは、真空システムをアップグレードすれば標準的なタングステンフィラメント SEM で使用できます。また、電界放出銃 (FEG) には、タングステン単結晶エミッターを使用する冷陰極タイプや、酸化ジルコニウムでコーティングされたタングステン単結晶のエミッターを使用する熱アシストショットキータイプがあります。

電子ビームのエネルギー範囲は通常 0.2 keV～ 40 keV で、1 つまたは 2 つのコンデンサー レンズによって直径約 0.4 nm ～ 5 nm のスポットに集束されます。ビームは、通常は最終レンズにある電子カラム内の一対の走査コイルまたは一対の偏向板を通過し、ビームをx軸とy軸に偏向させて、サンプル表面の長方形領域を ラスター方式でスキャンします。

一次電子ビームがサンプルと相互作用すると、電子は、相互作用体積と呼ばれるサンプルの涙滴型の体積内でランダムな散乱と吸収を繰り返すことによってエネルギーを失います。相互作用体積は、表面の 100 nm 未満から約 5 μm まで広がります。相互作用体積のサイズは、電子の着地エネルギー、サンプルの原子番号、およびサンプルの密度によって異なります。電子ビームとサンプル間のエネルギー交換の結果、弾性散乱による高エネルギー電子の反射、非弾性散乱による二次電子の放出、および電磁放射線の放出が発生します。これらはそれぞれ、専用の検出器で検出できます。サンプルによって吸収されたビーム電流も検出でき、サンプル電流の分布の画像を作成するために使用できます。さまざまな種類の電子増幅器を使用して信号を増幅し、コンピューターのモニター (または、ビンテージ モデルの場合はブラウン管)に明るさの変化として表示します。コンピュータのビデオ メモリの各ピクセルは、顕微鏡の標本上のビームの位置と同期されるため、結果として得られる画像は、標本のスキャン領域から放出される信号の強度の分布マップになります。古い顕微鏡はフィルムに画像をキャプチャしていましたが、最近の機器のほとんどはデジタル画像を収集します。

SEM の倍率は、約 10 倍から 3,000,000 倍まで、約 6桁の範囲で制御できます。 ^{[28]光学顕微鏡や透過型電子顕微鏡とは異なり、SEM の画像倍率は}対物レンズのパワーの関数ではありません。SEMにはコンデンサーレンズと対物レンズがありますが、それらの機能はビームを一点に焦点を合わせることであり、試料を画像化することではないのです。電子銃が十分に小さい直径のビームを生成できれば、SEM は原理的にはコンデンサーレンズや対物レンズなしで完全に機能します。ただし、汎用性が高くなかったり、非常に高い解像度を達成できない可能性があります。走査型プローブ顕微鏡と同様に、SEM では、倍率は表示装置上のラスターと試料上のラスターの寸法の比率によって決まります。表示画面のサイズが固定されていると仮定すると、試料上のラスターのサイズを小さくすると倍率が高くなり、その逆も同様です。したがって、倍率は対物レンズのパワーではなく、x、y スキャンコイルに供給される電流、または x、y 偏向板に供給される電圧によって制御されます。

最も一般的なイメージング モードは、ビーム電子との非弾性散乱相互作用によって試料原子の伝導帯または価電子帯から放出される低エネルギー (<50 eV) の二次電子を収集します。これらの電子はエネルギーが低いため、試料表面から数ナノメートル以内で発生します。 ^{[15]電子は、コレクター}シンチレーター 光電子増倍管システムの一種であるEverhart–Thornley 検出器^[29]によって検出されます。二次電子は、まず約 +400 V で電気的にバイアスされたグリッドに向かって引き寄せられて収集され、次に約 +2,000 V に正にバイアスされた蛍光体またはシンチレーターに向かってさらに加速されます。加速された二次電子は、シンチレーターから光のフラッシュ (カソードルミネッセンス) を放出するのに十分なエネルギーを持ち、このフラッシュはライト パイプと試料室の壁にある窓を介して SEM カラムの外側にある光電子増倍管に伝導されます。光電子増倍管によって増幅された電気信号出力は、2 次元の強度分布として表示され、アナログビデオディスプレイで表示および撮影したり、アナログからデジタルへの変換を行ってデジタル画像として表示および保存したりできます。このプロセスは、ラスター スキャンされた一次ビームに依存します。信号の明るさは、検出器に到達する二次電子の数によって異なります。ビームがサンプルの表面に対して垂直に入射すると、活性化領域はビームの軸を中心に均一になり、一定数の電子がサンプル内から「逃げ」ます。入射角が増加すると、相互作用ボリュームが増加し、ビームの片側の「逃げ」距離が短くなるため、サンプルから放出される二次電子が増えます。したがって、急勾配の表面とエッジは平坦な表面よりも明るくなる傾向があり、その結果、明確に定義された 3 次元の外観を持つ画像が得られます。二次電子信号を使用すると、0.5 nm 未満の 画像解像度が可能になります。

後方散乱電子 (BSE) は、電子ビームから発生する高エネルギー電子で構成され、試料原子との弾性散乱相互作用によって試料相互作用体積から反射または後方散乱されます。重元素 (原子番号が高い) は軽元素 (原子番号が低い) よりも電子を強く後方散乱し、画像ではより明るく見えるため、BSE は異なる化学組成を持つ領域間のコントラストを検出するために使用されます。^[15]通常、試料の片側に配置される Everhart-Thornley 検出器は、検出器によって規定される立体角で放出される電子がほとんどなく、正にバイアスされた検出グリッドは高エネルギー BSE を引き付ける能力がほとんどないため、後方散乱電子の検出には効率的ではありません。専用の後方散乱電子検出器は、電子ビームと同心円状の「ドーナツ」型配置でサンプル上に配置され、収集の立体角を最大化します。BSE 検出器は通常、シンチレーターまたは半導体タイプのいずれかです。検出器のすべての部品を使用してビームに対して対称的に電子を収集すると、原子番号のコントラストが生成されます。ただし、非対称の方向性 BSE 検出器を使用して試料の片側から後方散乱電子を収集すると、強い地形コントラストが生成されます。その結果生じるコントラストは、その側からの地形の照明として表示されます。半導体検出器は、生成されるコントラストの種類とその方向性を制御するために、オン/オフを切り替えることができる放射状のセグメントで作成できます。

後方散乱電子は、試料の結晶構造を決定するために使用できる 電子後方散乱回折(EBSD) 画像を形成するためにも使用できます。

SEM のプローブである高エネルギー電子の性質により、SEM は半導体材料の光学的および電子的特性を調べるのに特に適しています。SEM ビームからの高エネルギー電子は半導体に電荷キャリアを注入します。したがって、ビーム電子は価電子帯から伝導帯に電子を押し出すことでエネルギーを失い、正孔を残します。

直接バンドギャップ材料では、これらの電子正孔対の再結合により陰極ルミネッセンスが発生します。サンプルにpn 接合部に存在するような内部電界が含まれている場合、SEM ビームによるキャリアの注入により電子ビーム誘導電流(EBIC) が流れます。陰極ルミネッセンスと EBIC は「ビーム注入」技術と呼ばれ、特にナノスケールの特徴や欠陥を研究するための、半導体の光電子的動作を調べるための非常に強力なプローブです。

カソードルミネッセンスは、高エネルギー電子によって励起された原子が基底状態に戻るときに放出される光で、紫外線誘起蛍光に類似しており、硫化亜鉛や一部の蛍光染料などの一部の物質は両方の現象を示します。過去数十年にわたり、カソードルミネッセンスは、テレビやコンピューターの CRT モニターのブラウン管の内面からの発光として最も一般的に見られてきました。SEM では、CL 検出器が試料から放出されるすべての光を収集するか、試料から放出される波長を分析して、試料から放出されるカソードルミネッセンスの分布の 発光スペクトルまたは画像を実際の色で表示します。

電子とサンプルの相互作用によって生成される特性 X 線は、エネルギー分散型 X 線分光法または波長分散型 X 線分光法を備えた SEM でも検出できます。X 線信号の分析を使用して、サンプル内の元素の分布をマッピングし、存在量を推定できます。

SEM はカメラではなく、検出器はCCDアレイやフィルムのように連続的に画像を形成しません。光学システムとは異なり、解像度は回折限界、レンズやミラーの細かさ、検出器アレイの解像度によって制限されません。集束光学系は大きくて粗い場合があり、SE 検出器は拳大で電流を検出するだけです。代わりに、SEM の空間解像度は電子スポットのサイズに依存し、電子スポットのサイズは電子の波長と走査ビームを生成する電子光学系の両方に依存します。解像度は相互作用体積のサイズ、つまり電子ビームと相互作用する試料材料の体積によっても制限されます。スポットサイズと相互作用体積はどちらも原子間の距離に比べて大きいため、SEM の解像度は透過型電子顕微鏡(TEM) で可能なように個々の原子を画像化できるほど高くはありません。ただし、SEM には、試料の比較的広い領域を画像化する機能、バルク材料 (薄膜や箔だけでなく) を画像化する機能など、それを補う利点があります。試料の組成や特性を測定するために利用できる分析モードの多様性。機器に応じて、解像度は1nm未満から20nmの範囲になります。2009年現在、世界最高の解像度の従来型（≤30kV）SEMは、二次電子検出器を使用して0.4nmの点解像度に到達できます。^[30]

従来のSEMでは、ガス雰囲気が急速に広がり電子線を減衰させるため、サンプルを真空下で撮影する必要がある。その結果、湿った生物学的サンプルや石油含有岩石など、大量の蒸気を生成するサンプルは、乾燥するか極低温で凍結する必要がある。接着剤の乾燥や合金の溶融、液体輸送、化学反応、固体-空気-ガス系などの相転移を伴うプロセスは、一般に従来の高真空SEMでは観察できない。環境SEM（ESEM）では、チャンバー内の空気は排気されるが、水蒸気は飽和圧力付近に保持され、残留圧力は比較的高いままである。これにより、水やその他の揮発性物質を含むサンプルの分析が可能になる。ESEMでは、生きた昆虫の観察が可能になった。^[31]

1980年代後半に初めてESEMが商業的に開発されたことで^{[32] [33]}、低圧ガス環境（例えば1～50 Torrまたは0.1～6.7 kPa）と高相対湿度（最大100%）でサンプルを観察することが可能になった。これは、水蒸気の存在下で動作可能な二次電子検出器^{[34] [35]}の開発と、電子ビームの経路に差動ポンプを備えた圧力制限アパーチャを使用して真空領域（銃とレンズの周囲）をサンプルチャンバーから分離することで可能になった。最初の商業用ESEMは、1988年に米国のエレクトロスキャン社によって製造された。エレクトロスキャン社は1996年にフィリップス社（後に電子光学部門をFEI社に売却）に買収された。^[36]

ESEM は、炭素や金でコーティングする必要がないため、非金属および生物材料に特に有用である。コーティングされていないプラスチックやエラストマーは、コーティングされていない生物サンプルと同様に、日常的に検査することができる。コーティングは元に戻すのが難しく、サンプル表面の小さな特徴を隠してしまう可能性があり、得られた結果の価値を低下させる可能性があるため、これは有用である。重金属のコーティングでは X 線分析が困難であるため、従来の SEM では炭素コーティングが日常的に使用されているが、ESEM ではコーティングされていない非導電性のサンプルに対して X 線マイクロ分析を実行することができる。ただし、X 線分析では ESEM に特有のアーティファクトがいくつか導入される。ESEM は、刑事訴訟または民事訴訟からのユニークなサンプルの電子顕微鏡検査に適している可能性があり、法医学的分析を複数の異なる専門家が繰り返す必要がある場合がある。ESEM または他の液相電子顕微鏡法を使用して、液体中のサンプルを研究することができる。^[37]

SEMは、薄い試料片の下に適切な検出器を組み込むだけで透過モードで使用することもできます。^[38]検出器には、明視野用、暗視野用、および中視野から高角度の環状暗視野用のセグメント化された検出器があります。機器の違いにもかかわらず、この技術は依然として走査透過電子顕微鏡（STEM）と呼ばれています。

SEM は、法医学において、珪藻類や銃弾の残渣などの微細なものを拡大分析するためによく使用されます。SEM はサンプルに対して非破壊的な力であるため、サンプルを損傷することなく証拠を分析するために使用できます。SEM はサンプルに高エネルギー電子ビームを照射しますが、サンプルはサンプルを変えたり破壊したりすることなく跳ね返ります。これは珪藻類の分析に最適です。人が溺死すると、水を吸い込むため、水中の物質 (珪藻類) が血流、脳、腎臓などに入ります。体内のこれらの珪藻類を SEM で拡大して珪藻類の種類を特定することができ、人がどこでどのように死亡したかを理解する上で役立ちます。SEM によって生成された画像を使用することで、法医学者は珪藻類の種類を比較して、人が死亡した水域を確認することができます。^[39]

銃弾残留物（GSR）分析はさまざまな分析機器で行うことができますが^[40]、SEMは、後方散乱電子検出器、二次電子検出器、X線検出器の3つの検出器を使用して元素の種類（主に金属）を詳細に分析できるため、無機化合物を分析する一般的な方法です。GSRは犯罪現場、被害者、または銃撃者から収集され、SEMで分析されます。これにより、科学者は発射された銃器との近接性や接触を判断することができます。^[40]

電子顕微鏡は、SEM がピクセルごとに単一の値を生成するため、自然にカラー画像を生成しません。この値は、ビームが (x, y) ピクセル位置に向けられているときに、スキャンの短い時間内に検出器が受信した電子の数に対応します。

この単一の数値は通常、各ピクセルごとにグレーレベルで表され、モノクロ画像を形成します。^[41]しかし、カラー電子顕微鏡画像を取得するためにいくつかの方法が使用されてきました。^[42]

• 平面の組成画像（通常は BSE）の場合：

色を得る最も簡単な方法は、カラールックアップテーブルを使用して、この単一の数字に任意の色を関連付けることです（つまり、各グレーレベルを選択した色に置き換えます）。この方法は擬似色として知られています。BSE画像では、サンプルのさまざまな相をよりよく区別するために擬似色を実行することができます。^[43]

• テクスチャ表面画像の場合:

各グレー レベルを単に色に置き換える代わりに、斜めビームで観察されたサンプルを使用して、研究者は近似トポグラフィー画像を作成できます (「単一の SEM 画像からのフォトメトリック 3D レンダリング」のセクションを参照)。その後、このようなトポグラフィーを 3D レンダリング アルゴリズムで処理して、表面テクスチャをより自然にレンダリングできます。

• 
  腎臓結石の表面
• 
  推定地形から色を再処理した後も同様
• 
  続成作用を受けたディスコースターのSEM画像
• 
  同様の色付け後の同じ画像

公開されているSEM画像には人工的に色が付けられていることが多い。^[43]これは美的効果のため、構造を明確にするため、またはサンプルにリアルな外観を加えるために行われることがあり、通常は標本に関する情報を追加するものではない。^[44]

着色は、写真編集ソフトウェアを使用して手動で行うことも、特徴検出やオブジェクト指向セグメンテーションを使用する専用ソフトウェアを使用して半自動的に行うこともできます。^[45]

• 
  コバエア・スカンデンス花粉のSEM画像
• 
  半自動着色後も同様。任意の色は構造のさまざまな要素を識別するのに役立ちます
• 
  ムラサキツユクサの花粉と雄しべのカラーSEM画像
• 
  自然金と硫化ヒ鉄鉱の結晶の共生のカラーSEM画像

いくつかの構成では、複数の検出器を使用することで、ピクセルごとにより多くの情報が収集されます。^[46]

一般的な例としては、二次電子検出器と後方散乱電子検出器を重ね合わせ、各検出器で撮影した画像に色を割り当て、^{[47] [48]}結果として、色が成分の密度に関連付けられた合成カラー画像が得られる。この方法は、密度依存カラーSEM（DDC-SEM）として知られている。DDC-SEMによって生成された顕微鏡写真は、二次電子検出器によってよりよく捕捉される地形情報を保持し、それを後方散乱電子検出器によって得られた密度に関する情報と組み合わせる。^{[49] [50]}

• 
  心臓組織中の石灰化粒子の DDC-SEM - 信号 1: SE
• 
  シグナル2: BSE
• 
  前の 2 つの画像から得られたカラー画像。心臓血管石灰化の密度依存カラー走査型電子顕微鏡 (DDC-SEM) 画像。オレンジ色はリン酸カルシウム球状粒子 (密度の高い物質)、緑色は細胞外マトリックス (密度の低い物質) を示しています。
• 
  同じ研究をより広い視野で捉えたもので、人間の心血管組織の石灰化に関する研究の一部である。

試料から放出される光子のエネルギーを測定することは、分析能力を得るための一般的な方法です。例としては、元素分析で使用されるエネルギー分散型 X 線分光法(EDS) 検出器や、 (たとえば) 地質学的試料の電子誘起発光の強度とスペクトルを分析するカソードルミネッセンス顕微鏡(CL) システムがあります。これらの検出器を使用する SEM システムでは、これらの追加信号を色分けして単一のカラー画像に重ね合わせるのがよく行われ、試料のさまざまな成分の分布の違いをはっきりと確認して比較することができます。オプションで、標準の二次電子画像を 1 つ以上の構成チャネルと結合して、試料の構造と構成を比較することもできます。このような画像は、元の信号データの完全な整合性を維持しながら作成することができ、いかなる変更も行われません。

SEM はSPMとは異なり、本来 3D 画像を提供するものではありません。ただし、次のようにさまざまな方法で SEM を使用して 3D データを取得することができます。

• 写真測量は、 SEM 画像に 3 次元をもたらす最も計測学的に正確な方法です。^[43]測光法 (次の段落) とは異なり、写真測量は三角測量法を使用して絶対高さを計算します。欠点は、最小限のテクスチャがある場合にのみ機能することと、2 つの異なる角度から 2 つの画像を取得する必要があるため、傾斜ステージを使用する必要があることです。 (写真測量は、同じペアの左の画像と右の画像間の各ピクセルのシフト (または「視差」) を計算するソフトウェア操作です。このような視差は、ローカルの高さを反映しています)。

• 
  縦軸に沿って傾斜させて作成された、大きさ 1 mm 未満の微化石(オストラコーダ)の SEM ステレオペア。
• 
  この 2 つの SEM 画像から、写真測量法 ( MountainsSEMソフトウェアを使用、次の画像を参照) によって 3 次元が再構築され、さまざまな角度の一連の 3D 表現が作成され、GIF ファイルに組み立てられてこのアニメーションが作成されました。
• 
  15°傾斜した2枚の走査型電子顕微鏡画像から得られた、 （Ra = 3μm）粗さ校正サンプル（プロファイロメータの校正に使用）の3D表面再構成（左上）。3Dモデルの計算には約1.5秒かかり^[51]、計算されたRa粗さ値の誤差は0.5％未満です。

この方法では、通常、4象限BSE検出器（メーカーによっては3セグメント検出器）を使用します。顕微鏡は、同じ標本の4つの画像を同時に生成するため、サンプルを傾ける必要はありません。この方法では、標本の傾斜が妥当である限り、計測学的な3D寸法が得られます。^[43]現在（2018年）、ほとんどのSEMメーカーは、このような組み込みまたはオプションの4象限BSE検出器と、リアルタイムで3D画像を計算する独自のソフトウェアを提供しています。^[52]

他のアプローチでは、最適推定アルゴリズムのようなより洗練された（そして時にはGPUを集中的に使用する）方法を使用し、計算能力への高い要求を犠牲にしてはるかに優れた結果を提供します^[53]。

いずれの場合も、このアプローチは傾斜の積分によって機能するため、垂直傾斜と張り出しは無視されます。たとえば、球全体が平面上にある場合、上半球よりもわずかに多くが平面から出ているように見えるため、球の頂点の高度が間違っています。この効果の顕著さは、サンプルに対する BSE 検出器の角度によって異なりますが、これらの検出器は通常、電子ビームの周囲 (および近く) に配置されているため、この効果は非常に一般的です。

この方法では、斜めの低角度照明で撮影したSEM画像が必要です。グレーレベルは傾斜として解釈され、傾斜を積分して標本の地形を復元します。この方法は視覚的な強化や物体の形状と位置の検出に興味深いものですが、写真測量法などの他の方法とは異なり、垂直の高さは通常校正できません。^[43]

• 
  イエバエの複眼表面の 450 倍の SEM 画像。
• 
  前の画像の詳細。
• 
  シェーディングアルゴリズムからの形状を使用した、以前の SEM 3D 再構築。
• 
  前と同じですが、シェーディング アルゴリズムから形状を適用する前に照明が均一化されます。

• 電子-物質相互作用モデルを用いた逆再構成^{[54] [55]}
• 単一の 2D ファイルを使用したマルチ解像度再構成: 高品質の 3D 画像は、あらゆる多孔質媒体の複雑さを明らかにするための究極のソリューションかもしれませんが、その取得にはコストと時間がかかります。一方、高品質の 2D SEM 画像は広く利用可能です。最近、2D 画像を直接使用して 3D モデルを作成する、新しい 3 段階のマルチスケール、マルチ解像度再構成法が発表されました。シャノンエントロピーと条件付きシミュレーションに基づくこの方法は、利用可能なほとんどの静止材料に使用でき、いくつかの薄いセクションを使用するだけでさまざまな確率的 3D モデルを構築できます。^{[56] [57] [58]}
• イオンアブレーションSEM（IA-SEM）は、ガリウムの集束ビームを使用して試料表面を20ナノメートルずつ繰り返し研磨するナノスケール3Dイメージング法です。露出した各表面をスキャンして3D画像を作成します。 ^{[59] [60]}

考えられる応用例の 1 つは、氷結晶の粗さを測定することです。この方法では、可変圧力環境 SEM と SEM の 3D 機能を組み合わせて、個々の氷結晶面の粗さを測定し、それをコンピューター モデルに変換し、モデルに対してさらに統計分析を実行できます。^[61] その他の測定には、フラクタル次元、金属の破面の検査、材料の特性評価、腐食測定、ナノ スケールでの寸法測定 (段差の高さ、体積、角度、平坦度、支持比、共平面性など) などがあります。^[要出典]

SEMは美術品保存家によって、亜鉛イオンと脂肪酸の複合体の形成など、経年変化による絵画の表面安定性への脅威を識別するためにも使用されています。^[62]法医学者はSEMを使用して美術品の贋作を検出します。

以下はSEMを使用して撮影した画像の例です。

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  大豆シスト線虫と卵の着色 SEM 画像。人工着色により、専門家以外の人でも顕微鏡写真で明らかになった構造と表面を観察し、理解しやすくなっています。
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  南極オキアミ Euphausia superbaの複眼。節足動物の眼は、SEM 画像が捉えられる焦点深度のため、SEM 顕微鏡写真の一般的な被写体です。カラー写真。
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  南極オキアミの眼の個眼、オキアミの眼の高倍率画像。SEM は、光学顕微鏡からTEMで可能な倍率までの範囲をカバーします。カラー画像。
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  正常な循環血液の SEM 画像。これは、SEM 顕微鏡写真の一般的な対象である赤血球の、古くてノイズの多い顕微鏡写真です。
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  ミシガン州デボン紀のヘデレロイドの SEM 画像(最大管径は 0.75 mm)。SEM は、ミクロおよびマクロの化石の詳細な画像を撮影するために広く使用されています。
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  古代ガラスの破片のアンチモンが豊富な領域の後方散乱電子 (BSE) 画像。博物館では、貴重な遺物を非破壊的に研究するために SEM を使用しています。
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  古代のガラス片の表面の腐食層の SEM 画像。腐食層の層状構造に注目してください。
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  電界放出SEM で撮影した半導体製造で使用されるフォトレジスト層の SEM 画像。これらの SEM は高解像度の機能を備えているため、半導体業界では重要です。
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  腎臓結石の表面の SEM 画像。結石の非晶質中心部からウェッデライト(シュウ酸カルシウム二水和物)の正方晶が出現している様子がわかります。画像の横の長さは、元の図の 0.5 mm を表します。
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  同じ深さの霜の雪の結晶を光学顕微鏡で見た画像 (左) と SEM 画像 (右)。光学顕微鏡画像では完全に判別しにくい微細構造の詳細を SEM 画像で明確に認識できることに注目してください。
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  タマネギの薄片の内側表面の表皮細胞。シャグリーンのような細胞壁の下には、細胞質に浮かぶ核と小さな細胞小器官が見えます。ランタノイド染色したサンプルのこの BSE 画像は、事前の固定、脱水、スパッタリングなしで撮影されました。
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  葉の下側にある気孔の SEM 画像。

一般的な

• HowStuffWorks – 走査型電子顕微鏡の仕組み
• SEM の使い方を学ぶ – SEM を使いたい人のためのオンライン学習環境。Microscopy Australia 提供
• バーチャル SEM – sparkler – 走査型電子顕微鏡 (SEM) のインタラクティブ シミュレーション
• マルチチャンネルカラーSEMイメージング – BSE付き
• 走査型電子顕微鏡に関するビデオ、カールスルーエ専門大学
• 電子顕微鏡を含む各種顕微鏡のアニメーションと解説（パリ南大学）

歴史

• 環境走査型電子顕微鏡（ESEM）の歴史

画像

• Rippel 電子顕微鏡施設、Wayback Machineに 2007 年 3 月 19 日にアーカイブ。ダートマス大学からの多数の (主に生物学的) SEM 画像。
• モスクワ眼疾患研究所のランタノイド染色 SEM 画像。