電子顕微鏡

電子顕微鏡は、電子ビームを光源として使用する顕微鏡です。電子ビームを制御するために光学顕微鏡のガラスレンズに類似した電子光学系を使用し、たとえば、電子ビームを焦点に当てて拡大画像や電子回折パターンを生成します。電子の波長は可視光の100,000分の1まで小さいため、電子顕微鏡の解像度は約0.1 nmと、光学顕微鏡の約200 nmに比べてはるかに高くなります。^[1]電子顕微鏡は以下を指す場合があります。

• 透過型電子顕微鏡（TEM）では、高速電子が薄いサンプルを通過する。
• 走査型透過電子顕微鏡（STEM）は、走査型電子プローブを備えたTEMに似ています。
• 走査型電子顕微鏡（SEM）はSTEMに似ていますが、厚いサンプルを使用します。
• SEM に似ていますが、化学分析に向いている電子マイクロプローブです。
• 超高速走査電子顕微鏡、非常に高速に動作できるSEMのバージョン
• 表面を画像化するために使用される低エネルギー電子顕微鏡（LEEM）
• 光電子顕微鏡（PEEM）は、光子によって表面から放出された電子を使用するLEEMに似ています。

詳細は上記のリンクをご覧ください。この記事には、主に透過型電子顕微鏡に関する一般的な情報が含まれています。

多くの開発が、顕微鏡で使用される電子光学の基礎を築きました。 ^[2]重要なステップの 1 つは、1883 年のヘルツの研究です。 ^[3]彼は静電偏向と磁気偏向を備えたブラウン管を作成し、電子ビームの方向を操作できることを実証しました。他の例としては、1899 年のエミール・ヴィーヘルトによる軸方向の磁場による電子の収束、^[4]アーサー・ウェーネルトによる1905 年の電子生成量を増やす酸化物コーティングされたカソードの改良^{[5] 、1926 年の}ハンス・ブッシュによる電磁レンズの開発などがあります。^[6]デニス・ガボールによると、物理学者のレオ・シラードは1928 年に、シラードが特許を申請していた電子顕微鏡を作るようガボールを説得しようとしました。^[7]

今日に至るまで、透過型電子顕微鏡を誰が発明したかという問題は議論の的となっている。^{[8] [9] [10] [11]} 1928年、シャルロッテンブルク工科大学（現在のベルリン工科大学）で、アドルフ・マティアス（高電圧技術および電気設備の教授）は、電子ビームと陰極線オシロスコープの研究を進める研究者チームのリーダーにマックス・ノールを任命した。チームはエルンスト・ルスカを含む数人の博士課程の学生で構成されていた。1931年、マックス・ノールとエルンスト・ルスカ^{[12] [13]}は、陽極開口部の上に配置されたメッシュグリッドの拡大画像を生成することに成功した。図に複製が示されているこの装置は、2つの磁気レンズを使用してより高い倍率を実現した、最初の電子顕微鏡であった。 (マックス・ノールは 1969 年に亡くなったため、電子顕微鏡の発明により 1986 年のノーベル賞を受賞しませんでした。)

明らかにこの努力とは独立して、シーメンス・シュッケルトでラインホルト・リューデンベルクが行った研究がある。特許法（米国特許番号2058914 ^[14]および2070318 ^[15] 、ともに1932年出願）によれば、彼は電子顕微鏡の発明者となっているが、彼が実際に動作する機器をいつ手に入れたのかは明らかではない。彼は1932年の非常に短い記事^[16]で、シーメンスは1932年に特許が出願される数年前からこれに取り組んでおり、彼の努力は大学の開発と並行していたと主張した。彼は1961年に亡くなったため、マックス・ノールと同様に1986年のノーベル賞の受賞資格はなかった。^[17]

翌年の1933年、ルスカとノールは光学顕微鏡の解像度を超える最初の電子顕微鏡を製作した。^[18] 4年後の1937年、シーメンスはエルンスト・ルスカとボド・フォン・ボリスの研究に資金を提供し、エルンストの兄弟であるヘルムート・ルスカを雇って顕微鏡の用途、特に生物学的標本の開発をさせた。^{[18] [19]}また1937年、マンフレート・フォン・アルデンヌは走査型電子顕微鏡の先駆者となった。^[20]シーメンスは1938年に最初の商用電子顕微鏡を生産した。 ^[21]北米初の電子顕微鏡は1930年代にワシントン州立大学でアンダーソンとフィッツシモンズ^{[22] 、}トロント大学 でイーライ・フランクリン・バートンと学生のセシル・ホール、ジェームズ・ヒリアー、アルバート・プレバスによって製作された。シーメンスは1939年に透過型電子顕微鏡（TEM）を製造しました。^[23]現在の透過型電子顕微鏡は200万倍の拡大が可能ですが、科学機器としては光学系が改善された以外は同様のものとなっています。

1940年代には、高解像度の電子顕微鏡が開発され、より高い倍率と解像度が可能になりました。^[24] 1965年までに、シカゴ大学のアルバート・クルーは、電界放出源を使用した走査透過型電子顕微鏡を発表し、^[25]高解像度の走査型顕微鏡を可能にしました。^[26] 1980年代初頭までに、機械的安定性の向上とより高い加速電圧の使用により、原子スケールでの材料の画像化が可能になりました。^{[27] [28]} 1980年代には、電界放出銃が電子顕微鏡で一般的になり、追加のコヒーレンスと低い色収差により画像品質が向上しました。 2000年代は、収差補正電子顕微鏡の進歩が特徴で、画像の解像度と鮮明さが大幅に向上しました。^{[29] [30]}

電子顕微鏡の原型である透過型電子顕微鏡(TEM) は、高電圧の 電子ビームを使用して試料を照射し、画像を作成します。電子ビームは電子銃によって生成され、電子のエネルギーは通常 20 ～ 400 keV の範囲で、電磁レンズによって集束され、試料を透過します。試料から放出された電子ビームは、顕微鏡のレンズによって拡大された試料の構造に関する情報を運びます。この情報 (「画像」) の空間的変化は、拡大された電子画像を検出器に投影することによって表示できます。たとえば、画像は、硫化亜鉛などの蛍光体またはシンチレータ材料でコーティングされた蛍光表示スクリーンを使用して、オペレータが直接表示できます。高解像度の蛍光体は、レンズ光学系または光ファイバー光ガイドによってデジタルカメラのセンサーに結合することもできます。直接電子検出器にはシンチレータがなく、電子ビームに直接さらされるため、シンチレータ結合カメラの制限の一部が解消されます。^[31]

TEMの解像度は主に球面収差によって制限されますが、新世代のハードウェア補正器は球面収差を低減し、高解像度透過型電子顕微鏡（HRTEM）の解像度を0.5オングストローム（50ピコメートル）未満に高めることができ、^[32] 5000万倍以上の拡大が可能になります。^[33]材料内の原子の位置を決定するHRTEMの能力は、ナノテクノロジーの研究開発に役立ちます。^[34]

STEMは、焦点を絞った入射プローブを試料全体に走査します。そのため、TEMの高解像度はSTEMで可能になります。STEMでは、電子が試料に当たる前に焦点を絞る動作（および収差）が発生しますが、TEMでは試料に当たる後に発生します。STEMはSEMのようなビーム走査を使用することで、環状暗視野イメージングやその他の分析技術を簡素化しますが、画像データが並列ではなく直列に取得されることも意味します。^[35]

SEM は、試料を走査する集束電子ビームで試料をプローブすることで画像を生成します (ラスタースキャン)。電子ビームが試料と相互作用すると、さまざまなメカニズムによってエネルギーが失われます。これらの相互作用により、低エネルギーの二次電子と高エネルギーの後方散乱電子の放出、発光 (カソードルミネッセンス)、またはX 線放出などのイベントが発生し、これらはすべて、試料表面の地形や組成などの特性に関する情報を運ぶ信号を提供します。SEM によって表示される画像は、信号が発生したときの試料上のビームの位置に対応する位置で、これらの信号の変化する強度を画像に表します。^[36]

SEMはTEMとは異なり、通常20keV以下のはるかに低いエネルギーの電子を使用します。 ^[37] TEMは通常80-300keVの範囲のエネルギーの電子を使用します。^[38]そのため、2つの顕微鏡の電子源と光学系は設計が異なり、通常は別々の機器です。^[39]

透過型電子顕微鏡は、電子回折モードで使用でき、サンプルから出た電子の角度のマップが作成されます。電子回折がX線結晶構造解析よりも優れている点は、主に結晶のサイズにあります。X線結晶構造解析では、結晶は肉眼で見えることが多く、長さは一般に数百マイクロメートルです。これに対して、電子回折用の結晶は厚さが数百ナノメートル未満でなければならず、サイズの下限はありません。さらに、電子回折はTEMで行われ、別の機器を必要とせずに、他の多くの種類の情報を取得するためにも使用できます。^{[40] [38]}

透過型電子顕微鏡で観察する材料は、適切なサンプルを作成するために処理が必要な場合があります。必要な技術は、標本と必要な分析によって異なります。

• 化学固定– 生物標本の場合、タンパク質をホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどのアルデヒドで、脂質を四酸化オスミウムで化学的に架橋することにより、標本の可動性高分子構造を安定化させることを目的とする。^[41]

• クライオ固定法– 標本を凍結して水がガラス質（非結晶質）の氷を形成する。これにより、標本は本来の状態のスナップショットで保存されます。このガラス化を実現する方法には、液体エタンでの急速凍結や高圧凍結などがあります。この技術からクライオ電子顕微鏡法と呼ばれる分野全体が派生しました。ガラス体切片のクライオ電子顕微鏡法（CEMOVIS） ^[42]とラメラのクライオ集束イオンビームミリング^[43]の開発により、現在では事実上あらゆる生物標本のサンプルをその本来の状態に近い状態で観察することが可能になっています。
• 脱水–水をエタノールやアセトンなどの有機溶媒に置き換え、臨界点乾燥または包埋樹脂による浸透を行う。凍結乾燥も参照。^[要出典]
• 生物標本の包埋- 脱水後、透過型電子顕微鏡で観察するための組織は包埋され、観察できるように切片にされる。これを行うには、組織をプロピレンオキシド（エポキシプロパン）やアセトンなどの「遷移溶媒」に通し、次にアラルダイト、エポン、デュルキュパンなどのエポキシ 樹脂を浸透させる。^[44]組織は水溶性アクリル樹脂に直接包埋することもできる。樹脂が重合（硬化）した後、サンプルは超薄切片法で切片にされ、染色される。^[要出典]
• 包埋、材料– 樹脂に包埋した後、標本は通常、超微細研磨剤を使用して鏡のような仕上がりになるまで研磨されます。^[要出典]
• フリーズフラクチャーまたはフリーズエッチングは、脂質膜とそこに組み込まれたタンパク質を「正面」から観察するのに特に有用な準備方法である^{[45] [46] [47] 。 [48] [49] [50]}

  

  

  新鮮な組織または細胞懸濁液を急速に凍結し（凍結固定）、液体窒素温度に保ったまま破砕する^[51]（またはミクロトームを使用）^[50]。次に、冷たい破砕面（氷を昇華させるために数分間温度を約 -100 °C に上げて「エッチング」することもある）^[50]を、高真空蒸発器で平均 45° の角度で蒸発させたプラチナまたは金で覆います。レプリカコーティングの安定性を向上させるために、平均表面平面に対して垂直に蒸発させた 2 回目の炭素コーティングが行われることがよくあります。標本を室温と室温に戻した後、酸、次亜塩素酸塩溶液、またはSDS洗剤で慎重に化学的に分解して、破砕面の非常に壊れやすい「事前に覆い隠された」金属レプリカをその下の生物学的材料から切り離します。まだ浮いているレプリカは、残留化学物質を完全に洗い流し、細かいグリッドに慎重に引き上げ、乾燥させてから TEM で観察します。^[要出典]
• フリーズフラクチャーレプリカ免疫金標識 (FRIL) – フリーズフラクチャー法は、免疫金標識によって骨折面の構成要素を識別できるように改良されました。顕微鏡で観察する前の最終ステップとして解凍したレプリカの下にある組織をすべて除去する代わりに、組織の厚さは骨折プロセス中または骨折プロセス後に最小限に抑えられます。組織の薄い層は金属レプリカに結合したままなので、選択した構造に対する抗体で免疫金標識することができます。金が付着したレプリカ上の元の標本の薄い層により、骨折面の構造を識別できます。^{[52]エッチングされた細胞の表面を標識する関連方法[53]}や、その他のレプリカ標識のバリエーションもあります。 ^[54]
• イオンビームミリング–斜めから表面にイオン（通常はアルゴン）を発射し、表面から材料をスパッタリングすることで、サンプルを電子が透過するまで薄くします。このサブクラスは集束イオンビームミリングで、ガリウムイオンを使用して、たとえばマイクロプロセッサ内のデバイスまたは集束イオンビームSEMを介して、サンプルの特定の領域に電子透過膜または「ラメラ」を生成します。イオンビームミリングは、機械研磨では準備が難しい材料の分析前の断面研磨にも使用できます。^[要出典]
• ネガティブ染色-ナノ粒子または微細な生物学的物質（ウイルスや細菌など）を含む懸濁液を、モリブデン酸アンモニウム、酢酸ウラニル（またはギ酸）、リンタングステン酸などの電子不透過性溶液の希釈溶液と短時間混合します。 ^[要出典]この混合物を EM グリッドに塗布し、フォームバーなどのプラスチックフィルムで事前にコーティングして拭き取り、乾燥させます。最良の結果を得るには、この調製物を TEM で観察する際は遅滞なく行う必要があります。この方法は、微生物学において迅速かつ大まかな形態学的識別を行うために重要ですが、サポートにカーボンフィルムを使用する場合は、EM トモグラフィー法を使用して高解像度の 3D 再構築の基礎としても使用できます。
• 切片作成– 電子に対して半透明な標本の薄片を作成する。これらは、ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用した超ミクロトームで超薄切片作製法を使用して切断され、約60〜90nmの厚さの超薄切片を作成することができる。使い捨てのガラスナイフも使用される。これは、研究室で作成でき、はるかに安価であるためである。切片は、集束イオンビームSEMでミリングすることによってその場で作成することもでき、その場合の切片はラメラと呼ばれる。^[43]
• 染色–鉛、ウラン、タングステンなどの重金属を使用して画像電子を散乱させ、さまざまな構造間のコントラストを与えます。これは、多くの（特に生物学的）材料が電子に対してほぼ「透明」であるためです（弱位相物体）。生物学では、標本は包埋前および切片化後に「一括」で染色できます。通常、薄い切片は、酢酸ウラニルの水溶液またはアルコール溶液で数分間染色され、その後クエン酸鉛水溶液で染色されます。 ^[55]

最も一般的な構成では、電子顕微鏡はピクセルごとに単一の輝度値を持つ画像を生成し、結果は通常グレースケールでレンダリングされます。^[56]しかし、多くの場合、これらの画像は特徴検出ソフトウェアを使用してカラー化されるか、グラフィックエディタを使用して手動で編集されます。これは構造を明確にするため、または美的効果のために行われることがあり、通常は標本に関する新しい情報を追加するものではありません。^[57]

電子顕微鏡は現在、より複雑なワークフローで頻繁に使用されており、各ワークフローでは通常、サンプルのより複雑で定量的な分析を可能にするために複数のテクノロジーが使用されています。以下にいくつかの例を示しますが、これは網羅的なリストではありません。ワークフローの選択は、解像度、体積、ターゲット分子の性質など、アプリケーションと対応する科学的質問の要件に大きく依存します。

例えば、サンプルの同じ領域を光学顕微鏡と電子顕微鏡で撮影した画像を重ね合わせることで、2 つのモダリティのデータを相関させることができます。これは、蛍光標識された構造に関する高解像度のコンテキスト EM 情報を提供するためによく使用されます。この相関光電子顕微鏡 ( CLEM ) ^[58]は、現在利用可能な一連の相関ワークフローの 1 つです。もう 1 つの例は高解像度質量分析 (イオン顕微鏡) で、これは細胞内の抗生物質の局在に関する相関情報を提供するために使用されてきました^[59]。このデータは他の方法では取得が困難です。

電子顕微鏡の当初の役割は、2次元スライス（TEM）または試料表面（二次電子を用いたSEM）を画像化することでしたが、サンプルの深部までその範囲が拡大してきました。^[60]これらの「ボリュームEM」ワークフローの初期の例は、サンプルを切断した連続切片のTEM画像を単純に積み重ねるものでした。次の開発は、異なる傾斜角度で撮影した一連の画像を逆投影することにより、厚い切片（200〜500 nm）のボリュームを仮想的に再構築すること、つまりTEMトモグラフィーでした。^[61]

TEM トモグラフィーよりも深い深さ (Z 軸でマイクロメートルまたはミリメートル) のボリューム EM データセットを取得するには、サンプルの深さを通して撮影された一連の画像を使用できます。たとえば、上記のように TEM で連続切片のリボンを画像化できますが、より厚い切片を使用する場合は、連続 TEM トモグラフィーを使用して z 解像度を上げることができます。最近では、シリコン ウェーハ上に収集されたより大きな一連の切片の後方散乱電子 (BSE) 画像を取得できるようになり、SEM アレイ トモグラフィーと呼ばれています。^{[62] [63]}別の方法として、各切片が除去された後、切片ではなくブロック表面を BSE SEM を使用して画像化する方法があります。この方法では、SEM チャンバー内に設置されたウルトラミクロトームによってワークフローの自動化を高めることができます。試料ブロックがチャンバーにロードされ、システムがサンプルを連続的に切断して画像化するようにプログラムされます。これは、シリアル ブロック フェイス SEM として知られています。^[64]関連する方法では、ウルトラミクロトームの代わりに集束イオン ビームミリングを使用して切片を除去します。これらの連続画像化法では、基本的に標本ブロックを通過する一連の画像が出力され、これをデジタル的に順番に整列させてボリュームEMデータセットに再構成することができます。これらの方法で利用できるボリュームの増加により、電子顕微鏡の能力が拡張され、脳内の神経接続のマッピング^{[60]や細胞小器官間の膜接触部位[65]}などの新しい質問に取り組むことができます。^[66]

電子顕微鏡は製造と維持に費用がかかります。高解像度を実現するように設計された顕微鏡は、磁場キャンセルシステムなどの特別な設備を備えた安定した建物（地下の場合もあります）に設置する必要があります。^[67]

空気を構成する分子が電子を散乱させるため、サンプルは主に真空中で観察する必要がある。例外は、密閉された液体セルまたは環境チャンバーを使用する液相電子顕微鏡法^[68]であり、たとえば環境走査型電子顕微鏡では、水和したサンプルを低圧（最大20  Torrまたは2.7 kPa）の湿った環境で観察することができる。気体サンプルのその場電子顕微鏡法のためのさまざまな技術が開発されている。^[69]

従来の高真空モードで動作する走査型電子顕微鏡は、通常、導電性の試料を画像化するため、非導電性の材料には導電性コーティング（金/パラジウム合金、炭素、オスミウムなど）が必要です。現代の顕微鏡の低電圧モードでは、コーティングなしで非導電性の試料を観察できます。非導電性の材料は、可変圧力（または環境）走査型電子顕微鏡でも画像化できます。^{[引用が必要]}

カーボンナノチューブ、珪藻の被殻、小さな鉱物結晶（アスベスト繊維など）などの小さく安定した標本は、電子顕微鏡で検査する前に特別な処理を必要としません。ほとんどすべての生物標本を含む水和物質のサンプルは、安定化、厚さの減少（超薄切片化）、電子光学コントラストの向上（染色）のために、さまざまな方法で準備する必要があります。これらのプロセスによりアーティファクトが発生する可能性がありますが、これらは通常、根本的に異なる標本準備方法を使用して得られた結果を比較することで識別できます。1980年代以降、凍結固定されたガラス化標本の分析も科学者によってますます使用されるようになり、この技術の有効性がさらに確認されました。^{[70] [71] [72]}

ウィキメディア・コモンズには、電子顕微鏡に関連するメディアがあります。

• 顕微鏡学入門 2013-07-19 アーカイブウェイバックマシン: 教師と生徒のためのリソース
• 細胞中心データベース – 電子顕微鏡データ
• 科学の助け：電子顕微鏡：Kaden Park著