回折限界システム

アッベ回折限界があるため、顕微鏡によるサブ波長構造の観察は困難です。エルンスト・アッベは1873 年の論文、466 ページで初めて回折限界について言及しました。「[…] die physikalische Unterscheidungsgrenze […] hängt allein vom Oeffnungswinkel ab und ist dem Sinus seines halben Betrages比例」、または「[…] 解像度の物理的限界は […] 開口角のみに依存し、その大きさの半分の正弦に比例します。」^{[ 2 ]}アッベは1882年の論文461ページでそれを数式の形で書きました。「与えられた開口部の届く範囲にある最小の寸法は、周期的または規則的な構造に対するその開口部の分解能または分離能力の限界、つまり、問題の開口部で与えられた要素を個別に描写できる最小距離を取ることによって十分な精度で示されます。その最小距離の数値表現は次のとおりです」^{[ 3 ]}

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2n\sin \theta }}={\frac {\lambda }{2\mathrm {NA} }}}$、

どこ${\displaystyle \lambda }$波長は、${\displaystyle n}$は媒質の屈折率であり、${\displaystyle \theta }$は光学系によって集束された光の半角である。同じ式は1874年にヘルマン・フォン・ヘルムホルツによって証明された。^{[ 4 ]}分母の部分${\displaystyle n\sin \theta }$は開口数（NA）と呼ばれ、現代の光学では約1.4～1.6に達するため、アッベ限界は${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2.8}}}$。

波長約500nmの緑色光 とNA1を考慮すると、アッベの限界はおおよそ${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2}}=250{\text{ nm}}}$（0.25 μm）は、ほとんどの生物細胞（1 μm～100 μm）に比べると小さいが、ウイルス（100  nm）、タンパク質（10  nm）、およびより単純な分子（1  nm）に比べると大きい。解像度を上げるには、UV顕微鏡やX線顕微鏡などのより短い波長を用いることができる。これらの技術はより高い解像度を提供するが、高価であり、生物試料のコントラストが不足し、試料を損傷する可能性があるという欠点がある。

デジタルカメラでは、回折効果が規則的なピクセルグリッドの効果と相互作用します。光学系のさまざまな部分の複合効果は、点像分布関数(PSF)の畳み込みによって決定されます。回折限界の円形開口レンズの点像分布関数は、単純にエアリーディスクです。カメラの点像分布関数、別名機器応答関数 (IRF) は、ピクセルピッチに等しい幅を持つ矩形関数で近似できます。イメージセンサーの変調伝達関数 (PSF から導出) のより完全な導出は、Fliegel によって与えられています。^{[ 5 ]}正確な機器応答関数が何であれ、それはレンズの f 値にほとんど依存しません。したがって、異なる f 値では、カメラは次の 3 つの異なるモードで動作する可能性があります。

1. IRFの広がりが回折PSFの広がりに比べて小さい場合、システムは本質的に回折限界であると言える（レンズ自体が回折限界である限り）。
2. 回折PSFの広がりがIRFに比べて小さい場合、システムは機器によって制限されます。
3. PSFとIRFの広がりが似ている場合、両方ともシステムの利用可能な解像度に影響を与えます。

回折限界PSFの広がりは、エアリーディスクの最初のヌルの直径によって近似される。

${\displaystyle d/2=1.22\lambda N,\,}$^{[ 6 ]}

どこ${\displaystyle \lambda }$は光の波長であり、${\displaystyle N}$は結像光学系のf値、すなわち、${\displaystyle 2\mathrm {NA} \rightarrow (2.44N)^{-1}}$アッベの回折限界式において。例えば、f/8 レンズの場合 (${\displaystyle N=8}$そして${\displaystyle \mathrm {NA} \約 2.5\%}$）そして青信号（${\displaystyle \lambda _{g}=}$0.5  μm 波長の光の場合、集光スポットの直径は d = 9.76  μm または 19.5になります。$\displaystyle \lambda _{g}}$これは、市販されているほとんどの「フルフレーム」（センサー対角43mm）カメラのピクセルサイズと似ているため、これらのカメラはf値が8前後で領域3で動作します（f値が8より小さい場合、回折限界に近いレンズはほとんどありません）。

センサーが小さいカメラはピクセルも小さくなる傾向がありますが、レンズはより小さな f 値で使用するように設計されており、レンズが回折限界に達する f 値では領域 3 で動作する可能性が高いです。同じ視野、ピクセル数、シャッター スピード、ショット ノイズSNR (つまり、ピクセルあたりに収集される光の量が同じ) の場合、同等の品質の小型センサーと大型センサーは同じデジタル 画像を生成します。回折と被写界深度の両方によるぼけの量も同じです。^{[ 7 ]}大型センサーには、レンズの最大入射瞳径が大きくなる傾向があるという利点があり、これにより、より広い範囲で被写界深度を犠牲にして、回折ぼけを減らし、より高い SNR またはより速いシャッター スピードを実現できます。^{[ 8 ]}

顕微鏡の実効解像度は、側面から照明を当てることで向上させることができる。

明視野顕微鏡や微分干渉コントラスト顕微鏡などの従来の顕微鏡では、コンデンサーを使用することでこれを実現します。空間的に非干渉的な条件下では、画像はコンデンサー上の各点から照明された画像の合成として理解され、それぞれの点が物体の空間周波数の異なる部分をカバーします。^{[ 12 ]}これにより、解像度は最大で2倍向上します。

全ての角度から同時に照明する（コンデンサーを完全に開く）と、干渉コントラストが低下します。従来の顕微鏡では、最大解像度（コンデンサーを完全に開いた状態、N  =  1）はめったに使用されません。さらに、部分的にコヒーレントな条件下では、記録された画像は、特に自発光しない（蛍光を発しない）物体を観察する場合、物体の散乱ポテンシャルに対して非線形になることがよくあります。^{[ 13 ]}コントラストを高め、場合によってはシステムを線形化するために、非従来型の顕微鏡（構造化照明付き）は、既知の照明パラメータを持つ一連の画像を取得することによってコンデンサー照明を合成します。通常、これらの画像は合成され、完全に閉じたコンデンサーを使用する場合（これもめったに使用されません）と比較して、物体の空間周波数のより広い範囲をカバーするデータを持つ単一の画像を形成します。

別の技術である4Pi顕微鏡法は、対向する2つの対物レンズを使用して有効開口数を2倍にし、前方散乱光と後方散乱光を収集することで回折限界を実質的に半分にします。透明なサンプルを、非干渉性照明または構造化照明と前方散乱光および後方散乱光の両方を組み合わせて画像化することで、散乱球全体を画像化することが可能です。

位置特定に依存する手法とは異なり、このようなシステムは依然として照明（コンデンサー）および集光光学系（対物レンズ）の回折限界によって制限されるが、実際には従来の方法と比較して大幅な解像度向上を実現できる。

回折限界は、検出器にエバネッセント場が到達しないことを前提としているため、遠視野でのみ有効です。像面から約1波長以内の距離で動作するさまざまな近視野技術では、大幅に高い解像度が得られます。これらの技術は、エバネッセント場が回折限界を超える情報を含んでいるという事実を利用して、非常に高解像度の画像を構築します。原理的には、特定のイメージングシステムが近視野信号をどれだけうまく検出できるかに比例する係数で回折限界を上回ります。散乱光イメージングの場合、原子間力顕微鏡システムの上に構築された近視野走査型光学顕微鏡やナノFTIRなどの装置を使用して、最大10～50 nmの解像度を達成できます。このような装置で記録されたデータは、多くの場合、各画像に対して光学逆問題を解くという、かなりの処理を必要とします。 

メタマテリアルを用いたスーパーレンズは、対物レンズを対象物に極めて近い位置（通常は数百ナノメートル）に配置することで、回折限界を超える解像度で画像を取得できる。

蛍光顕微鏡では、励起光と発光光は通常、異なる波長で用いられます。全反射蛍光顕微鏡では、カバーガラス直上の試料の薄い部分をエバネッセント場によって励起し、従来の回折限界対物レンズで記録することで、軸方向の分解能を向上させています。

しかし、これらの技術は1波長を超える波長を画像化できないため、1波長よりも厚い物体を画像化することはできず、その適用範囲が制限される。

遠視野イメージング技術は、照明波長に比べて大きいが微細構造を持つ物体をイメージングする場合に最も適している。これには、細胞が複数の波長にまたがり、分子スケールまでの構造を持つほぼすべての生物学的応用が含まれる。近年、いくつかの技術によって、マクロスケールの距離にわたって回折限界以下のイメージングが可能であることが示された。これらの技術は通常、物質の反射光における光学的非線形性を利用して、回折限界を超える解像度を実現する。

これらの技術の中でも、STED顕微鏡は最も成功した技術の一つです。STEDでは、複数のレーザービームを用いてまず蛍光色素を励起し、次に消光します。消光過程における非線形な光応答（光量を増やすと像が暗くなる）により、色素分子の位置に関する回折限界以下の情報が得られ、高強度の照明を用いることで回折限界をはるかに超える解像度を実現できます。