クライオ電子顕微鏡

1960年代、生物試料の透過型電子顕微鏡観察は、高エネルギー電子ビームによる放射線損傷のため制限されていた。科学者たちは、試料を低温で観察すれば、ビームによる放射線損傷を軽減できると仮説を立てた。[6] 液体ヘリウム（-269℃、4K ^{、 -452 °} F）と液体窒素（ -195.79 ℃、77K 、-320 °F）の両方が極低温物質として検討されたが、^{[ 7 ]}高い安定性は得られなかった。1980年、Erwin KnapekとJacques Dubochetは極低温におけるビーム損傷に関するコメントを発表し、次のような観察結果を共有した。      

炭素膜上にマウントされた薄い結晶は、室温よりも4 Kで30～300倍の耐ビーム性があることがわかった 。我々の結果のほとんどは、4 K付近での低温保護が 温度に強く依存するという仮定によって説明できる。^{[ 8 ]}

しかし、これらの結果は再現されなかった。2年後に修正が発表され、^{[ 9 ]} Natureの解説とともに、^{[ 10 ]}ビーム抵抗は予想よりも重要ではないことが示された。4 K で得られた保護は、以前に述べられていたよりも「L-バリン の標準サンプルで 10 倍」に近いものであった。^{[ 10 ]}クライオ EM サンプルは通常液体窒素温度で収集されるが、^{[ 11 ]}液体ヘリウム温度でのサンプルの挙動を理解するための研究が続けられている。^{[ 12 ] [ 13 ] [ 11 ]}

1981年、欧州分子生物学研究所の科学者らは、初のクライオ電子顕微鏡法の成功を報告した。^{[ 14 ]}研究者らは、親水性の炭素膜に純水を噴霧し、それを急速に極低温物質（77 Kまで冷却した液体プロパンまたは液体エタン）に浸した 。膜上に形成された非晶質氷 の薄い層は厚さ1 μm未満であり、電子回折パターンにより非晶質/ガラス質氷の存在が確認された。1984年、このグループは、ガラス化したアデノウイルス2型、T4バクテリオファージ、セムリキ森林ウイルス、バクテリオファージCbK、および水疱性口内炎ウイルスを分析することにより、構造生物学におけるクライオ電子顕微鏡法の威力を実証した。^{[ 15 ]}この論文はクライオ電子顕微鏡法の起源を示し、この技術は世界中の研究所で日常的に用いられるようになった。

画像化に使用される電子のエネルギー（80～300 kV）は、有機物や生物試料の共有結合を切断する可能性があります。 ^{[ 16 ]}生物試料の画像化には、電子の照射を最小限に抑える必要があります。低照射では、特殊なソフトウェアを使用して、数千または数百万個の凍結分子の画像を選択、整列、平均化して高解像度マップを取得する必要があります。2012年に導入された直接電子検出器とより優れた計算アルゴリズムにより、構造の特徴が大幅に改善されました。^{[ 17 ]}

直接電子検出器とより強力なイメージングアルゴリズムにより、高分子構造をほぼ原子レベルの解像度で決定することが可能になりました。^{[ 18 ]}画像化された高分子には、ウイルス、リボソーム、ミトコンドリア、イオンチャネル、酵素複合体などがあります。2018年から、クライオ電子顕微鏡は、ヘモグロビン（64 kDa）のような小さな構造にも適用できるようになり^{[ 19 ]}、解像度は最大1.8 Åに達しました。^{[ 20 ]} 2019年には、クライオ電子顕微鏡構造は、タンパク質データバンクに登録された構造の2.5%にまで増加しました。^{[ 21 ] [ 22 ]}クライオ電子顕微鏡は、傾斜した2D画像からサンプルの3D再構成を作成するクライオ電子トモグラフィー（クライオET）にも使用できます。 

2010年代には、直接電子検出器を含む電子カメラの劇的な進歩があり、「解像度革命」^{[ 23 ]} を引き起こし、アミノ酸の位置と向きを解像するための重要な約2～3Åの限界を下回る解像度の障壁を押し下げました。 ^{[ 24 ]}

リチャード・ヘンダーソン（英国ケンブリッジ、MRC分子生物学研究所）は、ラザフォード・アップルトン研究所のエンジニアとマックス・プランク協会の科学者とコンソーシアムを結成し、最初のプロトタイプの資金調達と開発を行った。その後、コンソーシアムは電子顕微鏡メーカーのFEIと提携し、新しい設計を展開して販売した。ほぼ同時期に、カリフォルニア州プレザントンのGatan Inc.は、ピーター・デネス（ローレンス・バークレー国立研究所）とデビッド・アガード（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）が設計した同様の検出器を発表した。3番目のタイプのカメラは、Direct Electron社（カリフォルニア州サンディエゴ）のグエン・フー・スオンによって開発された。^{[ 23 ]}

タンパク質ベースのイメージング足場の最近の進歩は、サンプルの向きの偏りやサイズ制限の軽減に役立ちます。クライオEMの最小サイズはまだ確定していませんが、約50 kDaより小さいタンパク質は一般的に信号対雑音比 （SNR）が低すぎてタンパク質粒子を分解できず、3D再構成が困難または不可能になります。^{[ 25 ] [ 26 ]}小さなタンパク質の構造を決定する際にSNRを向上させるための複数の技術が報告されています。^{[ 27 ] [ 28 ]}高親和性DARPins、ナノボディ、抗体断片^{[ 29 ]}に基づくこれらの方法は、標的タンパク質に強固に結合し、それによって有効粒子サイズを増加させ、対称性を導入してクライオEMマップ再構成のSNRを向上させます。クライオEMの結晶化に対する利点は、はるかに少ないサンプル材料で済むことです。これにより、高収率で単離できないタンパク質の構造をより簡単に決定できます。

クライオ電子顕微鏡が生化学に与えた影響を認め、ジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンの3人の科学者は、「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡の開発」によりノーベル化学賞を受賞しました。^{[ 4 ]}

クライオTEMは、ガラス化された生物学的サンプルを画像化できるだけでなく、真空中で揮発性が高すぎて標準的な室温電子顕微鏡では画像化できない物質試料の画像化にも使用できます。たとえば、液相と固相の界面のガラス化切片を抽出してクライオTEMで分析できます^{[ 53 ]。}また、電子顕微鏡の真空中で昇華しやすい硫黄をクライオTEMで安定化させて画像化できます^{[ 54 ] 。}