光学顕微鏡

単純な顕微鏡は、レンズまたはレンズ群を使用して、角度倍率のみで物体を拡大し、観察者に正立拡大仮想像を与えます。^{[ 6 ] [ 7 ]}単一の凸レンズまたはレンズ群の使用は、拡大鏡、ルーペ、望遠鏡や顕微鏡の接眼レンズなどの単純な拡大装置に見られます。

複合顕微鏡は、観察対象物の近くにレンズ（対物レンズと呼ばれる）を配置して光を集め、顕微鏡内部に対象物の実像を結像させます。その像は、2番目のレンズまたはレンズ群（接眼レンズと呼ばれる）によって拡大され、観察者に対象物の拡大された倒立虚像を与えます。^{[ 5 ]}

複合対物レンズと接眼レンズの組み合わせを使用すると、より高い角度倍率が得られます。高さのある物体の場合${\displaystyle h}$最大で拡大されていない角度サイズを占めることができます$\displaystyle \theta _{0}=h/d_{0}}$焦点が合ったまま、近距離に置いたときに実現$d0$眼の（約11cm）の。複合顕微鏡によって生成される仮想像は、 ${\displaystyle \theta =-hs/f_{\text{objective}}f_{\text{eyepiece}}}$、 どこ${\displaystyle s}$は、隣接する対物レンズと接眼レンズの焦点間の距離です。これは、${\displaystyle \theta /\theta _{0}=-sd_{0}/f_{\text{objective}}f_{\text{eyepiece}}}$。

一般的な複合顕微鏡は、交換可能な対物レンズを備えていることが多く、ユーザーが倍率を素早く調整できます。^{[ 5 ]}複合顕微鏡は、位相差などのより高度な照明設定も可能です。

複合光学顕微鏡の設計には、特殊な用途向けに多くのバリエーションが存在する。これらのバリエーションの中には、特定の用途への特化を可能にする物理的な設計上の違いが含まれる。

• 実体顕微鏡とは、低倍率の顕微鏡で、試料の立体像を提供し、一般的に解剖に用いられる。
• 比較顕微鏡は2つの独立した光路を備えているため、それぞれの目で1つの画像を見ることで2つのサンプルを直接比較することができる。
• 倒立顕微鏡は、試料を下から観察するのに適しており、液体培養や金属組織学に有用である。
• 光ファイバーコネクタ検査用顕微鏡。コネクタ端面検査用に設計されています。
• 光学分解能の高い試料を観察するための移動式顕微鏡。

その他の顕微鏡のバリエーションは、異なる照明技術向けに設計されています。

• 岩石顕微鏡は、通常、偏光フィルター、回転ステージ、石膏板を備えており、光学特性が方位によって変化する鉱物やその他の結晶性物質の研究を容易にする。
• 偏光顕微鏡は、岩石顕微鏡に類似している。
• 位相差顕微鏡は、位相差照明法を用いる顕微鏡である。
• 蛍光色素を含む試料の分析用に設計された落射蛍光顕微鏡。
• 共焦点顕微鏡は、走査型レーザーを用いて試料を照射し、蛍光を発する落射蛍光照明の広く用いられている変種である。
• 二光子顕微鏡は、散乱媒体のより深部における蛍光像を撮影し、特に生体試料における光退色を低減するために使用される。
• 学生用顕微鏡 – 学校での使用や子供向けの入門用機器として設計された、操作が簡略化され、光学系の品質が低い場合もある低倍率の顕微鏡。^{[ 8 ]}
• 超顕微鏡とは、光散乱を利用して、直径が可視光の波長（約500ナノメートル）以下またはそれに近い微小粒子を観察できる、改良型光学顕微鏡である。電子顕微鏡の登場以来、ほとんど使われなくなっている。
• 先端増強ラマン顕微鏡は、先端増強ラマン分光法に基づく光学顕微鏡の一種で、従来の波長に基づく分解能の制限がありません。^{[ 9 ] [ 10 ]}この顕微鏡は主に、すべての光学ツールを使用した走査プローブ顕微鏡プラットフォーム上で実現されています。

デジタル顕微鏡とは、デジタルカメラを搭載した顕微鏡で、コンピュータを介して試料を観察できるものです。顕微鏡は、自動化のレベルに応じて、部分的または完全にコンピュータ制御することも可能です。デジタル顕微鏡を用いることで、顕微鏡画像のより詳細な解析が可能になり、例えば、距離や面積の測定、蛍光染色や組織染色の定量化などが行えます。

低出力のデジタル顕微鏡、いわゆるUSB顕微鏡も市販されています。これらは基本的に高出力マクロレンズを備えたウェブカメラであり、一般的に透過照明は使用しません。カメラはコンピュータのUSBポートに直接接続され、画像をモニターに直接表示します。高出力照明は通常、カメラレンズの近くにあるLED光源によって提供されます。

脆弱な生物学的サンプルへの損傷を避けるため、非常に低い光レベルでのデジタル顕微鏡は、高感度光子計数デジタルカメラを使用して利用可能です。もつれ合った光子のペアを提供する光源は、最も光に敏感なサンプルへの損傷のリスクを最小限に抑えることができることが実証されています。光子スパース顕微鏡へのゴーストイメージングのこの応用では、サンプルは赤外線光子で照射され、それぞれの光子は可視帯域のもつれ合ったパートナーと空間的に相関しており、光子計数カメラによる効率的なイメージングが可能です。^{[ 11 ]}

初期の顕微鏡は、倍率が限られた単レンズの拡大鏡であり、少なくとも13世紀に眼鏡にレンズが広く使われるようになった頃まで遡る。 ^{[ 12 ]}

複合顕微鏡は1620年頃にヨーロッパで初めて登場しました^{[ 13 ] [ 1 ]。}これには、ロンドンでコルネリス・ドレッベルが実演したもの（1621年頃）や、1624年にローマで展示されたものが含まれます^{[ 14 ] [ 1 ]。}

複合顕微鏡の実際の発明者は不明だが、長年にわたって多くの主張がなされてきた。その中には、オランダの眼鏡職人ヨハネス・ザカリアセンが、複合顕微鏡の登場から35年後に、^彼の父ザカリアス・ヤンセンが1590年という早い時期に複合顕微鏡や望遠鏡を発明したと主張したという主張も含まれる。ヨハネスの証言は疑わしいと主張する者もいるが、^{発明の時期を非常に遡らせるため}、ザカリアスはその当時子供であったはずであり、ヨハネスの主張が真実であるためには、複合顕微鏡はヨハネスの祖父ハンス・マルテンスによって発明されたに違いないという憶測につながっている。^{[ 17 ]}また、ヤンセンの競合相手であるハンス・リッペルハイ（1608年に最初の望遠鏡の特許を申請）も複合顕微鏡を発明したという主張もある。 ^{[ 19 ]}他の歴史家は、1621年に複合顕微鏡を発明したオランダの革新者コルネリス・ドレッベルを指摘している。^{[ 14 ] [ 1 ]}

ガリレオ・ガリレイは、複合顕微鏡の発明者として挙げられることがある。1610年以降、彼は望遠鏡の焦点を絞ってハエなどの小さな物体を近くで見ることができること^{[ 20 ]} 、および/または逆向きに覗いて小さな物体を拡大できることを発見した^{[ 21 ]} 。唯一の欠点は、2フィートの長さの望遠鏡を、それほど近い物体を見るために6フィートまで伸ばさなければならなかったことである^{[ 22 ]} 。 1624年にローマで展示されたドレッベルが作った複合顕微鏡を見た後、ガリレオは改良版を自作した^{[ 14 ] [ 1 ]} 。 1625年、ジョヴァンニ・ファーベルは、ガリレオが1624年にリンチェイ・アカデミアに提出した複合顕微鏡に顕微鏡という名前を付けた^{[ 23 ]}（ガリレオはそれを「オッキオリーノ」または「小さな目」と呼んでいた）。ファーバーは、ギリシャ語のμικρόν（ミクロン）「小さい」とσκοπεῖν （スコペイン）「見る」という言葉からこの名前を作り出した。これは、リンチェイアン派が作った別の言葉である「望遠鏡」に類似した名前を意図したものである。^{[ 24 ]}

同じくオランダ人のクリスティアーン・ホイヘンスは、17世紀後半に色収差補正を施したシンプルな2枚レンズの接眼レンズシステムを開発し、顕微鏡開発における大きな進歩を遂げました。ホイヘンス接眼レンズは現在でも製造されていますが、視野が狭いなど、いくつかの小さな欠点があります。

アントニ・ファン・レーウェンフック（1632–1724）は、16世紀にはすでに単純な拡大レンズが製造されていたにもかかわらず、顕微鏡を生物学者の注目を集めた人物として知られています。ファン・レーウェンフックの自作顕微鏡は、非常に小さいながらも強力なレンズを1枚備えた単純な顕微鏡でした。使い勝手は悪かったものの、ファン・レーウェンフックは詳細な画像を見ることができました。複合顕微鏡がファン・レーウェンフックの単純な顕微鏡と同じ品質の画像を提供できるようになるまでには、複数のレンズの構成の難しさから、光学技術の開発に約150年かかりました。1850年代には、チューレーン大学の化学教授ジョン・レナード・リデルが、コレラに関するアメリカで最も初期かつ最も広範な顕微鏡調査の1つを実施中に、最初の実用的な双眼顕微鏡を発明しました。^{[ 26 ] [ 27 ]}

基本的な顕微鏡技術と光学系は400年以上前から存在していたが、今日見られるような高品質の画像を生成するための試料照明技術が開発されたのは、ごく最近のことである。

1893年8月、アウグスト・ケーラーはケーラー照明法を開発した。この試料照明法は極めて均一な照明を実現し、従来の試料照明法の多くの限界を克服した。ケーラー照明法が開発される以前は、例えば電球のフィラメントといった光源の像が、常に試料像に映り込んでいた。

1953年、オランダの物理学者フリッツ・ゼルニケは、透明な試料の画像化を可能にする位相差照明法の開発により、ノーベル物理学賞を受賞した。光の吸収ではなく干渉を利用することで、生きた哺乳類細胞のような極めて透明な試料を、染色技術を用いることなく画像化できる。そのわずか2年後の1955年、ジョルジュ・ノマルスキーは、別の干渉ベースの画像化技術である微分干渉コントラスト顕微鏡の理論を発表した。

現代の生物顕微鏡は、細胞内の特定の構造を観察するための蛍光プローブの開発に大きく依存している。通常の透過光顕微鏡とは異なり、蛍光顕微鏡では、対物レンズを通して狭い波長範囲の光を試料に照射する。この光は試料中の蛍光色素と相互作用し、蛍光色素はより長い波長の光を放出する。この放出された光が画像を構成する。

20世紀半ば以降、DNAに結合するDAPIなどの化学蛍光染色剤が、細胞内の特定の構造を標識するために用いられてきた。より最近の技術開発としては、蛍光標識抗体を用いて試料中の特定のタンパク質を認識する免疫蛍光法や、生細胞が発現することで蛍光を発するGFPなどの蛍光タンパク質が挙げられる。

接眼レンズは、2枚以上のレンズを内蔵した円筒形のレンズで、像を眼に焦点を合わせる役割を果たします。接眼レンズは鏡筒の上端に挿入されます。接眼レンズは交換可能で、倍率の異なる様々な接眼レンズを取り付けることができます。接眼レンズの一般的な倍率は、5倍、10倍（最も一般的）、15倍、20倍です。高性能顕微鏡の中には、対物レンズと接眼レンズの光学構成を最適化して、最高の光学性能を実現しているものもあります。これは、アポクロマート対物レンズで最もよく見られます。

対物レンズターレット、リボルバー、または回転ノーズピースは、対物レンズセットを保持する部分です。これにより、ユーザーは対物レンズを切り替えることができます。^{[ 28 ]}

一般的な複合光学顕微鏡の下部には、試料からの光を集める対物レンズが1つ以上あります。対物レンズは通常、ガラス製の単レンズまたは多レンズ複合レンズを内蔵した円筒形のハウジングに収められています。通常、必要な対物レンズを選択するために回転できる円形のノーズピースに、約3つの対物レンズがねじ込まれています。これらの配置は、焦点が合うように設計されており、顕微鏡でレンズを切り替えても試料の焦点が合ったままになります。顕微鏡の対物レンズは、倍率と開口数という2つのパラメータで特徴付けられます。前者は通常5倍から100倍の範囲で、後者は0.14から0.7の範囲で、それぞれ焦点距離が約40mmから2mmに相当します。倍率の高い対物レンズは通常、開口数が高く、結果として得られる画像の被写界深度が 浅くなります。一部の高性能対物レンズでは、最高の光学性能を発揮するために、対応する接眼レンズが必要になる場合があります。

油浸対物レンズ

一部の顕微鏡では、高倍率での解像度を高めるために、油浸対物レンズまたは水浸対物レンズを使用します。これらは、浸漬油や水などの屈折率整合材料と、対物レンズとサンプルの間の整合カバーガラスとともに使用されます。屈折率整合材料の屈折率は空気よりも高いため、対物レンズの開口数を大きく（1より大きい）することができ、光が最小限の屈折で標本から対物レンズの外側面に透過します。最大で1.6の開口数を実現できます。^{[ 29 ]}開口数が大きいほど、より多くの光を集めることができ、より小さな詳細を詳細に観察することが可能になります。油浸レンズの倍率は通常40～100倍です。

調整ノブでステージを上下に動かすことができ、粗動と微動の焦点調整も別々に行えます。同じ操作で、顕微鏡は様々な厚さの試料に対応できます。旧型の顕微鏡では、焦点調整ホイールで顕微鏡鏡筒をスタンドに対して上下に動かし、ステージは固定されていました。

光学系全体は従来、剛性の高いアームに取り付けられ、そのアームは頑丈なU字型の脚部に取り付けられて必要な剛性を確保している。アームの角度は調整可能で、視野角を調整することができる。

フレームには、各種顕微鏡制御装置を取り付けるための取り付けポイントが設けられています。通常、これには焦点調節用の制御装置が含まれ、一般的には粗動焦点調整用の大型ローレットホイールと、微動焦点調整用の小型ローレットホイールが備えられています。その他、ランプ制御装置やコンデンサー調整用制御装置が備えられている場合もあります。

ステージは対物レンズの下にある台で、観察対象の標本を支える役割を果たします。ステージの中央には、標本を照らすための光が通る穴が開いています。ステージには通常、スライド（標本を載せる、通常25×75mmの長方形のガラス板 ）を保持するためのアームが付いています。

100倍以上の高倍率では、スライドを手で動かすのは現実的ではありません。中級以上の価格帯の顕微鏡によく見られるメカニカルステージは、コントロールノブを使って試料／スライドを微調整し、希望の位置に移動させることができます。顕微鏡に元々メカニカルステージが搭載されていない場合でも、後から追加できる可能性があります。

すべてのステージは焦点を合わせるために上下に動きます。メカニカルステージでは、スライドが2つの水平軸上を移動し、標本を精密に観察できるように位置決めします。

焦点合わせは、まず低倍率で行い、ユーザーがステージ上で標本を中央に配置します。高倍率に移動する場合には、ステージを垂直方向に高く移動させて再度焦点を合わせる必要があり、さらに標本の水平方向の位置を微調整する必要が生じる場合もあります。標本の水平方向の位置調整は、メカニカルステージを使用する理由の一つです。

標本を準備してスライドに載せるのは難しいため、子供の場合は、焦点レベルに関係なく、中心がずれておらず、簡単にピントが合うように準備されたスライドから始めるのが最善です。

光源には様々な種類があります。最もシンプルなのは、鏡を通して日光を照射する方法です。しかし、ほとんどの顕微鏡には、調整・制御可能な光源（多くはハロゲンランプ）が備わっており、 LEDやレーザーを用いた照明も普及しつつあります。高価な機器には、ケーラー照明がよく用いられています。

コンデンサーは、照明光源からの光を試料に集光するように設計されたレンズです。コンデンサーには、照明の質と強度を調整するための絞りやフィルターなどの他の機能も含まれる場合があります。暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡などの照明技術では、追加の光学部品を光路に正確に配置する必要があります。

複合光学顕微鏡の実際の倍率は、接眼レンズと対物レンズの倍率の積で表されます。例えば、接眼レンズの倍率が10倍、対物レンズの倍率が100倍の場合、合計倍率は1,000倍になります。油や紫外線などの環境を調整することで解像度を高め、1,000倍を超える倍率でも細部まで観察することが可能です。

試料からコントラストの高い画像を生成するために光路を調整する技術は数多く存在する。試料のコントラストを高める主な技術としては、交差偏光、暗視野、位相差、微分干渉コントラスト照明などが挙げられる。最近の技術（ Sarfus ）では、交差偏光と特定のコントラスト強調スライドを組み合わせることで、ナノメートルサイズの試料を可視化している。

• ティッシュペーパーのサンプルにコントラストを生成するために使用される透過照明技術の4つの例。1.559 μm/ピクセル。
• 
  明視野照明では、試料のコントラストは試料による光の吸収によって生じる。
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  交差偏光照明では、試料のコントラストは、偏光が試料を通過する際の回転によって生じる。
• 
  暗視野照明では、試料のコントラストは試料によって散乱された光から生じる。
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  位相差照明では、試料のコントラストは、試料を通過する光路長が異なることによる干渉によって生じる。

現代の顕微鏡は、試料の透過光像を観察するだけでなく、他の種類のデータを抽出するための様々な技術を利用できます。これらの技術のほとんどは、基本的な複合顕微鏡に加えて追加の機器を必要とします。

• 反射光、または入射光による照明（表面構造の解析用）
• 蛍光顕微鏡検査（両方）：

• 落射蛍光顕微鏡
• 共焦点顕微鏡

• マイクロ分光法（紫外可視分光光度計と光学顕微鏡を統合したもの）
• 紫外線顕微鏡
• 近赤外線顕微鏡
• コントラスト強調と収差低減のための多重透過顕微鏡^{[ 30 ] 。}
• 自動化（大型サンプルの自動スキャンまたは画像キャプチャ用）

上述の透過光限界を超える解像度を達成するための複数の技術が利用可能です。1979年にCourjonとBulaboisによって記述されたホログラフィック技術もこの解像度限界を破ることができますが、彼らの実験分析では解像度が制限されていました。^{[ 39 ]}

蛍光サンプルを使用すると、より多くの技術が利用可能になります。例としては、 Vertico SMI、エバネッセント波を使用する近接場走査型光学顕微鏡、誘導放出抑制などがあります。2005年には、単一分子を検出できる顕微鏡が教育ツールとして紹介されました。^{[ 40 ]}

過去10年間で著しい進歩が見られたにもかかわらず、回折限界を超える技術は依然として限られており、専門的なものとなっている。

ほとんどの手法は横方向の解像度向上に重点を置いているが、極めて薄い試料の分析を可能にすることを目的とした手法もいくつか存在する。例えば、サーファス法では、薄い試料をコントラスト強調表面上に配置することで、0.3ナノメートルという薄さの膜を直接可視化することができる。

2014年10月8日、超解像蛍光顕微鏡の開発により、エリック・ベツィグ、ウィリアム・モーナー、ステファン・ヘルにノーベル化学賞が授与された。^{[ 41 ] [ 42 ]}

局在顕微鏡SPDMphymod

SPDM（スペクトル精密距離顕微鏡）は、基本的な局在化顕微鏡技術であり、蛍光顕微鏡の光光学プロセスで、光学顕微鏡の理論的な分解能限界をはるかに下回る「光学的に隔離された」粒子（分子など）の位置、距離、角度の測定を可能にします。「光学的に隔離された」とは、ある時点で、従来の光学分解能によって決定されるサイズ（通常は直径 約200～250 nm ）の領域内の単一の粒子/分子のみが記録されていることを意味します。これは、そのような領域内の分子がすべて異なるスペクトルマーカー（たとえば、異なる色、または異なる粒子の光放出におけるその他の使用可能な違い）を持っている場合に可能です。 ^{[ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ]}

GFP 、Alexa色素、Atto色素、Cy2/Cy3、フルオレセイン分子などの多くの標準的な蛍光色素は、特定の光物理的条件が満たされれば、局在顕微鏡に使用できます。このいわゆるSPDMphymod（物理的に修飾可能な蛍光色素）技術を使用すると、適切な強度の単一のレーザー波長でナノイメージングに十分です。^{[ 49 ]}

ステッド

誘導放出抑制は、回折限界を超える高解像度が可能であることを示す単純な例ですが、大きな制約があります。STEDは、光パルスを組み合わせてサンプル中の蛍光分子の小さなサブポピュレーションに蛍光を誘起する蛍光顕微鏡技術です。各分子は画像内に回折限界の光スポットを生成し、これらのスポットの中心は分子の位置に対応します。蛍光を発する分子の数が少ないため、光スポットが重なることはほとんどなく、したがって正確に配置できます。このプロセスは、画像を生成するために何度も繰り返されます。マックス・プランク生物物理化学研究所のステファン・ヘルは、 STED顕微鏡と関連する方法論の開発により、2006年に第10回ドイツ未来賞、2014年にノーベル化学賞を受賞しました。^{[ 51 ]}

• ヴァン・ヘルデン、アルバート;デュプレ、スヴェン。ヴァン・ゲント、ロブ (2011)。望遠鏡の起源。アムステルダム大学出版局。ISBN 978-90-6984-615-6。