一般原則 反応に基質 が大量に添加されると、利用可能な酵素結合部位は 最大反応速度 の限界まで満たされる。V 最大 {\displaystyle V_{\max }} 酵素によって触媒される 反応は、非触媒反応とまったく同じ反応物を使用し、まったく同じ生成物を生成します。他の触媒と同様に、酵素は基質と生成物の間の平衡の位置を変えません。 [ 1 ] 漸近的に 理論上の最大値に近づきます。酵素の活性部位はほぼすべて基質で占められ、飽和状態になり、反応速度は酵素の固有のターンオーバー速度によって決定されます。[ 2 ] K M で表されます。したがって、K M は反応速度が最大速度の半分になる基質濃度である。[ 2 ]
酵素反応速度論の重要な2つの特性は、酵素が基質で飽和する容易さと、酵素が達成できる最大速度です。これらの特性を知ることで、酵素が細胞内でどのような働きをするかを推測でき、酵素がこれらの条件の変化にどのように反応するかを示すことができます。[ 3 ]
酵素アッセイ 酵素反応の進行曲線。初期速度期間の傾きは、反応の初期速度 v である。ミカエリス・メンテン式は、 この傾きが基質濃度によってどのように変化するかを表す。 酵素アッセイは、酵素反応の速度を測定する実験室手順です。酵素は触媒する反応で消費されないため、酵素アッセイでは通常、基質または生成物の濃度の変化を追跡して反応速度を測定します。測定方法は数多くあります。分光光度法による アッセイでは、生成物と反応物の間の吸光度の変化を観察します。放射 性同位体アッセイでは、 放射能 の取り込みまたは放出を利用して、時間経過とともに生成される生成物の量を測定します。分光光度法による アッセイは、反応速度を連続的に測定できるため、最も便利です。放射性同位体アッセイでは、サンプルの除去と計数が必要ですが（つまり、不連続アッセイです）、通常は非常に感度が高く、非常に低いレベルの酵素活性を測定できます。[ 4 ] 質量分析法を使用して、基質が生成物に変換される際の 安定同位体 の取り込みまたは放出をモニタリングする方法があります。アッセイが失敗することもあり、失敗したアッセイを復活させるためのアプローチが不可欠です。[ 5 ]
最も感度の高い酵素アッセイでは、顕微鏡 を通して集束されたレーザー を使用して、酵素分子が反応を触媒する際の個々の酵素分子の変化を観察します。これらの測定では、酵素の反応機構中の補因子 の蛍光の変化、または タンパク質 の特定の部位に添加された蛍光色素 を使用して、触媒中に発生する動きを報告します。[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]
酵素アッセイの反応進行曲線の例を上に示します。酵素は、反応開始後しばらくの間はほぼ直線的な初期速度で生成物を生成します。反応が進み基質が消費されるにつれて、速度は継続的に低下します（基質が飽和レベルに達していない限り）。初期（および最大）速度を測定するために、酵素アッセイは通常、反応が完全に完了する数パーセントまでしか進行していないときに実施されます。初期速度期間の長さはアッセイ条件によって異なり、ミリ秒から数時間まで及ぶ場合があります。ただし、液体を高速混合する装置を使用すると、1秒未満の初期速度で高速な速度論的測定が可能になります。[ 9 ] [ 10 ]
ほとんどの酵素反応速度論研究は、酵素反応の初期のほぼ直線的な部分に焦点を当てています。しかし、完全な反応曲線を測定し、このデータを非線形速度式 に当てはめることも可能です。この酵素反応の測定方法は、進行曲線解析と呼ばれます。このアプローチは、初期速度が速すぎて正確に測定できない場合に、迅速な反応速度論の代替として役立ちます。[ 11 ]
酵素学データ報告基準 ガイドラインは、対応する実験条件を含む酵素活性の調査から得られた速度論的データと平衡データを包括的に報告するために必要な最低限の情報を提供します。このガイドラインは、機能的な酵素データを厳密かつ堅牢に報告するために開発されました。[ 12 ]
単一基質反応 単一基質機構を持つ酵素には、トリオースリン酸イソメラーゼ やビスホスホグリセリン酸ムターゼ などのイソメラーゼ 、アデニル酸シクラーゼ などの分子内リアーゼ 、RNAリアーゼであるハンマーヘッドリボザイムなどがある。 [ 13 ] カタラーゼ はその一例で、この酵素は最初の過酸化水素 基質分子と反応し、酸化されてから、2番目の基質分子によって還元される。単一の基質が関与しているにもかかわらず、修飾された酵素中間体が存在するため、カタラーゼの機構は実際にはピンポン機構である[ 14 ]。 このタイプの機構については、後述の多基質反応の セクションで説明する。
酵素触媒 の有無にかかわらず、化学反応のメカニズム。酵素（E）が
基質 （S）に結合して
生成物 （P）を生成する。
酵素触媒反応は飽和性であるため、その触媒速度は基質の増加に対して線形応答を示さない。反応の初期速度を基質濃度の範囲（[S]で表される）で測定すると、初期反応速度（v 0 {\displaystyle v_{0}} である Vmaxに達する。 [ 15 ]
単一基質反応のミカエリス・メンテン速度論モデルでは、酵素Eと基質Sの間で最初の二分子反応が起こり、酵素-基質複合体ESが形成されます。酵素反応速度は、基質濃度が Vmax と呼ばれるあるレベルまで増加するにつれて上昇します。Vmaxでは、 基質濃度の増加は反応速度の増加を引き起こしません。これは、基質（S）と反応できる酵素（E）がもはや存在しないためです。ここで、反応速度はES複合体に依存するようになり、反応は次数ゼロの単分子反応になります。単分子反応の酵素機構はES → k c 1 t E + P {\displaystyle {\ce {ES ->[k_{cat}] E + P}}} 速度定数 k cat を持つ単一の触媒反応としてモデル化できる。反応経路が 1 つまたは複数の中間体を経て進行する場合、k cat は 複数の基本速度定数の関数となるが、最も単純な単一の基本反応 (中間体なし) の場合は、基本単分子速度定数k 2 と同一になる。見かけの単分子速度定数k cat は ターンオーバー数 とも呼ばれ、1 秒あたりに触媒される酵素反応の最大数を表す。[ 16 ]
ミカエリス・メンテン式[ 17 ] は、 (初期)反応速度v0が基質結合平衡の位置と速度定数k2にどのように依存 する か を記述し ている。[ 18 ]
v 0 = V 最大 [ S ] K M + [ S ] {\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}} （ミカエリス・メンテン式） 定数とともに
K M = d e f k 2 + k − 1 k 1 ≈ K D V 最大 = d e f k c 1 t [ E ] t o t {\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}} このミカエリス・メンテン式は、ほとんどの単一基質酵素反応速度論の基礎となっている。この式には、2つの重要な仮定が根底にある（中間体や生成物による阻害がなく、アロステリック性 や協同性 もないという一般的な仮定とは別に）。1つ目の仮定は、いわゆる準定常状態仮定 （または擬似定常状態仮説）であり、基質結合酵素（したがって非結合酵素も）の濃度は、生成物や基質の濃度よりもはるかにゆっくりと変化するため、複合体の時間変化をゼロに設定できるというものである。[ 19 ]
d [ ES ] / d t = ! 0 {\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}
2つ目の仮定は、総酵素濃度は時間とともに変化しないということである。
[ E ] 合計 = [ E ] + [ ES ] = ! const {\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}
ミカエリス定数K M は 、酵素反応速度がV max の半分になる濃度として実験的に定義され、[S] = K M をミカエリス・メンテン式に代入することで検証でき、グラフでも確認できます。律速酵素ステップが基質解離 (k 2 〜 k − 1 \displaystyle k_{2}\ll k_{-1}} K M は 、ES 複合体の解離定数 K D とほぼ等しい。 [ 20 ] [ S ] {\displaystyle {\ce {[S]}}} K M {\displaystyle K_{M}} [ S ] / （ K M + [ S ] ） ≈ [ S ] / K M {\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\おおよそ [{\ce {S}}]/K_{M}} [ E ] 合計 ≈ [ E ] {\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\about [E]}}}
v 0 ≈ k c 1 t K M [ E ] [ S ] もし [ S ] 〜 K M {\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}} したがって、生成物生成速度は酵素濃度と基質濃度の両方に依存し、その式は対応する擬二次速度定数を持つ二分子反応に類似している。k 2 / K M {\displaystyle k_{2}/K_{M}} この定数は触媒効率 の尺度である。最も効率的な酵素は、k 2 / K M {\displaystyle k_{2}/K_{M}} 10 8 ～ 10 10 M −1 s −1 の範囲。これらの酵素は非常に効率的で、基質分子に遭遇するたびに効果的に反応を触媒し、効率の理論的な上限（拡散限界 ）に達しており、速度論的に完全な酵素と呼ばれることもあります。[ 21 ] k 2 / K M {\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}} k 2 {\displaystyle k_{2}} 10 5 s − 1 M − 1 10⁵ s⁻¹ M⁻¹ 10 s − 1 10s^{-1}} [ 22 ]
ミカエリス・メンテン式によって予測される観測速度は、ミカエリス・メンテン式を一次化学反応速度論の式に組み込むことにより、基質の消失と生成物の生成の時間経過を 直接モデル化するために使用できます。ただし、これは、一次化学反応速度論の記述におけるオイラー数の使用に伴う問題を認識する場合にのみ達成できます。すなわち、 e − k は分割定数であり、計算に系統誤差を導入し、各時間期間後の残存基質を表す単一の定数として書き直すことができます。[ 23 ]
[ S ] = [ S ] 0 （ 1 − k ） t {\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,} [ S ] = [ S ] 0 （ 1 − v / [ S ] 0 ） t {\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,} [ S ] = [ S ] 0 （ 1 − （ V 最大 [ S ] 0 / （ K M + [ S ] 0 ） / [ S ] 0 ） ） t {\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max }[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,} 1983年、スチュアート・ビール（および1997年に独立してサンティアゴ・シュネル とクラウディオ・メンドーサ）は、ミカエリス・メンテン機構の時間経過速度論解析のための閉形式解を導出した。[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]
[ S ] K M = W [ F （ t ） ] {\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,} ここで W[ ] はランベルト W 関数 [ 27 ] [ 28 ]
F （ t ） = [ S ] 0 K M exp （ [ S ] 0 K M − V 最大 K M t ） {\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,} この方程式は、ベルベラン・サントスによって得られた以下の方程式に包含されており、初期基質濃度が酵素濃度に近い場合にも有効である。[ 29 ]
[ S ] K M = W [ F （ t ） ] − V 最大 k c 1 t K M W [ F （ t ） ] 1 + W [ F （ t ） ] {\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,} ここで、W[ ]は再びランベルトW関数 である。
運動学的データのラインウィーバー・バークプロットまたは二重逆数プロット。軸切片と勾配の有意性を示す。 上記のv 対[S]のグラフは線形ではありません。最初は[S]が低いところでは線形ですが、[S]が高いところでは折れ曲がって飽和します。コンピュータによる非線形曲線フィッティングの現代以前は、この非線形性のため、 K M とV maxを 正確に推定することが困難でした。そのため、いくつかの研究者は、ラインウィーバー・バークプロット、イーディー・ホフステー図、ヘインズ・ウルフプロットなど、ミカエリス・メンテン式の線形化を開発しました。これらの線形表現はすべてデータの視覚化に役立ちますが、非線形回帰法によるより正確な決定を可能にするコンピュータソフトウェアが容易に入手できるため、速度論的パラメータの決定には使用すべきではありません。[ 30 ]
ラインウィーバー・バークプロットまたは二重逆数プロットは、速度論的データを図示する一般的な方法です。これは、ミカエリス・メンテン式の両辺の逆数を取ることによって作成されます。 [ 31 ] これはミカエリス・メンテン式の線形形式であり、 y = m x + cの式を持つ直線が生成され、y 切片は 1/ V max に等しく、グラフのx切片は −1/ K M を表します。
1 v = K M V 最大 [ S ] + 1 V 最大 {\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}} 負の 1/[S] では実験値を取得できません。下限値 1/[S] = 0 ( y 切片) は無限基質濃度に対応し、1/v = 1/V max となるため、x切片は正の濃度で取得した実験データの 外挿値 となります。より一般的には、Lineweaver–Burk プロットは低基質濃度で取得した測定値の重要性を歪めるため、V max およびK M の不正確な推定値が得られる可能性があります。[ 32 ] Eadie–Hofstee プロット です。この場合、vは v /[S]に対してプロットされます。3 番目に一般的な線形表現であるHanes–Woolf プロット では、[S]/ v が [S] に対してプロットされます。一般に、データの正規化は実験作業の量を減らし、出力の信頼性を高めるのに役立ち、グラフィカル解析と数値解析の両方に適しています。[ 33 ]
より複雑なケースも検討できる。
E + S ⇌ k − 1 k 1 ES → k 2 EI → k 3 E + P {\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}} 酵素と中間体との複合体が存在し、中間体が第２段階で生成物に変換される。この場合、非常に類似した式が得られる[ 37 ]。
v 0 = k c 1 t [ S ] [ E ] 0 K M ′ + [ S ] {\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}} しかし定数は異なる
K M ′ = d e f k 3 k 2 + k 3 K M = k 3 k 2 + k 3 ⋅ k 2 + k − 1 k 1 k c 1 t = d e f k 3 k 2 k 2 + k 3 {\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}} 極限の場合、k 3 ≫ k 2 {\displaystyle k_{3}\gg k_{2}} EI ⟶ E + P {\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}} K M ′ ≈ K M {\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}} k c 1 t ≈ k 2 {\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}} 38 ]
多基質反応 多基質反応は、基質がどのように結合し、どのような順序で結合するかを記述する複雑な速度式に従います。基質 A の濃度を一定に保ち、基質 B を変化させると、これらの反応の解析ははるかに簡単になります。このような条件下では、酵素は単一基質酵素とまったく同じように動作し、[S] に対するvのプロットから、基質 B の見かけの K M 定数とV max 定数が得られます。A の異なる固定濃度でこれらの測定のセットを実行すると、これらのデータを使用して、反応のメカニズムが何であるかを解明できます。2 つの基質 A と B を受け取り、2 つの生成物 P と Q に変換する酵素の場合、3 元複合体メカニズムと置換酵素メカニズムの 2 つのタイプのメカニズムがあります。[ 39 ]
三元複合体メカニズム [ 40 ]
酵素反応におけるランダム順序三元複合体機構。反応経路は線で示され、基質AとB、または生成物PとQを含む酵素中間体は線の下に記述される。 これらの酵素では、両方の基質が同時に酵素に結合して EAB 三元複合体を形成します。結合の順序はランダムである場合（ランダム機構）と、基質が特定の順序で結合する必要がある場合（順序機構）があります。三元複合体機構を持つ酵素のv と [S] の曲線セット（A は固定、B は変化）をLineweaver–Burk プロット にプロットすると、生成された一連の線が交差します。[ 41 ]
三元複合体機構を持つ酵素には、グルタチオンS- トランスフェラーゼ [ 42 ] ジヒドロ葉酸還元酵素 [ 43 ] DNAポリメラーゼ [ 44 ]
置換酵素（「ピンポン」）メカニズム [ 45 ]
E → A ↓ EA ↽ − − ⇀ E * P → P ↑ E * → B ↓ E * B ↽ − − ⇀ EQ → Q ↑ E {\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}} 酵素反応におけるピンポン機構。中間体は基質AとB、または生成物PとQを含む。
置換酵素機構を持つ酵素は、E と化学的に修飾された酵素 E* の 2 つの状態で存在できます。この修飾された酵素は中間体 として知られています。このような機構では、基質 A が結合し、例えば化学基を活性部位に転移させることで酵素を E* に変え、その後放出されます。最初の基質が放出された後にのみ、基質 B が結合して修飾された酵素と反応し、修飾されていない E 型を再生できます。置換酵素機構を持つ酵素のv と [S] の曲線 (A を固定し、B を変化させる) のセットを Lineweaver–Burk プロットにプロットすると、平行線のセットが生成されます。これは二次プロット と呼ばれます。[ 46 ] [ 47 ]
置換酵素機構を持つ酵素には、チオレドキシンペルオキシダーゼ などの酸化還元酵素 [ 48 ] 転移酵素 [ 49 ] トリプシン やキモトリプシン などのセリンプロテアーゼ [ 50 ] 消化 酵素（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ）、血液凝固カスケードのいくつかの酵素、その他多くのものを含む、非常に一般的で多様な酵素ファミリーである。これらのセリンプロテアーゼでは、E*中間体は、活性部位の セリン 残基がタンパク質基質のペプチド結合 を攻撃することによって形成されるアシル酵素種である[ 51 ]
酵素反応の飽和曲線（シグモイド型反応速度を示す） 多くの異なる酵素系は、ミカエリス・メンテンの法則に従わない挙動を示します。いくつかの例としては、自己触媒酵素、協同的酵素およびアロステリック酵素、界面酵素および細胞内酵素、プロセス酵素などの反応速度論が挙げられます。一部の酵素は、[S] によるシグモイド型の vプロットを生成しますが、これは多くの場合、基質が活性部位に 協同的に結合する ことを示しています。これは、1 つの基質分子の結合が、後続の基質分子の結合に影響を与えることを意味します。この挙動は、相互作用する複数の活性部位を持つ多量体 酵素で最も一般的です。[ 57 ] ヘモグロビン のそれと似ており、1 つの活性部位への基質の結合が、他の活性部位の基質分子に対する親和性を変化させます。最初の基質分子の結合が他の活性部位の基質に対する親和性を高める 場合、正の協同性が発生します。最初の基質の結合が酵素の他の基質分子に対する親和性を低下させる 場合、負の協同性が発生します。 [ 58 ] [ 59 ] アスパラギン酸トランスカルバモイル化酵素 [ 60 ] ホスホフルクトキナーゼ [ 61 ] [ 62 ]
ヒル方程式 [ 63 ] nは、 基質が1つの活性部位に結合することが、基質が他の活性部位に結合することにどの程度影響するかを測定する。ヒル係数が1未満であれば負の協同性を示し、1より大きい場合は正の協同性 を示す。[ 64 ]
定常状態前反応速度論 酵素反応のバースト段階を示す、定常状態前進行曲線 酵素と基質が混合された直後の瞬間には、生成物は形成されておらず、中間体も 存在しない。反応の次の数ミリ秒の研究は、定常状態前速度論と呼ばれる。したがって、定常状態前速度論は、定常状態濃度 に達するまでの酵素-基質中間体（ESやE*など）の形成と消費に関係する。[ 65 ]
このアプローチは、キモトリプシン によって触媒される加水分解反応に最初に適用されました。[ 66 ] [ 67 ] 求核性 セリンによる基質への攻撃とアシル酵素中間体の形成によって形成されます。[ 68 ]
図では、酵素は反応の最初の数秒でE*を急速に生成します。その後、定常状態に達すると速度は低下します。この急速な反応バースト段階は、酵素の1回のターンオーバーを測定します。したがって、このバーストで放出される生成物の量（グラフのy 軸の切片として示される）は、アッセイ中に存在する機能的な酵素の量も示します。[ 69 ]
化学反応機構 酵素反応速度論を測定する重要な目標は、酵素反応の化学的メカニズム、すなわち基質を生成物に変換する一連の化学的ステップを決定することです。上記で説明した速度論的アプローチは、中間体が 形成され、相互変換される速度を示しますが、これらの中間体が正確に何であるかを特定することはできません。[ 70 ]
さまざまな溶液条件下、またはわずかに改変した酵素や基質で行われた速度論的測定は、反応の律速段階や中間体を明らかにするため、この化学機構を解明するのに役立つことが多い。たとえば、水素 原子 への共有結合 の切断は、一般的な律速段階である。可能な水素移動のうちどれが律速段階であるかは、各水素をその安定同位 体 である重水素に置換したときの速度論的効果を測定することによって示すことができる。重要な水素が置換されると、重水素との結合は水素との結合よりも切断しにくいため、一次速度論的同位体効果により速度が変化する。 [ 71 ] 13C / 12C や18O / 16O などの他の同位体置換でも同様の効果を測定することは可能であるが、これらの効果はより微妙である。[ 72 ]
同位体は、最終生成物中の基質分子のさまざまな部分の運命を明らかにするためにも使用できます。たとえば、最終生成物中の酸素 原子の起源を識別することは、それが水または基質の一部から来た可能性があるため、困難な場合があります。これは、反応に関与するさまざまな分子に酸素の安定同位体18Oを系統的に置換し、生成物中の同位体を調べることによって決定できます。 [ 73 ] [ 74 ] 補因子 を変更することによって、[ 75 ] 保存されたアミノ酸残基の部位特異的変異誘発 によって、または基質の類似体の存在下での酵素の挙動を研究することによっても解明できます。[ 76 ]
酵素の阻害と活性化 可逆的酵素阻害剤の反応速度論的スキーム 酵素阻害剤は酵素活性を低下または消失させる分子であり、酵素活性化剤は酵素の触媒速度を増加させる分子である。これらの相互作用は可逆的 （すなわち、阻害剤を除去すると酵素活性が回復する）または不可逆的 （すなわち、阻害剤が酵素を永久に不活性化する）のいずれかである。[ 77 ]
可逆的阻害剤 従来、可逆的酵素阻害剤は、K M とV max への影響に基づいて、競合的 、非競合的 、または非競合的 に分類されてきた。これらの異なる影響は、阻害剤がそれぞれ酵素 E、酵素-基質複合体 ES、またはその両方に結合することによって生じる。これらのクラスの区分は、その導出の問題から生じ、1 つの結合イベントに対して 2 つの異なる結合定数を使用する必要性が生じる。阻害剤の結合と酵素活性への影響は、2 つの異なる事柄であり、従来の方程式では認識されていないもう 1 つの問題である。非競合的阻害では、阻害剤の結合は酵素の 100% 阻害のみをもたらし、中間の可能性を考慮しない。[ 78 ] K M の逆数は同じままである。一方、V max は 阻害されていない酵素と比較して減少する。ラインウィーバー・バークプロットでは、非競合阻害剤の存在は、1/ Vmax と定義される y 切片の変化によって示されます。−1/ KM と定義される x 切片は変化しません。競合阻害では、阻害剤は活性部位で酵素に結合し、基質と競合し ます。その結果、KM は 増加し、Vmax は変化 しません。[ 79 ] [ 80 ]
V 最大 1 + [ 私 ] K 私 = V 最大 [ 私 ] + K 私 K 私 {\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}} 分母にゼロを加える（[I]-[I]）
V 最大 [ 私 ] + K 私 [ 私 ] + K 私 − [ 私 ] {\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}} [I]+K iで割る
V 最大 1 1 − [ 私 ] [ 私 ] + K 私 = V 最大 − V 最大 [ 私 ] [ 私 ] + K 私 {\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}} この表記法は、反応速度が基質と相互作用する酵素集団の割合に依存するミカエリス・メンテン式と同様に、阻害剤の効果は阻害剤と相互作用する酵素集団の割合の結果であることを示している。この式の現在の形式における唯一の問題は、阻害剤結合による酵素の絶対的阻害を仮定している点である。実際には、基質回転の100%阻害から0%を超える阻害まで、幅広い効果が生じる可能性がある。[ 81 ] これを考慮するため、デルタVmax 項 を含めることで、さまざまな阻害度を許容するように式を修正することができる。
V 最大 − Δ V 最大 [ 私 ] [ 私 ] + K 私 {\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}} または
V 最大 1 − （ V 最大 1 − V 最大 2 ） [ 私 ] [ 私 ] + K 私 {\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}} この項は、阻害剤が集団内の個々の酵素と相互作用しているときに存在する残存酵素活性を定義することができます。ただし、この項を含めることで、二次V max 項が初期項よりも高い場合に活性化の可能性を考慮に入れることができるという利点があります。[ 82 ]
V 最大 1 − （ V 最大 1 − V 最大 2 ） [ X ] [ X ] + K x {\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}} この用語は、ミカエリス・メンテン式の最大速度に関連する速度論的効果を扱う簡略化された方法をもたらしますが、K M に関連する効果を記述するために使用される用語の潜在的な問題点を浮き彫りにします。基質に対する酵素の親和性に関連するK M は 、ほとんどの場合、酵素阻害剤の相互作用によって直接生じる酵素の結合部位の潜在的な変化に関連するはずです。そのため、V max を調節するために上記で提案されたものと同様の用語が、ほとんどの場合適切であるはずです。[ 83 ]
K m 1 − （ K m 1 − K m 2 ） [ X ] [ X ] + K x {\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}
不可逆阻害剤 酵素阻害剤は、通常、活性部位残基を共有結合的に修飾することによって、酵素を不可逆的に不活性化することもできます。自殺基質と呼ばれることもあるこれらの反応は、指数関数的減衰 関数に従い、通常は飽和します。飽和以下では、阻害剤に関して一次 反応速度に従います。不可逆的阻害は、2つの異なるタイプに分類できます。アフィニティーラベリングは、反応性の高い官能基が目的のタンパク質の触媒的に重要な残基を修飾して阻害を引き起こす、不可逆的阻害の一種です。一方、メカニズムに基づく阻害は、阻害剤の結合に続いて、酵素を介した変化が起こり、酵素を不可逆的に修飾する反応性基に変換されます。[ 84 ]
触媒作用のメカニズム 反応座標 の関数としてのエネルギー変化は、酵素による遷移状態の安定化を示している。酵素と基質の相互作用の好ましいモデルは誘導適合モデルである。[ 85 ] コンフォメーション変化を急速に誘発し、結合を強化すると提案している。これらの コンフォメーション 変化は、活性部位の触媒残基を、反応で変化する基質の化学結合に近づける。[ 86 ] コンフォメーション変化は、円偏光二 色性または二重偏光干渉法 を使用して測定できる。結合が起こると、1つ以上の触媒機構が、反応の代替化学経路を提供することにより、反応の遷移状態 のエネルギーを低下させる。触媒機構には、結合歪みによる触媒作用、近接と配向による触媒作用、活性部位のプロトン供与体または受容体による触媒作用、共有結合触媒作用、および量子トンネル効果 が含まれる。[ 67 ] [ 87 ] [ 88 ]
酵素反応速度論では、酵素がどの触媒作用様式を使用しているかを証明することはできません。しかし、いくつかの反応速度論データは、他の手法で検討すべき可能性を示唆することができます。たとえば、バースト相の定常状態前反応速度論を伴うピンポン機構は、この酵素の機構において共有結合触媒作用が重要である可能性を示唆します。あるいは、Vmaxには強いpH効果が見 られる がKM には見られない場合、活性部位の残基が触媒作用を起こすために特定の イオン化 状態にある必要があることを示している可能性があります。[ 89 ]
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外部リンク 酵素— Expasy酵素命名データベース ENZO ― 酵素触媒反応の速度論モデルを簡単に構築し、迅速にテストするためのWebアプリケーション。 ExCatDB — 酵素触媒機構のデータベース BRENDA — 基質、阻害剤、反応図を含む包括的な酵素データベース
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![{\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\mathrm {S} }]}{K_{M}+[{\mathrm {S} }]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/8f2f1d1e9d417b925f380340d6d3581d4006672f)
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