ジヒドロ葉酸還元酵素

DHFRは、 NADPHからジヒドロ葉酸へのヒドリド転移を触媒し、同時にプロトン化してテトラヒドロ葉酸を生成します。^{[ 11 ]}最終的に、ジヒドロ葉酸はテトラヒドロ葉酸に還元され、NADPHはNADP+に酸化されます。活性部位付近のMet20および他のループの高い柔軟性は、生成物であるテトラヒドロ葉酸の放出を促進する役割を果たします。特に、Met20ループはNADPHのニコチンアミド環を安定化させ、NADPHからジヒドロ葉酸へのヒドリド転移を促進します。^{[ 17 ]}

この酵素のメカニズムは段階的かつ定常状態のランダムである。具体的には、触媒反応はNADPHと基質が酵素の結合部位に結合することから始まり、続いて補因子NADPHから基質へのプロトン化とヒドリド転移が起こる。しかし、後者の2つのステップは同じ遷移状態では同時に起こらない。^{[ 18 ] [ 19 ]}計算と実験的手法を用いた研究で、Liuらはプロトン化ステップがヒドリド転移に先行すると結論付けている。^{[ 20 ]}

DHFRの酵素機構はpH依存性であることが示されており、特にヒドリド転移ステップはpH依存性である。pHの変化は活性部位の静電特性と残基のイオン化状態に顕著な影響を与えることが示されている。^{[ 20 ]}基質上の標的窒素の酸性度は、基質が酵素の結合部位に結合する際に重要であり、この結合部位は水と直接接触しているにもかかわらず疎水性であることが証明されている。^{[ 18 ] [ 21 ]} Asp27は結合部位で唯一の荷電親水性残基であり、Asp27の電荷の中和は酵素のpKaを変化させる可能性がある。Asp27は基質のプロトン化を助け、基質をヒドリド転移に有利なコンフォメーションに拘束することで、触媒機構において重要な役割を果たしている。^{[ 22 ] [ 18 ] [ 21 ]}プロトン化ステップはエノール互変異性化と関連していることが示されているが、この変換はプロトン供与に有利とは考えられていない。^{[ 19 ]}水分子がプロトン化段階に関与していることが証明されている。^{[ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]}水分子の酵素の活性部位への進入は、Met20 ループによって促進される。^{[ 26 ]}

DHFRによって触媒される反応の触媒サイクルには、ホロ酵素（E:NADPH）、ミカエリス複合体（E:NADPH:DHF）、三元生成物複合体（E:NADP ⁺ :THF）、テトラヒドロ葉酸二元複合体（E:THF）、およびTHF‚NADPH複合体（E:NADPH:THF）の5つの重要な中間体が含まれる。定常状態のターンオーバー中、E:NADPH:THFからE:NADPHへの生成物（THF）の解離ステップが律速段階である。^{[ 22 ]}

立体構造の変化は、DHFRの触媒機構において重要である。^{[ 27 ]} DHFRのMet20ループは、活性部位を開いたり、閉じたり、閉塞したりすることができる。^{[ 24 ] [ 18 ]}それに応じて、Met20には、開いた状態、閉じた状態、閉塞状態として分類される3つの異なる立体構造が割り当てられている。さらに、Met20の歪んだ立体構造が、その不明瞭な特性評価結果のために定義された。^{[ 24 ] Met20ループは、3つの生成物連結中間体において閉塞立体構造で観察され、ニコチンアミド環が活性部位から閉塞されている。この立体構造の特徴は、NADP +}がNADPHに置換されることが生成物の解離よりも先に起こるという事実を説明する。したがって、次の反応ラウンドは基質の結合時に起こる可能性がある。^{[ 22 ]}

R67 DHFRは、その独特な構造と触媒特性により、広く研究されています。R67 DHFRは、大腸菌染色体DHFRとは遺伝的にも構造的にも関連のない、タイプII RプラスミドコードDHFRです。これは、溶媒に露出した単一の活性部位孔を持つ222対称性を持つホモ四量体です。^{[ 28 ]}この活性部位の対称性により、酵素の結合モードが異なります。正の協同性を持つ2つのジヒドロ葉酸（DHF）分子、または負の協同性を持つ2つのNADPH分子、あるいは1つの基質と1つが結合できますが、触媒活性を持つのは後者のみです。^{[ 29 ]}大腸菌染色体DHFRと比較すると、ジヒドロ葉酸（DHF）とNADPHの結合におけるKm値が高くなっています_。触媒速度がはるかに低いことから、生成物（THF）の放出ではなく、ヒドリド転移が律速段階であることが示されています。^{[ 30 ]}

R67 DHFR構造では、ホモテトラマーが活性部位の細孔を形成します。触媒プロセスでは、DHFとNADPHが反対側から細孔に入ります。NADPHのニコチンアミド環とDHFのプテリジン環の間のπ-πスタッキング相互作用により、2つの反応物が活性部位でしっかりと結合します。しかし、結合時にDHFのp-アミノベンゾイルグルタミン酸テールの柔軟性が観察され、遷移状態の形成を促進する可能性があります。^{[ 31 ]}

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  大腸菌DHFR（EcDHFR）とR67 DHFRの反応速度論の比較
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  EcDHFRとR67 DHFRにおける基質結合の構造的差異

DHFRは細胞内のテトラヒドロ葉酸レベルに関与しており、DHFRの阻害は癌や細菌感染症に特徴的な細胞の増殖と分裂を抑制することができる。DHFRの競合阻害剤であるメトトレキサートは、DHFRを阻害する抗癌剤の1つである。^{[ 35 ]}

葉酸は成長に必要であり^{[ 36 ]}、葉酸代謝経路は癌治療の開発における標的となっている。DHFRはそのような標的の1つである。フルオロウラシル、ドキソルビシン、メトトレキサートの併用療法は、進行胃癌患者の生存期間を延長することが示されている^{[ 37 ]。DHFR}阻害剤に関するさらなる研究は、癌を治療するより多くの方法につながる可能性がある。

細菌も増殖するためにDHFRを必要とするため、細菌DHFRに選択的な阻害剤は抗菌剤として応用されている。^{[ 38 ]}トリメトプリムは、さまざまなグラム陽性細菌病原体に対して活性を示すことが示されている。^{[ 38 ]}しかし、トリメトプリムやDHFRを標的とする他​​の薬剤に対する耐性は、さまざまなメカニズムによって生じる可能性があり、治療用途の成功を制限する。^{[ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]}耐性は、DHFR遺伝子の増幅、DHFRの変異、 ^{[ 42 ] [ 43 ]}薬剤の取り込みの減少などから生じる可能性がある。いずれにせよ、トリメトプリムとスルファメトキサゾールの併用は、数十年にわたり抗菌剤として使用されてきた。^{[ 38 ]}

ピリメタミンは広く使用されている抗原虫薬である。^{[ 44 ]}

DHFR全般、特に細菌のDHFRを標的とする他​​の化合物群としては、ジアミノプテリジン、ジアミノトリアジン、ジアミノピロロキナゾリン、スチルベン、カルコン、デオキシベンゾイン、ジアミノキナゾリン、ジアミノピロロキナゾリンなどが挙げられる。

炭疽病の潜在的な治療法

炭疽菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素（BaDHFR）は、炭疽病の治療における有効な薬剤標的である。BaDHFRは、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌などの他の菌種のジヒドロ葉酸還元酵素よりもトリメトプリム類似体に対する感受性が低い。4種の菌種すべてのジヒドロ葉酸還元酵素の構造アライメントを見ると、96位と102位にそれぞれフェニルアラニンとチロシンの組み合わせを持つのはBaDHFRだけであることがわかる。

BaDHFRのトリメトプリム類似体に対する耐性は、これらの2つの残基（F96とY102）によるものであり、これらは反応速度と触媒効率の向上にも寄与している。^{[ 45 ]}現在の研究では、BaDHFRの活性部位変異体を用いて、新規抗葉酸剤阻害剤のリード最適化を誘導している。^{[ 45 ]}