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リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（MDH）は、NAD +をNADHに還元してリンゴ酸をオキサロ酢酸に可逆的に酸化する反応を触媒する酵素です。この反応は、クエン酸回路を含む多くの代謝経路の一部です。他のEC番号を持ち、リンゴ酸を酸化する他の反応を触媒する他のリンゴ酸デヒドロゲナーゼには、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（NADP +）などの修飾名があります。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼにはいくつかのアイソザイムが存在する。真核細胞には主に2つのアイソフォームが存在する。 [ 1 ] 1つはミトコンドリアマトリックスに存在し、クエン酸回路の主要酵素としてリンゴ酸の酸化を触媒する。もう1つは細胞質に存在し、リンゴ酸-アスパラギン酸シャトルを補助して還元当量を交換し、リンゴ酸がミトコンドリア膜を通過してオキサロ酢酸に変換され、さらなる細胞プロセスに利用されるようにする。[ 2 ]
ヒトおよび他のほとんどの哺乳類は、以下の2種類のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを発現する。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼファミリーには、L-乳酸デヒドロゲナーゼとL-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。L-乳酸デヒドロゲナーゼは、嫌気性解糖の最終段階であるL-乳酸からピルビン酸への変換を触媒する。N末端はロスマンNAD結合フォールドであり、C末端は珍しいα+βフォールドである。[ 3 ] [ 4 ]
ほとんどの生物では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）はホモ二量体分子として存在し、構造的には乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）と密接に関連しています。これは、30～35 kDaのサブユニットを持つ大きなタンパク質分子です。 [ 5 ]アミノ酸配列に基づくと、MDHはミトコンドリアアイソザイムまたは細胞質/葉緑体アイソザイムのいずれかに非常によく似た2つの主要な系統発生グループに分岐したようです。[ 6 ]ミトコンドリアのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの配列同一性は、細胞質アイソザイムと比較して原核生物の祖先に非常によく関連しているため、ミトコンドリアと葉緑体が細胞内共生によって発達したという理論はもっともらしいです。[ 7 ]古細菌のMDHのアミノ酸配列は、他の生物のMDHよりもLDHのアミノ酸配列に類似しています。これは、乳酸デヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼの間に進化的な関連性がある可能性を示唆している。[ 8 ]
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ二量体の各サブユニットは、構造と機能が異なる2つの異なるドメインを持っています。平行βシート構造がNAD+結合ドメインを構成し、4つのβシートと1つのαヘリックスが中央のNAD +結合部位を構成しています。サブユニットは、広範な水素結合と疎水性相互作用によって結合されています。[ 9 ]
リンゴ酸デヒドロゲナーゼには、酵素の触媒活性において重要な役割を果たす可動ループ領域があることも示されています。研究によると、基質結合後にこのループ領域が開いた構造から閉じた構造に変化することで、基質と触媒アミノ酸が溶媒から遮蔽され、MDHの触媒作用が強化されることが示されています。また、このループ領域はリンゴ酸デヒドロゲナーゼにおいて高度に保存されていることも示されています。[ 6 ]
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性部位は、基質とその補酵素であるNAD +の特異的な結合部位を持つタンパク質複合体内の疎水性空洞です。活性状態では、MDHは基質を包み込むような立体構造変化を起こし、溶媒への露出を最小限に抑え、重要な残基を基質により近い位置に配置し直します。[ 6 ]特に触媒三残基を構成する3つの残基は、プロトン伝達システムとして協働するヒスチジン（His-195）、アスパラギン酸（Asp-168）、および基質を固定するアルギニン（Arg-102、Arg-109、Arg-171）です。[ 10 ]
機構的には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、NAD + を電子受容体として利用して、リンゴ酸のヒドロキシル基の酸化を触媒します。この酸化ステップにより、基質からプロトンとヒドリドイオンが除去されます。NAD + はヒドリドイオンを受け取り（具体的には、ヒドリドイオンは NAD +のニコチンアミド環に転移されます）、NADH に還元されます。同時に、酵素上の His-195 残基がプロトンを受け取ります。[ 11 ]基質の塩基触媒に関与する正電荷を帯びた His-195 残基は、隣接する負電荷を帯びた Asp-168 残基によって安定化されます。この静電的安定化により、プロトンの移動が促進されます。[ 1 ] Arg-102、Arg-109、および Arg-171 (これらはプロトン化されており、正に帯電している) は静電触媒作用に関与し、基質の負に帯電したカルボキシレートに結合するのに役立つ。さらに、酵素上のアルギニン残基は、アルギニンアミノ酸残基のグアニジニウム側鎖と基質のカルボキシレートとの間の水素結合を介して、追加の基質特異性と結合を提供する。[ 12 ]
研究では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの触媒活性に関与する可動ループも特定されている。このループは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ：補酵素複合体が基質に結合すると、基質と触媒アミノ酸を溶媒から遮蔽するために構造変化を起こす。ループが上向きに反転して活性部位を覆うことで、酵素上の触媒的に重要なアミノ酸残基と基質との相互作用も促進される。さらに、このループの動きは、酵素の律速段階と相関することが示されている。[ 13 ]
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、リンゴ酸からオキサロ酢酸への相互変換を触媒します。クエン酸回路では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはオキサロ酢酸の再生を触媒する役割を担っています。この反応は、リンゴ酸のヒドロキシル基の酸化とNAD +の還元によって起こります。ヒドリドイオンのNAD +への転移のメカニズムは、乳酸デヒドロゲナーゼやアルコールデヒドロゲナーゼに見られるのと同様のメカニズムで行われます。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのΔG'°は+29.7 kJ/mol、ΔG（細胞内）は0 kJ/molです。[ 11 ]
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、より小さな分子からグルコースを合成する糖新生にも関与しています。ミトコンドリア内のピルビン酸は、ピルビン酸カルボキシラーゼによってオキサロ酢酸（クエン酸回路の中間体）に作用されます。オキサロ酢酸をミトコンドリアから取り出すために、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはそれをリンゴ酸に還元し、その後、ミトコンドリア内膜を通過します。細胞質に入ると、リンゴ酸は細胞質リンゴ酸デヒドロゲナーゼによって再びオキサロ酢酸に酸化されます。最後に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）がオキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸（PEP）に変換します。[ 14 ]
速度論的研究によると、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は順序付けられている。補因子NAD + /NADHは基質よりも先に酵素に結合する。[ 15 ]リンゴ酸のKm値、すなわち酵素活性が最大活性の半分となる濃度は2 mMである。Kcat値は259.2 s −1である。[ 16 ]
さらに、pH レベルは、触媒機構におけるプロトン移動により、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによる基質結合の特異性を制御する。[ 17 ] pK 値が 7.5 のヒスチジン部分が、酵素の pH 依存性に関与していると考えられている。研究によると、エノール型のオキサロ酢酸とリンゴ酸デヒドロゲナーゼ:NADH 複合体との結合は、pH 値が高いほどはるかに速く形成されることが示されている。[ 12 ]さらに、L-リンゴ酸のリンゴ酸デヒドロゲナーゼへの結合は、アルカリ性条件下で促進される。その結果、非プロトン化型のリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、L-リンゴ酸とオキサロ酢酸のエノール型に優先的に結合する。対照的に、D-リンゴ酸、ヒドロキシマロン酸、およびオキサロ酢酸のケト型は、酵素のプロトン化型にのみ結合することがわかっている。具体的には、ヒスチジンがプロトン化されると、His残基は基質のカルボニル酸素と水素結合を形成でき、これにより電子密度が酸素から遠ざかり、ヒドリドによる求核攻撃を受けやすくなります。これにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼがこれらの基質に結合することが促進されます。結果として、低いpH値では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはD-リンゴ酸、ヒドロキシマロン酸、およびケトオキサロ酢酸に優先的に結合します。[ 18 ]
リンゴ酸デヒドロゲナーゼはクエン酸回路と密接に関連しているため、クエン酸はL-リンゴ酸とNAD +の濃度に応じてリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアロステリック調節因子であると研究で提唱され、実験的に実証されている。これは、高濃度のオキサロ酢酸とL-リンゴ酸におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの反応速度論的挙動に見られる変化によるものと考えられる。実験では、クエン酸がリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をアロステリックに活性化および阻害できることが示されている。クエン酸は、L-リンゴ酸とNAD +の濃度が低い場合にL-リンゴ酸の酸化を阻害することが示されている。しかし、リンゴ酸とNAD +の濃度が高い場合、クエン酸はオキサロ酢酸の生成を促進することができる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは一般的に可逆酵素と考えられているが、クエン酸が結合して反応平衡をどちらの方向にも駆動できるアロステリック調節部位が酵素上に存在すると考えられている。[ 19 ]
グルタミン酸はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害することも示されています。さらに、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼはミトコンドリアのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと相互作用して複合体を形成し、それがリンゴ酸デヒドロゲナーゼに結合して三元複合体を形成し、グルタミン酸によるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対する阻害作用を逆転させることが示されています。加えて、この複合体の形成により、グルタミン酸はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を妨害することなくアミノトランスフェラーゼと反応することができます。この三元複合体の形成は、オキサロ酢酸がリンゴ酸デヒドロゲナーゼからアミノトランスフェラーゼへ放出されることも促進します。速度論的には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼがα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとアミノトランスフェラーゼの二元複合体に結合すると、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの反応速度が増加することが示されています。これは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼがこの複合体の一部として結合すると、Km値が低下するためです。[ 20 ]
以下の遺伝子、タンパク質、代謝物をクリックすると、それぞれの記事にリンクします。[ §1 ]
