ハンマーヘッドリボザイム

ハンマーヘッドリボザイムは、RNA分子内の特定の部位で可逆的な切断および連結反応を触媒するRNAモチーフである。これは、自然界に存在することが知られているいくつかの触媒RNA（リボザイム）の1つである。これは、RNAの構造と特性に関する研究のモデルシステムとして機能し、標的RNA切断実験に使用され、その一部は治療への応用が提案されている。初期の二次構造図がハンマーヘッドシャークに似ていることから名付けられたハンマーヘッドリボザイムは、^[1]もともと植物ウイルス様RNAの2つのクラス、サテライトRNAとウイロイドで発見された。これらは、レトロザイムを含む レトロトランスポゾンのいくつかのクラスでも知られている。^[2]ハンマーヘッドリボザイムモチーフは、生命の樹全体の系統で普遍的に報告されている。^{[3] [4]}

1986年に初めて報告された自己切断反応^{[5] [6]は、}ローリングサークル複製機構の一部です。ハンマーヘッド配列は自己切断に十分であり^[7]、保存された3次元三次構造を形成することによって作用します。

ハンマーヘッド RNA モチーフは、自然な状態では 1 本の RNA 鎖です。切断はタンパク質酵素が存在しない状態で行われますが、ハンマーヘッド RNA 自体は、反応によって消費される (つまり、自己切断を行う) ため、自然な状態では触媒ではなく、複数のターンオーバーを触媒することはできません。

トランスアクティングハンマーヘッド構造は、相互作用する2本のRNA鎖から構成されるように設計することができ、一方の鎖は、もう一方の鎖を切断するハンマーヘッドリボザイムを構成する。^{[8] [引用が必要]}切断される鎖は過剰に供給することができ、複数のターンオーバーが実証され、ミカエリス・メンテン速度論に従うことが示される。 ^{[8] [引用が必要]これは、}タンパク質酵素速度論の典型である。このような構造は、通常、in vitro実験に使用され、「ハンマーヘッドRNA」という用語は、実際には、より頻繁に使用される「ハンマーヘッドリボザイム」と同義になっている。

触媒活性のある最小限のトランスアクティングハンマーヘッドリボザイム配列は、図に示すように、15 個の保存された（ほとんどが不変の）ヌクレオチドの中心核を挟む 3 つの塩基対のステムで構成されています。保存された中心塩基は、いくつかの例外を除き、リボザイムの触媒活性に不可欠です。このようなハンマーヘッドリボザイム構造は、in vitro で約 1 分子/分のターンオーバー速度（k _cat）と10 ナノモルのオーダーの K _{m を示します。}

ハンマーヘッド リボザイムは、おそらく最もよく特徴づけられたリボザイムです。その小さなサイズ、徹底的に研究された切断化学、既知の結晶構造、そしてその生物学的関連性により、ハンマーヘッド リボザイムは、RNA 触媒の基本的な性質に関する生化学的および生物物理学的研究に特に適しています。

ハンマーヘッド型リボザイムは、治療薬、特定のRNA配列を調整する酵素、バイオセンサー、機能ゲノミクスや遺伝子発見への応用など、重要な役割を果たす可能性がある。 ^[9]

ハンマーヘッドリボザイムHH9
HH9リボザイムの予測される二次構造と配列の保存性がトカゲからヒトゲノムまで保存されていることがわかった
識別子
シンボル	HH9
Rfam	RF02275
その他のデータ
RNAタイプ	遺伝子;リボザイム
ドメイン	真核生物
それで	0000380 00000000
PDB構造	PDBe

1986年、最初のハンマーヘッド型リボザイムが、ウイロイドやウイルスサテライトなどのRNA植物病原体で発見されました。^{[5] [6]} 1年後、ハンマーヘッド型リボザイムはイモリゲノムのサテライトDNAでも報告されました。^{[10]その後、このリボザイムの新しい例が、住血吸虫、 [11]}洞窟コオロギ、^[12] シロイヌナズナ ^[13]などの無関係な生物や、げっ歯類やカモノハシなどのいくつかの哺乳類のゲノムで発見されました。 ^[14] 2010年には、ハンマーヘッド型リボザイムが、ヒトを含むさまざまな細菌や真核生物のゲノムに存在することが判明しました。 ^{[15] [16]}同様の報告によりこれらの観察結果が確認され、拡張され、^{[17] [18] [19]}ハンマーヘッドリボザイムがあらゆる生命界に遍在する触媒RNAであることが明らかになった。^[20]

真核生物のハンマーヘッド型リボザイムのほとんどは、小さな環状RNAとして発現するレトロザイムと呼ばれる一種の短い散在レトロエレメント（SINE）に関連しています。 ^{[21]しかし、すべての有}羊膜類のゲノムには、驚くほど保存されたハンマーヘッドの例外的なグループが見つかります。^[16]これらのハンマーヘッド型リボザイム（いわゆるHH9 ^{[22] [循環参照]}およびHH10 ^{[23] [循環参照]}）は、いくつかの特定の遺伝子のイントロンに存在し、premRNA生合成中に保存された生物学的役割を示しています。^[24] 2021年には、多様な動物からの環状RNAの新しいD型肝炎ウイルスゲノムが、植物ウイロイドやウイルスサテライトに存在するものと同様のハンマーヘッド型リボザイムをコードすることがわかりました。^[25]世界中のデルタウイルス様病原体の大規模なバイオインフォマティクス検索により、ハンマーヘッドモチーフを持つ環状RNAゲノムの例が数百件発見され、このリボザイムだけでなく、リボザイムを含む小さな環状RNAが生物圏に遍在する分子であることが示唆されました。^[26]

ハンマーヘッド型リボザイムは、RNA の基質鎖、具体的には切断部位ヌクレオチドである C17 を切断する非常に単純な化学反応を実行します。RNA 切断は加水分解と呼ばれることが多いですが、実際に使用されるメカニズムには水の添加は含まれません。むしろ、切断反応は、連結ホスホジエステル結合の再配置からなる異性化にすぎません。化学的には、ランダム塩基媒介 RNA 分解で発生する反応と同じですが、非常に部位特異的であり、速度が 10,000 倍以上加速されます。

開裂反応は、開裂部位リボースの2'-ヒドロキシルプロトンが 2'-酸素から引き抜かれることによって開始されるホスホジエステル 異性化反応であり、これが「インライン」またはS _N 2(P)様反応で攻撃核剤となるが、このプロトンがハンマーヘッド開裂反応の化学ステップの前に除去されるのか、それとも化学ステップ中に除去されるのかはわかっていない。(開裂反応は厳密には二分子反応ではないが、純粋な S _N 2(P) 反応と同じように挙動する。つまり、五配位オキシホスフランからなる会合遷移状態を形成した後に構成が反転する。) 攻撃基酸素と脱離基酸素は両方とも、S _{N 2 様反応機構に必要な}三方両錐遷移状態構造の 2 つの軸位置を占める。

この切断反応機構の結果として、5' 生成物は 2',3' 環状リン酸末端を持ち、3' 生成物は 5'-OH 末端を持ちます (RNA の非酵素的アルカリ切断の場合と同様)。切断可能なリン酸はリン酸ジエステルのままであるため、反応は可逆的であり、 ATPまたは同様の外因性エネルギー源を必要とせずに、ハンマーヘッド RNA 媒介ライゲーションの基質として機能する可能性があります。^[27]ハンマーヘッド型リボザイム触媒反応は、形式的には同一の非酵素的アルカリRNA切断とは異なり、測定された特定のハンマーヘッド型リボザイム構造の配列に応じて、pH 7.5、10 mM Mg ²⁺（いわゆる最小ハンマーヘッド型RNA配列の「標準反応条件」）で1分間に酵素分子あたり基質分子約1分子という典型的なターンオーバー速度を伴う、高度に配列特異的な切断反応である。これは、RNAの非酵素的切断に比べて約10,000倍の速度向上を表す。

すべてのリボザイムは、もともと金属酵素であると考えられていました。Mg ²⁺のような二価金属イオンには、RNAの適切な折り畳みを促進し、触媒コアを形成するという2つの役割があると考えられていました。^[28] RNA自体には官能基の十分なバリエーションが含まれていないため、金属イオンは、タンパク質について知られているように、活性部位で役割を果たすと考えられていました。Mg2+イオンの提案されたメカニズムは、リン酸切断部位のプロR酸素に結合したマグネシウム・アクア・ヒドロキシ複合体による2'-OH基の脱プロトン化、続いて得られた2'-アルカオキシドの切断可能なリン酸への求核攻撃により、5配位リン酸中間体が形成されるというものでした。最後のステップは、5'脱離基の離脱であり、反転配置の2',3'-環状リン酸が生成されます。^[29]

水酸化マグネシウムと平衡状態にある六水和マグネシウム イオンは、 RNase Aの2 つのヒスチジンが果たす役割と同様に、一般的な酸と一般的な塩基の役割を果たす可能性があると推定されました。二価金属イオンの追加の役割として、遷移状態の静電的安定化の形での提案もあります。

1998年に、ハンマーヘッドリボザイム、VSリボザイム、ヘアピンリボザイムは、RNAが折り畳まれるのに十分な濃度の一価カチオンが存在する限り、触媒に金属イオンを必要としないことが発見されました^[30 ]。この発見は、RNA自体が、化学的に活性な二価金属イオンの結合のための不活性で受動的な足場として機能するのではなく、むしろそれ自体が触媒化学に深く関与していることを示唆しています。以下に説明する最新の構造結果は、確かに、2つの不変ヌクレオチド、G12とG8が、ハンマーヘッド切断反応における一般的な塩基と一般的な酸としての役割と一致して配置されていることを確認しています。

したがって、厳密に言えば、ハンマーヘッドリボザイムは金属酵素ではない。

自己切断反応に必要な最小限のハンマーヘッド配列には、約 13 個の保存されたまたは不変の「コア」ヌクレオチドが含まれており、そのほとんどは標準的なワトソン-クリック塩基対の形成には関与しません。コア領域はステム I、II、III に挟まれており、これらは一般に標準的なワトソン-クリック塩基対で構成されていますが、それ以外は配列に関して制約はありません。最小限のハンマーヘッド リボザイムの触媒回転率は、高 Mg 2+ (~10 mM)、pH 7.5、25 °C の標準反応条件下で ~ 1/分 (非保存配列と 3 つのらせんステムの長さに応じて、0.1/^分から10/分の範囲が一般的に観察されます) です。ハンマーヘッド リボザイムで行われた実験の多くは、最小限の構成を使用していました。

ハンマーヘッドリボザイム（タイプI）
Hammerhead_1の予測される二次構造と配列の保存性
識別子
シンボル	ハンマーヘッド_1
Rfam	RF00163
その他のデータ
RNAタイプ	遺伝子;リボザイム
ドメイン	ウイロイド;真核生物
それで	0000380 00000000
PDB構造	PDBe

ハンマーヘッドリボザイム（タイプIII）
ハンマーヘッドリボザイム（タイプ III）の予測される二次構造と配列の保存性
識別子
シンボル	ハンマーヘッド_3
Rfam	RF00008
その他のデータ
RNAタイプ	遺伝子;リボザイム
ドメイン	ウイロイド;真核生物
それで	0000380 00000000
PDB構造	PDBe

構造的には、ハンマーヘッドリボザイムは、保存された配列の短いリンカーによって分離された 3 つの塩基対ヘリックスで構成されています。これらのヘリックスは、I、II、III と呼ばれます。ハンマーヘッドリボザイムは、5' 末端と 3' 末端がどのヘリックスにあるかに基づいて 3 つのタイプに分類できます。配列の 5' 末端と 3' 末端がステム I に寄与する場合はタイプ I ハンマーヘッドリボザイム、ステム II に寄与する場合はタイプ II、ステム III に寄与する場合はタイプ III ハンマーヘッドリボザイムです。3 つの可能なトポロジカルタイプのうち、タイプ I は原核生物、真核生物、RNA 植物病原体のゲノムに見られますが、タイプ II は原核生物でのみ説明されています^{[18] [19]}。タイプ III は主に植物、植物病原体、原核生物に見られます。^{[20] [24]}

全長ハンマーヘッドリボザイムは、ステムIとIIに追加された配列要素で構成されており、これにより追加の三次接触が形成される。三次相互作用はリボザイムの活性コンフォメーションを安定化させ、対応する最小ハンマーヘッド配列よりも最大1000倍の切断率をもたらす。^{[31] [32]}

最小ハンマーヘッドリボザイムは、生化学者や酵素学者だけでなく、X線結晶学者、NMR分光学者、その他の生物物理学的技術の専門家によって徹底的に研究されてきました。ハンマーヘッドリボザイムの最初の詳細な3次元構造情報は、DNA基質類似体に結合したハンマーヘッドリボザイムのX線結晶構造の形で1994年にPley、Flaherty、McKayによってNatureに発表されました。 [ ^33]その後、全RNAの最小ハンマーヘッドリボザイム構造が、1995年初頭にScott、Finch、KlugによってCellに発表されました。 ^[34]

最小のハンマーヘッド型リボザイムは、結晶構造に示されているように、保存された配列の短いリンカーで分離された3つの塩基対ヘリックスで構成されています。^[34]これらのヘリックスは、I、II、IIIと呼ばれます。保存されたウリジンターンはヘリックスIをヘリックスIIにリンクし、通常はCUGA配列を含みます。ヘリックスIIとIIIは、GAAA配列によってリンクされています。切断反応はヘリックスIIIとIの間で起こり、通常はCです。

全長リボザイムの構造は、ステムIIのループとステムIの間に広範な相互作用があることを示している。^[35]

同様の構造は、ハチェットリボザイムなどの他のリボザイムでも観察されます。

結晶格子パッキング接触が必然的に 3 つの両側のらせん状ステムすべての遠位末端の全体的な位置を限定する最小のハンマーヘッド配列の結晶におけるハンマーヘッド型リボザイムの触媒作用の観察にもかかわらず、遷移状態相互作用と触媒化学を調べるために設計された多くの生化学実験は結晶構造と矛盾しているように見えました。

例えば、最小ハンマーヘッド型リボザイムの不変コア残基 G5、G8、G12、および C3 はそれぞれ非常に脆弱であることが観察されており、これらのヌクレオチドのいずれか 1 つで環外官能基を 1 つ変更するだけでも触媒活性が劇的に低下または消失しますが、生成物構造の G-5 相互作用を除き、これらの残基のうち、最小ハンマーヘッド型構造のいずれにおいても、これらのヌクレオチド塩基のワトソン-クリック面を含む水素結合を形成するものはほとんどないようでした。

特に印象的で、つい最近になって観察された例は、酸塩基触媒の可能性のある参加者として特定された G8 と G12 です。ハンマーヘッド RNA が触媒に二価金属イオンを必要としないことが実証されると、受動的に結合した二価金属イオンではなく、RNA 自体がハンマーヘッド リボザイム活性部位の酸塩基化学に直接的な化学的役割を果たしているに違いないことが徐々に明らかになりました。しかし、最小のハンマーヘッド リボザイムの元の構造を考えると、G12 と G8 がこれをどのように達成できるかはまったく不明でした。

その他の懸念事項としては、 NMR特性評価中にも観察された、切断されたハンマーヘッド型リボザイムの U4 と U7 間のNOEが挙げられ、これはこれらのヌクレオチド塩基が約 6 Å より接近している必要があることを示唆しているが、結晶構造から U7 と U4 の接近は不可能と思われる。最後に、前述のように、元の構造の攻撃核剤である C17 の 2'-OH は、隣接する切断可能なリン酸へのインライン攻撃を受けやすい位置になかった。

おそらく最も心配なのは、二重ホスホロチオエート置換とソフト金属イオン救出実験に基づいて、遷移状態では A-9 と切断可能なリン酸が互いに約 4 Å 以内に来なければならないことを示唆する実験でした。最小のハンマーヘッド結晶構造におけるこれらのリン酸間の距離は約 18 Å で、ステム II とステム I A 型ヘリックスを剛体として扱った場合、接近するための明確なメカニズムはありませんでした。総合すると、これらの結果は、最小のハンマーヘッド リボザイム構造内で遷移状態に到達するために、かなり大規模な構造変化が起こったに違いないことを示唆しているように思われます。

これらの理由から、2 つの実験セット (生化学と結晶学) は矛盾しているだけでなく、完全に、そして絶望的に両立不可能であるように思われ、この分野でかなりの不和を生み出しました。どちらかの実験セットの結果を否定する説得力のある証拠はこれまで一度も提示されていませんでしたが、それぞれを支持する反対の主張は数多くなされました。

2006 年に、全長ハンマーヘッド型リボザイムの 2.2 Å 解像度の結晶構造が得られました。この新しい構造 (右に表示) は、これまでの矛盾の中で最も懸念されていた問題を解決したようです。特に、C17 はインライン攻撃用に配置され、不変残基 C3、G5、G8、および G12 はすべて、触媒に関連する重要な相互作用に関与しているようです。さらに、A9 と切断可能なリン酸は 4.3 Å 離れていることが観察されており、これは、これらのリン酸が修飾されると、単一のチオフィリック金属イオンと結合できるという考えと一致しています。この構造は、2 つの不変残基 G-12 と G-8 が、酸/塩基触媒で以前に提案された役割と一致して、活性部位内でどのように配置されているかを明らかにしています。 G12 は、切断反応における求核剤である C17 の 2'-O と水素結合できる距離内にあり、G8 のリボースは脱離基 5'-O と水素結合します (下記参照)。一方、G8 のヌクレオチド塩基は不変の C3 とワトソン-クリック対を形成します。この配置から、G12 が切断反応における一般的な塩基であり、G8 が一般的な酸として機能する可能性があることが示唆され、これは以前の生化学的観察と一致しています。G5 は C17 のフラノース酸素と水素結合し、インライン攻撃に適した位置に配置します。G8 と C3 の間で塩基対が形成された結果、U4 と U7 は、それらの塩基間の NOE が簡単に説明できる位置に配置されます。

したがって、全長ハンマーヘッド型リボザイムの結晶構造は、最小ハンマーヘッド型リボザイムの以前の結晶構造では解決不可能と思われていた主要な懸念事項のすべてを明確に解決しています。

全長ハンマーヘッド型リボザイムの三次相互作用は、活性構造と強く思われるものを安定化します。求核剤である切断部位ヌクレオチド C17 の 2'-酸素は、インライン攻撃 (S _N 2(P) 反応) に対してほぼ完璧に整列しています。G12 はこの求核剤の水素結合距離内に位置しているため、G12 自体が脱プロトン化されると、2'-酸素からプロトンを引き抜くことができます。G8 の 2'-OH は 5'-脱離基酸素と水素結合を形成するため、A1.1 のリボースの 5'-酸素に負電荷が蓄積すると、潜在的にプロトンを供給する可能性があります。

最も可能性の高い説明は、脱プロトン化された形の G12 が一般的な塩基であり、G8 のリボースが一般的な酸であるということです。ハンマーヘッド リボザイムの見かけの運動 pKa ^{[説明が必要]}は 8.5 ですが、グアノシンの pKa は約 9.5 です。ハンマーヘッド触媒コアで G12 の pKa が 9.5 から 8.5 に変化している可能性があり、この仮説は現在、集中的に調査されています。

不変の G8 が C8 に変更されると、ハンマーヘッド触媒は無効になります。ただし、全長のハンマーヘッドに見られる G8-C3 塩基対を維持する G8C + C3G 二重変異体は、触媒活性のほとんどを回復します。G8 の 2'-OH も触媒に不可欠であることが観察されています。G8 をデオキシ G8 に置き換えると、触媒速度が大幅に低下します。これは、2'-OH が触媒メカニズムに非常に重要であることを示しています。

A9 と切断可能なリン酸が接近するには、高濃度の正電荷が必要です。これが、イオン強度が低い場合は二価金属イオンが必要であるが、一価陽イオンの濃度が高い場合は不要であるという観察結果の根拠であると考えられます。

したがって、この反応はおそらく C17 から 2'-プロトンを引き抜き、続いて隣接するリン酸への求核攻撃を伴います。切断可能なリンと 5'-O 脱離基の間の結合が切断され始めると、G8 のリボースからプロトンが供給され、結晶構造内で水素結合することが観察される水分子を犠牲にして、プロトンが再付加されると考えられます。

改変ハンマーヘッドリボザイムは治療薬として試験されている。^[36] 変異SOD1 mRNAに相補的な配列とハンマーヘッド触媒構造を形成するために必要な配列を含む合成RNAは、筋萎縮性側索硬化症の治療法として研究されている。また、これらがHIV耐性T細胞株の作製に使用できるかどうかを調べる研究も行われている。改変ハンマーヘッドリボザイムアデノウイルスは、in vitroおよびin vivoの両方で癌治療に効果があることが実証されている。^[37]

トランス開裂型ハンマーヘッド型リボザイムの治療への応用は、生体内での活性が低いために大きく妨げられてきた。トランス開裂型ハンマーヘッド型リボザイムの真の触媒能力は生体内で回復する可能性があり、治療用誘導体は他の核酸ハイブリダイゼーション治療戦略を補完する可能性がある。すでに臨床応用に近いハンマーヘッド型リボザイムが存在する。^[9]

• ビル・スコットのハンマーヘッドリボザイムに関する研究室のページ 2011-09-29 にWayback Machineでアーカイブ
• マルコス・デ・ラ・ペーニャのハンマーヘッドリボザイムに関する研究室ページ
• Rfamの Hammerhead タイプ I のページ
• Rfamの Hammerhead タイプ II のページ
• Rfamの Hammerhead タイプ III のページ
• Rfamの Hammerhead HH9 のページ
• Rfamの Hammerhead HH10 のページ