分光光度計

分光光度計は、物質の反射または透過特性を波長の関数として定量的に測定する電磁分光法の分野です。 ^{[2]分光光度計では、分光光度計と呼ばれる}光度計を使用して、さまざまな波長の光線の強度を測定できます。分光光度計は、紫外線、可視光線、赤外線に最も一般的に適用されますが、最新の分光光度計は、 X線、紫外線、可視光線、赤外線、マイクロ波の波長を含む電磁スペクトルの広い範囲を調べることができます。

分光光度計は、有色化合物が吸収する光の量に応じて分子を定量的に分析するツールです。分光光度計の重要な機能は、スペクトル帯域幅 (テスト サンプルを透過できる色の範囲)、サンプル透過率、サンプル吸収の対数範囲、および場合によっては反射率測定のパーセンテージです。

分光光度計は、溶液、透明または不透明の固体（研磨ガラスなど）、またはガスの透過率または反射率の測定によく使用されます。多くの生化学物質は色がついており、可視光を吸収するため比色法で測定できますが、無色の生化学物質でも、発色反応に適した色の化合物に変換して比色分析に適した化合物を生成できる場合がよくあります。^{[3] : 65}ただし、異なる制御と較正を使用して、通常約 200～2500 nm をカバーする、記載されている光範囲のいずれかで拡散率を測定するように設計することもできます。^{[2]これらの光の範囲内では、}測光測定の波長に応じてタイプが異なる標準を使用して、機械の較正が必要です。^[4]

分光光度法が使用される実験の一例は、溶液の平衡定数の決定です。溶液内の特定の化学反応は、反応物が生成物を形成し、生成物が反応物に分解される順方向および逆方向に発生することがあります。ある時点で、この化学反応は平衡点と呼ばれるバランスのとれた点に到達します。この時点での反応物と生成物のそれぞれの濃度を決定するには、分光光度法を使用して溶液の光透過率をテストできます。溶液を通過する光の量は、光を透過させない特定の化学物質の濃度を示します。

光の吸収は、分子の電子モードおよび振動モードと光の相互作用によるものです。分子の種類ごとに、化学結合と原子核の構成に関連した個別のエネルギーレベルのセットがあり、特定の波長またはエネルギーの光を吸収して、独自のスペクトル特性をもたらします。^[5]これは、分子の特定の異なる構成に基づいています。

分光光度計の使用は、物理学、材料科学、化学、生化学、化学工学、分子生物学など、さまざまな科学分野にわたります。^[6]分光光度計は、半導体、レーザーおよび光学製造、印刷、法医学検査などの多くの産業や、化学物質の研究室で広く使用されています。分光光度計は、酵素活性の測定、タンパク質濃度の決定、酵素速度定数の決定、リガンド結合反応の測定によく使用されます。^{[3] ：65}最終的に、分光光度計は、制御または較正に応じて、観測された波長の計算を通じて、ターゲットに存在する物質とその正確な量を決定することができます。

天文学において、分光測光法という用語は、天体のスペクトルを測定することを指し、スペクトルのフラックススケールは、通常は分光測光標準星の観測結果と比較して波長の関数として較正され、地球の大気による光の吸収が補正されます。^[7]

1940年にアーノルド・O・ベックマン氏によって発明された分光光度計^{[異論あり–議論]は、1935年に設立された彼の会社National Technical Laboratoriesの同僚の協力を得て開発されました。この会社は後にBeckman Instrument Companyとなり、最終的には}Beckman Coulterとなりました。これは、紫外線を適切に吸収できなかった従来の分光光度計の解決策となりました。彼はまず、紫外線を吸収するためにガラスプリズムを使用するモデルAを発明しました。これでは満足のいく結果が得られなかったため、モデルBでは、より優れた吸光度結果が得られるガラスプリズムから石英プリズムに変更されました。そこから、波長分解能を調整したモデルCが誕生し、最終的に3台が製造されました。最後の最も人気のあるモデルはモデルDで、現在ではDU分光光度計として知られています。これには、計器ケース、紫外線連続光の水素ランプ、より優れたモノクロメーターが含まれていました。^[8] 1941年から1976年にかけて製造され、1941年の価格は723ドルだった（遠紫外線アクセサリは追加料金でオプションだった）。ノーベル化学賞受賞者のブルース・メリフィールドの言葉によれば、これは「おそらくバイオサイエンスの進歩に向けて開発された最も重要な機器」だった。^[9]

1976年に製造中止になった後、^[10] ヒューレット・パッカード社は1979年にHP 8450Aとして知られる初の市販ダイオードアレイ分光光度計を開発した。^[11]ダイオードアレイ分光光度計は、ベックマンが開発したオリジナルの分光光度計とは異なり、数秒で一度に複数の波長をスキャンする初のシングルビームマイクロプロセッサ制御分光光度計であった。サンプルに多色光を照射し、サンプルはその特性に応じて光を吸収する。次に、その光はスペクトルの波長領域を検出するフォトダイオードアレイの格子によって反射される。^[12]それ以来、分光光度計の開発と実装は飛躍的に増加し、現代の最も革新的な機器の1つとなった。

装置には、シングルビームとダブルビームの 2 つの主要なクラスがあります。ダブルビーム分光光度計^[13]は、2 つの光路間の光強度を比較します。一方の光路には参照サンプルが含まれ、もう一方の光路にはテストサンプルが含まれます。シングルビーム分光光度計は、テストサンプルを挿入する前と挿入した後のビームの相対的な光強度を測定します。ダブルビーム機器による比較測定はより簡単で安定していますが、シングルビーム機器はダイナミック レンジが広く、光学的にシンプルでコンパクトです。さらに、顕微鏡や望遠鏡に組み込まれた分光光度計などの一部の特殊な機器は、実用性のためにシングルビーム機器です。

歴史的に、分光光度計は、分析スペクトルを生成するために回折格子を含むモノクロメータを使用しています。格子は、可動式または固定式です。光電子増倍管やフォトダイオードなどの単一の検出器を使用する場合、格子を段階的にスキャンして (走査型分光光度計)、検出器が各波長 (各「ステップ」に対応) の光の強度を測定できるようにします。電荷結合素子(CCD) やフォトダイオード アレイ(PDA) などの検出器のアレイ (アレイ分光光度計) も使用できます。このようなシステムでは、格子は固定されており、各波長の光の強度はアレイ内の異なる検出器によって測定されます。さらに、最新の中赤外線分光光度計のほとんどは、スペクトル情報を取得するためにフーリエ変換技術を使用しています。この技術は、フーリエ変換赤外分光法と呼ばれます。

透過率測定を行う際、分光光度計は基準溶液と試験溶液を通過する光の割合を定量的に比較し、次に 2 つの信号の強度を電子的に比較して、基準標準と比較したサンプルの透過率を計算します。反射率測定では、分光光度計は基準サンプルと試験サンプルから反射する光の割合を定量的に比較します。光源ランプからの光はモノクロメータを通過し、モノクロメータは回転プリズムを通して光を「虹」のような波長に回折し、モノクロメータの出力側にある機械的なスリットを通してこの回折スペクトルの狭い帯域幅を出力します。これらの帯域幅は試験サンプルを透過します。次に、透過または反射された光の光子束密度 (通常は平方メートルあたりのワット数) がフォトダイオード、CCD、またはその他の光センサーで測定されます。次に、試験サンプルの各波長の透過率または反射率の値が、基準サンプルの透過率または反射率の値と比較されます。ほとんどの計測器は、線形透過率比に対数関数を適用してサンプルの「吸光度」を計算します。この値は、測定対象の化学物質の「濃度」に比例します。

簡単に言うと、走査型分光光度計における一連のイベントは次のようになります。

1. 光源はモノクロメーターに照射され、虹色に回折され、2 つのビームに分割されます。その後、サンプルと参照溶液を通してスキャンされます。
2. 入射波長の一部はサンプルと参照を透過するか、または反射されます。
3. 結果として生じた光は光検出装置に当たり、2 つのビームの相対的な強度を比較します。
4. 電子回路は相対電流を線形透過率および/または吸光度/濃度値に変換します。

アレイ分光光度計では、シーケンスは次のようになります。^[14]

1. 光源はサンプルに照射され、スリットに焦点を合わせます。
2. 透過光は反射格子によって虹色に屈折する。
3. 結果として生じた光は光検出器に当たり、ビームの強度を比較する。
4. 電子回路は相対電流を線形透過率および/または吸光度/濃度値に変換する。

多くの古い分光光度計は、検出器における 2 つのビームのゼロ電流出力をバランスさせるために、「ゼロ調整」と呼ばれる手順で較正する必要があります。基準物質の透過率は基準値 (基準値) として設定され、他のすべての物質の透過率は、最初の「ゼロ調整」された物質を基準として記録されます。分光光度計は、透過率を「吸光度」に変換します。これは、最初の物質に対するテスト サンプルの特定の成分の濃度です。^[6]

分光光度計の一般的なタイプには、以下のものがあります。UV-vis分光光度計：UVおよび可視範囲（200〜800 nm）の光吸収を測定します。多くの無機化合物と有機化合物の定量に使用されます。1. 赤外分光光度計：赤外光の吸収を測定し、化学結合と官能基を識別できます。2. 原子吸光分光光度計（AAS）：気化した分析対象原子による光の吸収を利用して、金属と半金属の濃度を決定します。3. 蛍光分光光度計：励起後にサンプルから放出される蛍光の強度を測定します。天然または誘導蛍光を持つサンプルの高感度分析が可能です。4. 比色計：比色分析および試験の光吸収を測定するために使用されるシンプルな分光光度計。^[15]

分光光度法は、DNA、RNA、タンパク質の分離、酵素反応速度論、生化学分析を含む多くの生化学実験で使用される重要な技術です。^[16]これらの用途ではサンプルを大量に入手することは容易ではないため、この非破壊技術での分析に特に適しています。さらに、完全な分析に必要なサンプルがわずか1uLの微量プラットフォームを利用することで貴重なサンプルを節約できます。^[17] 分光光度法の手順を簡単に説明すると、着色化合物を含まないブランクサンプルの吸光度を着色化合物を含むサンプルと比較することが含まれます。この着色は、595 nmで測定されるクマシーブリリアントブルーG-250染料などの染料、または420 nmで測定されるβ-ガラクトシダーゼとONPG（サンプルが黄色に変わる）の間に見られる酵素反応によって実現できます。^{[3] : 21–119}分光光度計は、可視光領域（350 nm～800 nm）の有色化合物を測定するために使用され、^{[3] : 65}研究対象の物質についてより多くの情報を得るために使用できます。生化学実験では、化学的および/または物理的特性が選択され、その特性に固有の手順が使用され、量、純度、酵素活性など、サンプルに関するより多くの情報が導き出されます。分光光度計は、サンプルの最適波長吸光度の決定、サンプルの吸光度に最適なpHの決定、未知サンプルの濃度の決定、さまざまなサンプルのpKaの決定など、さまざまな技術に使用できます。^{[3] : 21–119}分光光度計は、タンパク質の精製にも役立つプロセスであり^[18]、化合物の光学アッセイを作成するための方法としても使用できます。分光光度データは、ビール・ランベルト方程式と組み合わせて、透過率と濃度、吸光度と濃度のさまざまな関係を決定するためにも使用できます。^{[3] : 21–119}分光光度計は色を通じて化合物の波長を測定するため、染料結合物質を追加して色の変化を起こして測定することができます。^[19]各成分の標準溶液の吸収スペクトルを使用して、2成分混合物の濃度を知ることができます。これを行うには、2つの波長でのこの混合物の吸光係数と、2つの成分の既知の重量を含む溶液の吸光係数を知る必要があります。^[20]${\textstyle A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}$従来のランベルト・ビールの法則モデルに加えて、キュベットベースのラベルフリー分光法を使用することもできます。これは、光の経路に光学フィルターを追加することで、分光光度計がハンズ法則に従ってサンプルの濃度、サイズ、屈折率を定量化できるようにします。^[21]分光光度計は数十年にわたって開発および改良されており、化学者の間で広く使用されています。さらに、分光光度計は、UVまたは可視光波長の吸光度値を測定することに特化しています。^{[3] : 21–119}これは、特に色の変化を決定する際に非常に感度が高く、したがって極めて正確な、高精度の機器であると考えられています。^[22]この方法は、安価で比較的単純なプロセスであるため、実験室での実験にも便利です。

ほとんどの分光光度計はスペクトルの紫外線および可視領域で使用され、これらの機器の一部は近赤外線領域でも動作します。タンパク質の濃度は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンの存在により 280 nm での OD を測定することで推定できます。タンパク質の組成は大きく異なり、これらのアミノ酸を含まないタンパク質は 280 nm で最大吸収を持たないため、この方法はあまり正確ではありません。核酸の汚染も干渉する可能性があります。この方法には、石英キュベットを使用して紫外線領域で測定できる分光光度計が必要です。^{[3] : 135}

紫外可視分光法（UV-vis）は、電子遷移を励起するエネルギーレベルに関係しています。UV-vis光の吸収により、基底状態にある分子が励起状態に励起されます。^[5]

可視領域 400～700 nm の分光測光法は、測色科学で広く使用されています。0.2～0.8 OD の範囲で最もよく機能することは周知の事実です。インク製造業者、印刷会社、繊維ベンダーなど、多くの企業が測色法によって提供されるデータを必要としています。これらの企業は、可視領域に沿って 5～20 ナノメートルごとに読み取りを行い、スペクトル反射率曲線または代替プレゼンテーション用のデータ ストリームを作成します。これらの曲線を使用して、新しい着色剤のバッチをテストし、ISO 印刷規格などの仕様に適合しているかどうかを確認できます。

従来の可視領域分光光度計では、着色剤またはベース材料に蛍光があるかどうかを検出できません。そのため、たとえば印刷インクの 1 つ以上が蛍光性である場合、色の問題の管理が難しくなる可能性があります。着色剤に蛍光が含まれている場合は、バイスペクトル蛍光分光光度計が使用されます。可視スペクトル分光光度計には、d/8 (球面) と 0/45 の 2 つの主要な設定があります。名前は、光源、観測者、測定チャンバーの内部の形状に由来しています。科学者はこの機器を使用して、サンプル内の化合物の量を測定します。化合物の濃度が高いほど、サンプルによって吸収される光が多くなります。狭い範囲内では、ランベルト・ビールの法則が成り立ち、サンプル間の吸光度は濃度とともに直線的に変化します。印刷測定の場合、紙のストック内の UV 増白剤の効果をより適切に制御するために、UV フィルターなし/ありの 2 つの代替設定が一般的に使用されます。

サンプルは通常、キュベットで準備されます。対象領域に応じて、ガラス、プラスチック（対象可視スペクトル領域）、または石英（対象遠紫外線スペクトル領域）で作られます。一部のアプリケーションでは、微量プラットフォームで実行できる少量の測定が必要です。

• 溶存有機炭素濃度の推定
• 芳香族性の測定のための特定の紫外線吸光度
• ペントース濃度のビアス試験

アプリケーションのセクションで説明したように、分光光度法は DNA、RNA、タンパク質の定性分析と定量分析の両方に使用できます。定性分析に使用でき、分光光度計は広い波長領域をスキャンして化合物のスペクトルを記録し、各波長での化合物の吸光特性 (色の強度) を決定するために使用されます。^[5]可視分光光度法のさまざまな用途を示すことができる 1 つの実験は、さまざまなタンパク質の混合物からの β-ガラクトシダーゼの分離です。主に、分光光度法は、サンプルが受けた精製の量を総タンパク質濃度と比較して定量化するのに最適です。アフィニティークロマトグラフィーを実行すると、収集したサンプルをオルトニトロフェニル-β-ガラクトシド(ONPG) と反応させてサンプルが黄色に変わるかを判断することで、B-ガラクトシダーゼを分離してテストできます。 ^{[3] : 21–119}この後、サンプルを420 nmでONPGとの特異的相互作用について試験し、595でBradfordアッセイを行うことで、精製量を定量的に評価することができます。^{[3] : 21–119}さらに、この分光光度法は、SDS-Page電気泳動などの他の技術と組み合わせて使用​​​​して、さまざまなタンパク質サンプルを精製および分離することができます。

赤外線領域用に設計された分光光度計は、その領域での測定の技術的要件により、かなり異なります。主な要因の 1 つは、さまざまなスペクトル領域で使用できる光センサーの種類ですが、特に約 5 μm を超える波長では、事実上すべてのものが熱放射として IR を放射するため、赤外線測定も困難です。

もう 1 つの問題は、ガラスやプラスチックなどの多くの材料が赤外線を吸収するため、光学媒体として適さないことです。理想的な光学材料は、吸収が強くない塩です。IR 分光光度計のサンプルは、臭化カリウムの 2 つのディスクの間に塗り付けるか、臭化カリウムで粉砕してペレット状に圧縮します。水溶液を測定する場合は、不溶性の塩化銀を使用してセルを構築します。

分光放射計は、可視領域分光光度計とほぼ同じように動作し、光源のスペクトル密度を測定するように設計されています。用途には、メーカーによる販売のための照明の評価と分類、または顧客が購入を決定したランプが仕様範囲内であることを確認することが含まれます。コンポーネント:

1. 光源はサンプル上またはサンプルを通して照射されます。
2. サンプルは光を透過または反射します。
3. 検出器は、サンプルから反射された光やサンプルを透過した光の量を検出します。
4. 検出器は、サンプルが透過または反射した光の量を数値に変換します。

• 原子吸光分光法
• 原子発光分光法
• 誘導結合プラズマ原子発光分光法
• 誘導結合プラズマ質量分析法
• LBOZ
• 顕微分光法
• 傾斜分光法
• 分光放射測定

ウィキメディア・コモンズには、分光測光法に関連するメディアがあります。

• 分光測光法ハンドブック 2008-12-05 にWayback Machineでアーカイブ