酵素反応速度論

酵素反応速度論は、酵素触媒 化学反応の速度を研究する学問です。酵素反応速度論では、反応速度を測定し、反応条件の変化による影響を調べます。このように酵素の反応速度論を研究することで、酵素の触媒機構、代謝における役割、酵素の活性の制御方法、薬物または修飾子（阻害剤または活性剤）が反応速度に及ぼす影響などを明らかにすることができます。

酵素 (E) は、体内の化学反応を促進し加速する生物学的触媒として機能するタンパク質 分子です。これは、別の分子である基質(S) と結合することで行われ、酵素は基質に作用して目的の生成物を形成します。基質は酵素の活性部位に結合して酵素基質複合体 ES を生成し、酵素生成物複合体 EP に変換され、そこから遷移状態ES*を経て生成物 P に変換されます。一連のステップはメカニズムとして知られています。

E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

この例では、最も単純な、基質 1 つと生成物 1 つの反応の場合を想定しています。このようなケースは存在します。たとえば、ホスホグルコムターゼなどのムターゼは、リン酸基をある位置から別の位置へ転移する反応を触媒します。また、イソメラーゼは、トリオースリン酸イソメラーゼなど、基質 1 つと生成物 1 つの反応を触媒する酵素のより一般的な用語です。ただし、このような酵素はあまり一般的ではなく、2 つの基質と生成物 2 つの反応を触媒する酵素の数は大幅に少なくなっています。これらには、たとえば、 NAD ⁺によるエタノールの酸化を触媒するアルコール脱水素酵素などのNAD 依存性脱水素酵素が含まれます。3 つまたは 4 つの基質または生成物による反応はそれほど一般的ではありませんが、存在します。生成物の数が基質の数と等しい必要はありません。たとえば、グリセルアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素には、3 つの基質と 2 つの生成物があります。

酵素が複数の基質に結合する場合、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（右に示す）の場合、酵素反応速度論はこれらの基質が結合する順序と生成物が放出される順序も示すことができます。単一の基質に結合して複数の生成物を放出する酵素の例としては、1 つのタンパク質基質を 2 つのポリペプチド生成物に切断するプロテアーゼがあります。他の酵素は、ヌクレオチドをDNAにリンクするDNA ポリメラーゼのように、2 つの基質を結合します。これらのメカニズムは複雑な一連のステップであることが多いですが、通常、全体の反応速度論を決定する 1 つの律速段階があります。この律速段階は、酵素または基質の化学反応または構造変化（酵素からの生成物の放出に関与するものなど）である可能性があります。

酵素の構造に関する知識は、速度論的データの解釈に役立ちます。たとえば、構造から、触媒作用中に基質と生成物がどのように結合するか、反応中にどのような変化が起こるか、さらにはメカニズムにおける特定のアミノ酸残基の役割まで推測できます。一部の酵素はメカニズム中に形状が大きく変化します。このような場合、酵素反応を受けない結合した基質類似体がある場合とない場合の酵素構造を決定することが役立ちます。

すべての生物学的触媒がタンパク質酵素というわけではありません。リボザイムやリボソームなどのRNAベースの触媒は、 RNA スプライシングや翻訳などの多くの細胞機能に不可欠です。リボザイムと酵素の主な違いは、RNA 触媒がヌクレオチドで構成されているのに対し、酵素はアミノ酸で構成されていることです。リボザイムもより限定された一連の反応を実行しますが、その反応メカニズムと速度論は同じ方法で分析および分類できます。

酵素触媒反応では、無触媒反応と全く同じ反応物が使用され、全く同じ生成物が生成される。他の触媒と同様に、酵素は基質と生成物の平衡位置を変化させない。 ^[1]しかし、無触媒化学反応とは異なり、酵素触媒反応は飽和速度論を示す。与えられた酵素濃度および比較的低い基質濃度では、反応速度は基質濃度とともに直線的に増加する。酵素分子は大部分が自由に反応を触媒し、基質濃度の増加は酵素と基質分子が互いに遭遇する速度の増加を意味する。しかし、比較的高い基質濃度では、反応速度は漸近的に理論上の最大値に近づく。酵素活性部位は基質によってほぼすべて占有されて飽和し、反応速度は酵素の固有の回転速度によって決定される。^{[2]これら 2 つの極限ケースの中間の基質濃度は}K _Mで表される。したがって、KM_は反応速度が最大速度の半分になる基質濃度である。^[2]

酵素反応速度論の 2 つの重要な特性は、酵素が基質で飽和する容易さと、酵素が達成できる最大速度です。これらの特性を知ることで、酵素が細胞内で何をするかがわかり、酵素がこれらの条件の変化にどのように反応するかがわかります。

酵素アッセイは、酵素反応の速度を測定する実験手順です。酵素は触媒する反応によって消費されないため、酵素アッセイでは通常、基質または生成物の濃度の変化を追跡して反応速度を測定します。測定方法は多数あります。分光光度アッセイでは、生成物と反応物の間の光の吸光度の変化を観察します。放射測定アッセイでは、放射能の取り込みまたは放出を利用して、時間の経過に伴う生成物の量を測定します。分光光度アッセイは、反応速度を連続的に測定できるため、最も便利です。放射測定アッセイではサンプルの除去とカウントが必要ですが (つまり、不連続アッセイです)、通常は非常に感度が高く、非常に低いレベルの酵素活性を測定できます。^[3] 類似のアプローチは、質量分析を使用して、基質が生成物に変換されるときに安定同位体の取り込みまたは放出を監視することです。アッセイが失敗することもあり、失敗したアッセイを復活させるにはアプローチが不可欠です。

最も感度の高い酵素アッセイでは、顕微鏡で焦点を合わせたレーザーを使用して、反応を触媒する単一の酵素分子の変化を観察します。これらの測定では、酵素の反応機構中の補因子の蛍光の変化、またはタンパク質の特定の部位に添加された蛍光色素の変化を使用して、触媒中に発生する動きを報告します。^[4]これらの研究は、数百万の酵素分子の集団の平均的な動作を観察する従来の酵素速度論とは対照的に、単一の酵素の速度論と動力学に関する新しい視点を提供します。^{[5] [6]}

酵素アッセイの進行曲線の例を上に示します。酵素は、反応開始後の短期間はほぼ直線的な初期速度で生成物を生成します。反応が進行し基質が消費されると、速度は継続的に低下します (基質がまだ飽和レベルに達していない限り)。初期 (および最大) 速度を測定するために、酵素アッセイは通常、反応が完全な完了に向かってわずか数パーセントしか進行していない間に実行されます。初期速度期間の長さはアッセイ条件によって異なり、数ミリ秒から数時間の範囲になります。ただし、液体を急速に混合する装置を使用すると、1 秒未満の初期速度で高速な速度測定が可能です。^[7]これらの非常に迅速なアッセイは、以下で説明する定常状態前の速度を測定するために不可欠です。

酵素反応速度論研究のほとんどは、酵素反応のこの初期のほぼ線形な部分に集中しています。しかし、完全な反応曲線を測定し、このデータを非線形速度式に当てはめることも可能です。酵素反応を測定するこの方法は、進行曲線分析と呼ばれます。^[8]このアプローチは、初期速度が速すぎて正確に測定できない場合に、急速反応速度論の代替として役立ちます。

酵素学データ報告の標準ガイドラインは、対応する実験条件を含む酵素活性の調査から得られた運動および平衡データを包括的に報告するために必要な最小限の情報を提供します。ガイドラインは、機能的な酵素データを厳密かつ確実に報告するために開発されました。

単一基質機構を持つ酵素には、トリオースリン酸イソメラーゼやビスホスホグリセリン酸ムターゼなどのイソメラーゼ、アデニル酸シクラーゼなどの分子内リアーゼ、RNAリアーゼであるハンマーヘッドリボザイムなどがある。 ^[9]しかし、単一基質のみを持つ酵素の中には、このカテゴリーの機構には当てはまらないものもある。カタラーゼはその一例で、この酵素は最初の過酸化水素基質分子と反応し、酸化され、次に2番目の基質分子によって還元される。単一の基質が関与しているが、修飾された酵素中間体の存在は、カタラーゼの機構が実際にはピンポン機構であり、以下の複数基質反応のセクションで説明するタイプの機構であることを意味する。

酵素触媒反応は飽和性であるため、触媒速度は基質の増加に対して線形応答を示さない。反応の初期速度を基質濃度の範囲（[S] と表記）にわたって測定すると、右に示すように、初期反応速度（ ）は [S] の増加とともに増加する。しかし、[S] が高くなると、酵素は基質で飽和し、初期速度は酵素の最大速度で あるV _{maxに達する。}${\displaystyle v_{0}}$

右に、単一基質反応のミカエリス・メンテン反応速度論モデルを示します。酵素 E と基質 S の間で最初の二分子反応が起こり、酵素基質複合体 ES が形成されます。酵素反応の速度は、基質濃度が V _maxと呼ばれる特定のレベルまで増加するにつれて増加します。V _maxでは、基質 (S) と反応できる酵素 (E) がなくなるため、基質濃度が増加しても反応速度は増加しません。ここで、反応速度は ES 複合体に依存するようになり、反応は次数ゼロの単分子反応になります。単分子反応の酵素機構は非常に複雑になることがあります。通常、速度を決定する酵素ステップが 1 つあり、この反応を見かけ上の単分子速度定数 k _catを持つ単一の触媒ステップとしてモデル化できます。反応経路が 1 つまたは複数の中間体を経て進行する場合、k _{cat は}複数の基本速度定数の関数になりますが、最も単純な単一の基本反応 (中間体なしなど) の場合は、基本単分子速度定数k ₂と同一になります。見かけの単分子速度定数k _{cat は}ターンオーバー数とも呼ばれ、1 秒あたりに触媒される酵素反応の最大数を表します。 ${\displaystyle {\ce {ES ->[k_{cat}] E + P}}}$

ミカエリス・メンテン方程式^[10]は、（初期）反応速度v0_{が基質結合}平衡_の位置と速度定数k2にどのように依存するかを記述している。

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$    （ミカエリス・メンテン方程式）

定数で

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

このミカエリス-メンテンの式は、ほとんどの単一基質酵素反応速度論の基礎となる。この式の基礎となるのは、2 つの重要な仮定である (中間体や生成物の阻害が関与せず、アロステリック性や協同性がないというメカニズムに関する一般的な仮定は別として)。最初の仮定は、いわゆる 準定常状態仮定(または疑似定常状態仮説) であり、基質に結合した酵素 (したがって、結合していない酵素も) の濃度は、生成物や基質の濃度よりもはるかにゆっくりと変化するため、複合体の経時変化はゼロに設定できるというものである 。2 番目の仮定は、総酵素濃度は時間の経過とともに変化しないというものである。 ${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{= }}\;{\text{const}}}$

ミカエリス定数K _{M は、酵素反応の速度が}V _{max の}半分になる濃度として実験的に定義され、ミカエリス-メンテン式に [S] = K _{M を}代入することで検証でき、グラフでも確認できます。速度決定酵素ステップが基質解離 ( ) に比べて遅い場合、ミカエリス定数K _{M は}ES 複合体の 解離定数K _Dとほぼ等しくなります。${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$

が に比べて小さい場合、 項 となり、ES複合体もほとんど形成されないため、 となる。したがって、生成物形成速度は ${\displaystyle {\ce {[S]}}}$${\displaystyle K_{M}}$${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\おおよそ [{\ce {S}}]/K_{M}}$${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\about [E]}}}$

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

したがって、生成物の形成速度は酵素濃度だけでなく基質濃度にも依存するため、この式は対応する擬似二次反応速度定数 を持つ二分子反応に似ています。この定数は触媒効率の尺度です。最も効率的な酵素は、 が10 ⁸ – 10 ¹⁰ M ⁻¹ s ⁻¹の範囲に達します。これらの酵素は非常に効率的であるため、基質分子に遭遇するたびに反応を効果的に触媒し、効率の理論上の上限（拡散限界）に達しています。そのため、速度論的に完全な酵素と呼ばれることもあります。^[11]しかし、ほとんどの酵素は完璧からはほど遠く、との平均値はそれぞれ約 とです。^[12]${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$  ${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$${\displaystyle k_{2}}$${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$

ミカエリス-メンテン方程式によって予測される観測速度は、ミカエリス-メンテン方程式を一次化学反応速度論の方程式に組み込むことで、基質の経時的消失と生成物の生成を直接モデル化するために使用できます。ただし、これは、一次化学反応速度論の記述でオイラー数を使用することに関連する問題を認識している場合にのみ達成できます。つまり、 e ^{− k は}分割定数であり、計算に系統的誤差を導入しますが、各期間後に残っている基質を表す単一の定数として書き直すことができます。^[13]

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max}[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

1983年にスチュアート・ビール（および1997年にサンティアゴ・シュネルとクラウディオ・メンドーサ）は、ミカエリス・メンテン機構の経時的反応速度論解析の閉形式の解を導出した。^{[14] [15]シュネル・メンドーサ方程式[検証失敗]}として知られるこの解は、次の形式をとる。

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

ここでW[ ]はランバートW関数である。^{[16] [17]}そしてF(t)は

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

^{この式は、ベルベラン・サントス[18]}によって得られた以下の式に含まれており、これは、初期の基質濃度が酵素の濃度に近い場合にも有効である。

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

ここでW[ ]は再びLambert-W関数です。

上記のv対[S]のプロットは線形ではありません。最初は低い[S]で線形ですが、高い[S]で飽和します。コンピューターで非線形曲線フィッティングが行われる現代の時代以前は、この非線形性によりK _MとV _maxを正確に推定することが困難でした。そのため、数人の研究者が、ラインウィーバー・バーク・プロット、イーディー・ホフスティー図、ヘインズ・ウルフ・プロットなど、ミカエリス・メンテン式の線形化を開発しました。これらの線形表現はすべてデータを視覚化するために役立ちますが、非線形回帰法によってより正確に決定できるコンピューターソフトウェアが容易に入手できるため、運動パラメータの決定にはどれも使用すべきではありません。^[19]

ラインウィーバー・バーク プロットまたは二重逆数プロットは、運動データを表す一般的な方法です。これは、ミカエリス・メンテン方程式の両辺の逆数を取ることで作成されます。右に示すように、これはミカエリス・メンテン方程式の線形形式であり、方程式y = m x + cの直線を生成します。y 切片は1 / V _maxに等しく、グラフのx切片は -1/ K _Mを表します。

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

当然、負の 1/[S] では実験値を取得できません。下限値 1/[S] = 0 ( y切片) は、右に示すように1/v=1/V _maxである無限の基質濃度に対応します。したがって、 x切片は、正の濃度で取得された実験データの外挿です。より一般的には、Lineweaver–Burk プロットは、低い基質濃度で取得された測定値の重要性を歪め、したがって、V _maxとK _Mの推定値が不正確になる可能性があります。^[20] より正確な線形プロット方法は、Eadie–Hofstee プロットです。この場合、v はv /[S]に対してプロットされます。3 つ目の一般的な線形表現であるHanes–Woolf プロットでは、[S]/ vは [S] に対してプロットされます。一般に、データの正規化は、実験作業量を減らし、出力の信頼性を高めるのに役立ち、グラフと数値の両方の分析に適しています。^[21]

酵素反応速度論の研究は、2 つの基本的な理由で重要です。第一に、酵素がどのように機能するかを説明するのに役立ちます。第二に、酵素が生体内でどのように動作するかを予測するのに役立ちます。上で定義した反応速度定数K _MとV _maxは、酵素がどのように連携して代謝を制御するかを理解しようとする試みにおいて重要です。

こうした予測は、単純なシステムであっても簡単ではありません。たとえば、オキサロ酢酸はミトコンドリア内のリンゴ酸脱水素酵素によって生成されます。オキサロ酢酸はその後、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって消費され、それぞれクエン酸回路、糖新生、またはアスパラギン酸生合成に供給されます。オキサロ酢酸がどの経路に入るかを予測するには、オキサロ酢酸の濃度だけでなく、これらの各酵素の濃度と速度論に関する知識が必要です。代謝経路の挙動を予測するというこの目的は、膨大な量の速度論データと遺伝子発現データを生物全体の数学モデルに統合する際に最も複雑に表現されます。あるいは、代謝モデリングの問題を単純化する有用な方法の1つは、基礎となる酵素反応速度論を無視し、反応ネットワークの化学量論に関する情報のみに頼ることであり、この手法はフラックスバランス解析と呼ばれます。^{[22] [23]}

より単純なケースも考えられる。

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

酵素と中間体との複合体が存在し、中間体は第2段階で生成物に変換されます。この場合、非常によく似た式があります^[24]

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}}$

しかし定数は異なる

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

極限ケース の場合、 となることがわかります。したがって、 からの最後のステップが前のステップよりもはるかに高速である場合、元の方程式が再び得られます。数学的には、 となり、 となります。 ${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$

多基質反応は、基質がどのようにどのような順序で結合するかを説明する複雑な速度式に従います。これらの反応の分析は、基質 A の濃度を一定に保ち、基質 B を変化させると、はるかに簡単になります。これらの条件下では、酵素は単一基質酵素のように動作し、[S] によるvのプロットは、基質 B の見かけのK _M定数とV _max定数を示します。これらの測定を A の異なる固定濃度で実行した場合、これらのデータを使用して、反応のメカニズムを解明できます。2 つの基質 A と B を取り、それらを 2 つの生成物 P と Q に変換する酵素の場合、3 成分複合体メカニズムと置換酵素メカニズムの 2 種類のメカニズムがあります。

これらの酵素では、両方の基質が同時に酵素に結合して、EAB 三元複合体を生成します。結合の順序はランダム (ランダム メカニズム) の場合もあれば、基質が特定の順序で結合しなければならない (順序付きメカニズム) 場合もあります。三元複合体メカニズムを持つ酵素からのv by [S] 曲線のセット (A は固定、B は変化) をLineweaver–Burk プロットにプロットすると、生成された線のセットが交差します。

三元複合体機構を持つ酵素には、グルタチオンS-トランスフェラーゼ^[26] 、ジヒドロ葉酸還元酵素^[27]、DNAポリメラーゼ^[28]などがあります。次のリンクは、ジヒドロ葉酸還元酵素^[β]とDNAポリメラーゼ^[γ]の三元複合体機構の短いアニメーションを示しています。

右に示すように、置換酵素機構を持つ酵素は、E と化学的に修飾された酵素 E* の 2 つの状態で存在できます。この修飾された酵素は中間体と呼ばれます。このような機構では、基質 A が結合し、たとえば化学基を活性部位に移動させることによって酵素を E* に変え、その後放出されます。最初の基質が放出された後でのみ、基質 B が結合して修飾酵素と反応し、修飾されていない E 型を再生できます。置換酵素機構を持つ酵素からのv by [S] 曲線のセット (A は固定、B は変化) を Lineweaver–Burk プロットにプロットすると、平行線のセットが生成されます。これを二次プロットと呼びます。

置換酵素機構を持つ酵素には、チオレドキシンペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素、^[30]、アシルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼなどの転移酵素、^{[31] 、}トリプシンやキモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ^[32]などがある。セリンプロテアーゼは、消化酵素（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ）、血液凝固カスケードのいくつかの酵素 など、非常に一般的で多様な酵素ファミリーである。これらのセリンプロテアーゼでは、E*中間体は、タンパク質基質のペプチド結合上の活性部位セリン残基の攻撃によって形成されるアシル酵素種である。キモトリプシンの機構を示す短いアニメーションは、ここにリンクされています。^[δ]

これら 2 種類のメカニズムはどちらも酵素記憶を示す可能性がありますが、原因と結果はそれぞれ大きく異なります。三成分複合メカニズムでは、メカニズムに遅いプロセスが含まれており、結合ステップが準平衡にない場合に、中間体が非常に速く除去される可能性があるため、これらが発生する可能性があります。これにより、モノマー酵素であっても協同性が生成されます。 ^[33]置換酵素メカニズムでは、記憶効果を生成するために遅いステップは必要ありません。代わりに、複数の代替基質を持つ酵素の場合、同じ置換酵素が変換されているように見えても、後半の反応の速度論的特性は前半の反応の基質によって異なる場合があります。^[34]

外部要因により、酵素が両方向の反応を触媒する能力が制限される場合があります (一方、微視的可逆性の原理によれば、触媒自体の性質上、一方向のみを触媒することはできません)。両方向の反応を触媒する酵素の場合を考えてみましょう。

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

反応の定常状態の初期速度は ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$反応が順方向（）に進む場合は正となり、それ以外の場合は負となります。 ${\displaystyle S\rightarrow P}$

平衡にはが必要であり、これは のときに発生します。これは、熱力学が4 つの速度定数の値の間に関係を強制すること を示しています。${\displaystyle v=0}$${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$

、、、、についてそれぞれ得られる順 方向および 逆方向の最大速度の値は、それぞれ およびである。それらの比は平衡定数に等しくなく、これは熱力学が最大速度の比を制約しないことを意味する。これは、酵素が反応の特定の方向において（最大速度の観点から）はるかに「優れた触媒」になり得ることを説明する。^[35]${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$

から 2 つのミカエリス定数と を導くこともできます。ハルデン方程式は関係式です。 ${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$

したがって、熱力学は値の比率ではなく、前方値と後方値の比率を制約します。 ${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$${\displaystyle V_{\rm {max}}}$

さまざまな酵素系が非ミカエリス・メンテン挙動を示します。いくつかの例としては、自己触媒酵素、協同的およびアロステリック酵素、界面および細胞内酵素、プロセッシブ酵素などの速度論があります。一部の酵素はシグモイド v by [S]プロットを生成しますが、これは多くの場合、基質が活性部位に協同的に結合していることを示しています。これは、1つの基質分子の結合が後続の基質分子の結合に影響を与えることを意味します。この動作は、相互作用するいくつかの活性部位を持つ多量体酵素で最も一般的です。^{[36]ここで、協同のメカニズムは}ヘモグロビンのものと似ており、基質が1つの活性部位に結合すると、基質分子に対する他の活性部位の親和性が変わります。最初の基質分子が結合すると、他の活性部位の基質に対する親和性が高まるときに、正の協同性が発生します。最初の基質が結合すると、酵素の他の基質分子に対する親和性 が低下するときに、負の協同性が発生します。

アロステリック酵素には、負の協同性を示す哺乳類チロシルtRNA合成酵素^[37]や、正の協同性を示す 細菌アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ^[38]およびホスホフルクトキナーゼ^{[39]が含まれる。}

協同性は驚くほど一般的であり、基質濃度の変化に対する酵素の反応を調節するのに役立ちます。正の協同性により、酵素は [S] に対してはるかに敏感になり、その活性は狭い範囲の基質濃度で大きな変化を示すことができます。逆に、負の協同性により、酵素は [S] の小さな変化に対して鈍感になります。

ヒル方程式^[40]は、非ミカエリス・メンテン反応速度論における協同性の度合いを定量的に記述するためによく使用されます。導出されたヒル係数nは、基質の1つの活性部位への結合が基質の他の活性部位への結合にどの程度影響するかを測定します。ヒル係数が1未満の場合は負の協同性を示し、係数が1を超える場合は正の協同性を示します。

酵素が基質と混合された直後は、生成物は生成されておらず、中間体も存在しません。反応の次の数ミリ秒の研究は、定常状態前反応速度論と呼ばれます。したがって、定常状態前反応速度論は、定常状態濃度に達するまでの酵素基質中間体 (ES や E* など) の生成と消費に関係します。

このアプローチは、キモトリプシンによって触媒される加水分解反応に最初に適用されました。^[41]多くの場合、中間体の検出は、酵素がどのようなメカニズムに従うかを調べる上で重要な証拠となります。たとえば、上に示したピンポンメカニズムでは、迅速な速度論的測定により、生成物Pの放出を追跡し、修飾された酵素中間体E*の形成を測定できます。^[42]キモトリプシンの場合、この中間体は、活性部位の求核性セリンによる基質への攻撃とアシル酵素中間体の形成によって形成されます。

右の図では、酵素は反応の最初の数秒間に急速にE*を生成します。その後、定常状態に達すると速度は低下します。この反応の急速なバースト段階では、酵素の1回のターンオーバーが測定されます。したがって、このバーストで放出される生成物の量は、グラフのy軸の切片として示され、アッセイ中に存在する機能酵素の量も示します。^[43]

酵素反応速度を測定する重要な目標は、酵素反応の化学メカニズム、つまり基質を生成物に変換する一連の化学ステップを決定することです。上記の速度論的アプローチでは、中間体が形成され相互変換される速度は示されますが、これらの中間体が正確に何であるかを特定することはできません。

さまざまな溶液条件下、またはわずかに改変した酵素や基質で行われた速度論的測定は、反応の律速段階または中間体を明らかにするため、この化学メカニズムの解明に役立つことが多い。たとえば、水素原子への共有結合の切断は、一般的な律速段階である。どの水素移動が律速であるかは、各水素をその安定同位体である重水素に置換したときの速度論的効果を測定することで示すことができる。重要な水素が置換されると、主要な同位体効果により速度が変化する。これは、重水素との結合は水素との結合よりも切断されにくいために生じる。^{[44] 13} C/ ¹² Cや¹⁸ O/ ¹⁶ Oなどの他の同位体置換でも同様の効果を測定することは可能であるが、これらの効果はより微妙である。^[45]

同位体は、最終生成物中の基質分子のさまざまな部分の運命を明らかにするためにも使用できます。たとえば、最終生成物中の酸素原子の起源を識別することは、水または基質の一部に由来する可能性があるため、困難な場合があります。これは、反応に関与するさまざまな分子に酸素の安定同位体^{18 O を系統的に置換し、生成物中の同位体を調べることで決定できます。 [46]}化学メカニズムは、さまざまな pH 条件下での速度論と同位体効果を調べることによっても解明できます。^[47]金属イオンまたは他の結合した補因子を変更することによって、^{[48]保存されたアミノ酸残基の}部位特異的変異誘発 によって、または基質の類似体の存在下での酵素の挙動を研究することによっても解明できます。^[49]

酵素阻害剤は酵素の活性を低下または無効化する分子であり、酵素活性剤は酵素の触媒速度を高める分子です。これらの相互作用は可逆的(阻害剤を除去すると酵素の活性が回復する) または不可逆的(阻害剤が酵素を永久に不活性化する) のいずれかです。

従来、可逆的な酵素阻害剤は、K _MおよびV _maxへの影響に応じて、競合的、非競合的、または非競合的に分類されてきた。これらの異なる影響は、阻害剤がそれぞれ酵素 E、酵素-基質複合体 ES、またはその両方に結合することによって生じる。これらのクラスの分割は、それらの導出における問題から生じ、1 つの結合イベントに 2 つの異なる結合定数を使用する必要がある。阻害剤の結合と酵素活性に対するその影響は 2 つの明確に異なるものであり、従来の方程式では考慮されていないもう 1 つの問題である。非競合的阻害では、阻害剤の結合により酵素のみが 100% 阻害され、その中間の可能性は考慮されていない。^[50] 非競合的阻害では、阻害剤は酵素のアロステリック部位に結合するため、基質と酵素の結合親和性、つまりK _Mの逆数は同じままである。一方、V _{max は}阻害されていない酵素に比べて減少する。ラインウィーバー・バークプロットでは、非競合的阻害剤の存在は、1/V _{maxと定義される y 切片の変化によって示されます。-1/} K _Mと定義される x 切片は変化しません。競合的阻害では、阻害剤は活性部位で酵素に結合し、基質と競合します。その結果、K _{M が}増加し、V _{max は}同じままになります。^[51]また、阻害項の一般的な形式は、阻害剤と酵素の結合と、ミカエリス・メンテン方程式やリガンド受容体結合に関連する用量反応曲線など、他の結合項との関係を不明瞭にします。この関係を示すには、次の並べ替えを行うことができます。

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

一番下にゼロを加える（[I]-[I]）

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

[I]+K _iで割る

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

この表記は、反応速度が基質と相互作用する酵素集団の割合に依存するミカエリス-メンテン方程式と同様に、阻害剤の効果は阻害剤と相互作用する酵素集団の割合の結果であることを示しています。現在の形式のこの方程式の唯一の問題は、阻害剤の結合により酵素が完全に阻害されると想定していることですが、実際には基質ターンオーバーの 100% 阻害から 0% を超える阻害まで、さまざまな効果があります。これを考慮して、デルタV_最大項を含めることで、さまざまな程度の阻害を可能にするように方程式を簡単に変更できます。

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

または

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

この項は、阻害剤が集団内の個々の酵素と相互作用しているときに存在する残留酵素活性を定義できます。ただし、この項を含めると、二次V _max項が最初の項よりも高いことが判明した場合に活性化の可能性を考慮するという付加価値があります。活性化の可能性も考慮するには、阻害剤「I」を、ここでは「X」として示される修飾語に置き換えて表記を書き直すことができます。

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

この用語は、ミカエリス-メンテン式の最高速度に関連する運動学的効果を扱うための簡略化された方法となるが、K _Mに関連する効果を説明するために使用される用語の潜在的な問題を浮き彫りにする。酵素の基質に対する親和性に関連するK _{Mは、ほとんどの場合、酵素阻害剤の相互作用から直接生じる酵素の結合部位の潜在的な変化に関連するはずである。したがって、上記で提案された}V _maxを調節するための用語と同様の用語は、ほとんどの状況で適切であるはずである：^[52]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

酵素阻害剤は、通常、活性部位残基を共有結合的に修飾することにより、酵素を不可逆的に不活性化することもできます。自殺基質と呼ばれることもあるこれらの反応は、指数関数的減衰関数に従い、通常は飽和します。飽和未満では、阻害剤に関して一次速度論に従います。不可逆的阻害は、2つの異なるタイプに分類できます。アフィニティ標識は不可逆的阻害の一種で、反応性の高い官能基が目的のタンパク質の触媒的に重要な残基を修飾して阻害を引き起こします。一方、メカニズムに基づく阻害では、阻害剤が結合し、その後酵素が介在する変化が起こり、阻害剤が反応基に変化して酵素が不可逆的に修飾されます。

上記 2 つの見出しで可逆的阻害と不可逆的阻害について説明しましたが、可逆性 (または不可逆性) の概念は、アッセイの時間枠にのみ依存する純粋に理論的な構成であることに注意してください。つまり、阻害剤分子の結合と解離を分単位で行う可逆的なアッセイは、アッセイが結果を秒単位で評価する場合は不可逆的に見え、その逆も同様です。任意のアッセイ時間枠では、可逆性と不可逆性にわたる阻害剤の挙動が連続的に存在します。ゆっくりと作用が現れる阻害剤もあり、これらの阻害剤のほとんどは、常に、対象のタンパク質ターゲットにしっかりと結合します。

酵素と基質の相互作用のモデルとして、誘導適合モデルが好まれている。^[53]このモデルは、酵素と基質の間の初期の相互作用は比較的弱いが、これらの弱い相互作用が酵素の構造変化を急速に誘発し、結合を強化すると提唱している。これらの構造変化により、活性部位の触媒残基が、反応で変化する基質の化学結合に近づく。^{[54]構造変化は、}円二色性または二重偏光干渉法を使用して測定できる。結合が起こると、1つまたは複数の触媒メカニズムが、反応の代替化学経路を提供することで、反応の遷移状態のエネルギーを低下させる。触媒メカニズムには、結合ひずみによる触媒、近接性と配向による触媒、活性部位のプロトン供与体または受容体による触媒、共有結合触媒、量子トンネル効果などがある。^{[42] [55]}

酵素反応速度論では、酵素がどの触媒モードを使用するかは証明できません。ただし、一部の反応速度論データから、他の手法で調べる可能性が示唆される場合があります。たとえば、バーストフェーズの前定常状態反応速度論を伴うピンポン機構は、この酵素の機構において共有結合触媒が重要である可能性を示唆します。あるいは、V _{maxには強い pH 効果があり、} K _Mには影響がないことが観察された場合、触媒作用が発生するには活性部位の残基が特定のイオン化状態にある必要があることを示している可能性があります。

1902年、ヴィクトル・アンリは酵素反応速度論の定量的理論を提唱したが^[56]、当時は水素イオン濃度の実験的意義はまだ認識されていなかった。1909年にピーター・ラウリッツ・ソーレンセンが対数pHスケールを定義し、緩衝の概念を導入した後^[57] 、ドイツの化学者レオノール・ミカエリスとモード・レオノーラ・メンテン博士（当時ミカエリスの研究室のポスドク研究員）はアンリの実験を繰り返し、彼の式を確認した。この式は現在では一般にミカエリス・メンテン反応速度論（アンリ・ミカエリス・メンテン反応速度論とも呼ばれる）と呼ばれている。^{[58]彼らの研究は}GEブリッグスとJBSハルデンによってさらに発展させられ、彼らは今日でも酵素活性のモデル化の出発点として広く考えられている反応速度論式を導出した。^[59]

アンリ・ミカエリス・メンテンのアプローチの主な貢献は、酵素反応を2段階で考えることでした。第1段階では、基質が酵素に可逆的に結合し、酵素基質複合体を形成します。これはミカエリス複合体と呼ばれることもあります。次に、酵素は反応の化学反応を触媒し、生成物を放出します。多くの酵素の反応速度論は、単純なミカエリス・メンテンモデルで十分に説明できますが、すべての酵素には、モデルでは説明されていない内部運動があり、全体的な反応速度論に大きく貢献する可能性があります。これは、変動速度に関連するいくつかのミカエリス・メンテン経路を導入することでモデル化できます。^{[60] [61] [62]}これは、基本的なミカエリス・メンテン機構の数学的拡張です。^[63]

ENZO (Enzyme Kinetics) は、酵素触媒反応の速度論モデルを構築するためのグラフィカルインターフェースツールです。ENZO は、規定された酵素反応スキームから対応する微分方程式を自動的に生成します。これらの微分方程式は、数値ソルバーと回帰アルゴリズムによって処理され、微分方程式の係数を実験的に観察された時間経過曲線に適合させます。ENZO を使用すると、競合する反応スキームを迅速に評価でき、酵素速度論の日常的なテストに使用できます。^[64]

• タンパク質ダイナミクス
• 拡散律速酵素
• ラングミュア吸着モデル

α. ^リンク: インタラクティブなミカエリス–メンテン運動学チュートリアル (Java が必要)

β. ^リンク: ジヒドロ葉酸還元酵素のメカニズム (Gif)

γ。 ^リンク: DNA ポリメラーゼのメカニズム (Gif)

δ. ^リンク: キモトリプシンのメカニズム (Flash が必要)

入門

• Cornish-Bowden A (2012).酵素反応速度論の基礎(第 4 版). Weinheim: Wiley-Blackwell. ISBN 978-3-527-33074-4。
• Stevens L、Price NC (1999)。酵素学の基礎：触媒タンパク質の細胞および分子生物学。オックスフォード[オックスフォードシャー]：オックスフォード大学出版局。ISBN 978-0-19-850229-6。
• Bugg T (2004)。酵素と補酵素化学入門。ケンブリッジ、マサチューセッツ州：Blackwell Publishers。ISBN 978-1-4051-1452-3。
• Segel IH (1993).酵素反応速度論: 急速な平衡と定常状態の酵素システムの挙動と分析. ニューヨーク: Wiley. ISBN 978-0-471-30309-1。

高度な

• Fersht A (1999).タンパク質科学における構造とメカニズム: 酵素触媒とタンパク質フォールディングのガイド. サンフランシスコ: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6。
• Schnell S, Maini PK (2004). 「酵素反応速度論の世紀: K _Mおよび v _max推定値の信頼性」.理論生物学に関するコメント. 8 (2–3): 169–87. CiteSeerX  10.1.1.493.7178 . doi :10.1080/08948550302453.
• Walsh C (1979)。酵素反応機構。サンフランシスコ: WH Freeman。ISBN 978-0-7167-0070-8。
• Cleland WW、Cook P (2007)。酵素反応速度論とメカニズム。ニューヨーク：Garland Science。ISBN 978-0-8153-4140-6。

• 酵素アッセイのアニメーション - アッセイ条件の操作による影響を示します
• MACiE — 酵素反応メカニズムのデータベース
• 酵素 — Expasy 酵素命名データベース
• ENZO — 酵素触媒反応の速度論モデルを簡単に構築し、迅速にテストするための Web アプリケーション。
• ExCatDB — 酵素触媒機構のデータベース
• BRENDA — 基質、阻害剤、反応図を提供する包括的な酵素データベース
• SABIO-RK — 反応速度論のデータベース
• カリフォルニア大学サンディエゴ校ジョセフ・クラウト研究グループ — いくつかの酵素反応メカニズムのアニメーション
• 酵素反応速度論における記号と用語 — 酵素反応速度論の概念と用語の包括的な説明
• 酵素反応速度論入門 — 酵素反応速度論に関するオンラインチュートリアルのアクセス可能なセット
• 酵素反応速度論アニメーションチュートリアル — 音声付きアニメーションチュートリアル