酵素アッセイ

酵素活性は存在する活性酵素の量を測る尺度であり、様々な物理的条件に依存するため、それらを明記する必要がある。

以下の式を用いて計算されます。

${\displaystyle \mathrm {a} =\mathrm {n} _{\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V} }$

どこ

${\displaystyle \mathrm {a} }$＝酵素活性

$\displaystyle \mathrm {n} _{\text{t}}}$＝単位時間あたりに変換された基質のモル数

${\displaystyle \mathrm {r} }$＝反応速度

${\displaystyle \mathrm {V} }$＝反応量

SI単位はカタルで、1カタル = 1 mol s ⁻¹ (モル毎秒) ですが、これは大きすぎる単位です。より実用的で一般的に使用される値は酵素単位(U) = 1 μmol min ⁻¹ (マイクロモル毎分) です。1 U は 16.67ナノカタルに相当します。^{[ 1 ]} 

katalで表される酵素活性は、一般的に、酵素の想定される天然標的基質の活性を指します。酵素活性は、ゼラチンなどの特定の標準化基質の活性として表すこともできます。ゼラチンの場合はゼラチン消化単位（GDU）で、乳タンパク質の場合は乳凝固単位（MCU）で測定されます。GDUとMCUの単位は、それぞれ1グラムの酵素がゼラチンまたは乳タンパク質を消化する速度に基づいています。1 GDUは約1.5 MCUに相当します。^{[ 2 ]}

基質の量を増やすと酵素との反応速度は上昇するが、ある一定の量を超えると、利用可能な活性部位の量が一定になるため、反応速度は横ばいになる。

酵素の比活性は、もう一つの一般的な単位です。これは、総タンパク質1ミリグラムあたりの酵素活性（μmol min⁻¹ mg⁻¹で表される）です^。比^活性は、混合物中の酵素の純度の尺度となります。これは、総タンパク質1ミリグラムあたり、所定の時間（分）で酵素によって生成される生成物のマイクロモル数です。比活性は、反応速度に反応量を掛け、総タンパク質の質量で割った値に等しくなります。SI単位はkatal/kgですが、より実用的な単位はμmol/(mg*min)です。

比活性とは、特定の（通常は飽和）基質濃度における酵素のプロセス性（酵素が処理される能力）の尺度であり、純粋な酵素では通常一定である。

活性部位滴定法は、培養バッチの違いやミスフォールドした酵素、その他同様の問題に起因する誤差を排除するために実施できます。これは活性酵素量の測定であり、例えば不可逆阻害剤を用いて存在する活性部位の量を滴定することによって算出されます。比活性は、μmol min⁻¹ mg⁻¹活性酵素として表されます^。酵素の分子量が既知であれば、比活性からターンオーバー数、すなわちμmol活性酵素あたり毎秒μmol生成物を算出できます。ターンオーバー数は、各酵素分子が毎秒触媒サイクルを実行する回数として視覚化できます。

反応速度とは、単位時間あたりに消失する（または生成される）基質の濃度（mol L ⁻¹ s ⁻¹）のことである。

純度（％）は、100％×（酵素試料の比活性／純粋酵素の比活性）で算出されます。不純物を含む試料は、質量の一部が実際には酵素ではないため、比活性が低くなります。100％純粋酵素の比活性が分かっていれば、不純物を含む試料の比活性は低くなるため、純度を計算して明確な結果を得ることができます。

分光光度法によるアッセイでは、アッセイ溶液が吸収する光量の変化を測定することで反応の進行を追跡します。この光が可視光領域にある場合、アッセイ溶液の色の変化を実際に目で確認できるため、このようなアッセイは比色アッセイと呼ばれます。テトラゾリウム色素を基質として用いる酸化還元アッセイであるMTTアッセイは、比色アッセイの一例です。

一般的な補酵素であるNADHとNADPHは還元型では紫外線を吸収するが、酸化型では吸収しないため、紫外線がよく用いられる。したがって、NADHを基質として用いる酸化還元酵素は、補酵素を消費するにつれて波長340  nmでの紫外線吸収の減少を追跡することで測定できる。^{[ 4 ]}

直接アッセイとカップリングアッセイの比較

酵素反応によって吸光度に変化が生じない場合でも、カップリングアッセイを用いることで、分光光度法による酵素測定が可能となる。この方法では、ある反応の生成物を、容易に検出可能な別の反応の基質として用いる。例えば、図1はヘキソキナーゼ酵素のカップリングアッセイを示している。この酵素は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを用いて、グルコース-6-リン酸の生成とNADPHの生成をカップリングさせることで測定できる。

蛍光とは、分子が異なる波長の光を吸収した後、ある波長の光を放出する現象です。蛍光測定法は、基質と生成物の蛍光強度の差を利用して酵素反応を測定します。これらの測定法は一般的に分光光度法よりも感度が高いものの、不純物による干渉や、多くの蛍光化合物が光に曝された際に不安定になるなどの問題が生じる可能性があります。

これらのアッセイの一例として、ヌクレオチド補酵素NADHとNADPHの使用が挙げられます。ここでは、還元型は蛍光を発し、酸化型は非蛍光性です。したがって、酸化反応は蛍光の減少によって、還元反応は蛍光の増加によって追跡できます。^{[ 5 ]} β-ガラクトシダーゼのアッセイには4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド、カンジダ・ルゴサ・リパーゼのアッセイには4-メチルウンベリフェリル-ブチレートなど、酵素触媒反応で蛍光色素を放出する合成基質も利用可能です。^{[ 6 ]}

熱量測定は、化学反応によって放出または吸収される熱を測定​​する方法です。多くの反応は熱の変化を伴うため、これらの測定法は非常に汎用性が高く、マイクロカロリメーターを使用すれば、少量の酵素や基質で済みます。これらの測定法は、他の方法では測定不可能な反応を測定するために使用できます。^{[ 7 ]}

化学発光とは、化学反応によって光が放出される現象のことです。酵素反応の中には光を発生させるものがあり、この光を測定することで生成物の生成を検出できます。このような分析法は、発生した光を写真フィルムに数日から数週間かけて記録できるため、非常に高感度ですが、反応によって放出された光すべてが検出されるわけではないため、定量化が難しい場合があります。

ウエスタンブロッティングにおいて、西洋ワサビペルオキシダーゼを酵素化学発光（ECL）法で検出する方法は、抗体検出の一般的な方法である。別の例としては、ホタルに見られる酵素ルシフェラーゼがあり、これは基質であるルシフェリンから自然に光を生成する。

静的光散乱法は、溶液中の高分子の重量平均モル質量と濃度の積を測定します。測定時間を通して1種類以上の分子種の総濃度が一定である場合、散乱信号は溶液の重量平均モル質量を直接的に反映します。このモル質量は、複合体の形成や解離に伴って変化します。したがって、この測定法は複合体の化学量論と反応速度を定量化します。タンパク質反応速度の光散乱アッセイは、酵素を必要としない非常に汎用性の高い手法です。

マイクロスケール熱泳動(MST) ^{[ 8 ]}は、平衡状態にある分子/基質のサイズ、電荷、および水和エントロピーを測定します。^{[ 9 ]}蛍光標識された基質の熱泳動運動は、酵素によって修飾されると大きく変化します。この酵素活性は、リアルタイムで高い時間分解能で測定できます。^{[ 10 ]}全光学的 MST 法の材料消費量は非常に少なく、活性と阻害の酵素速度定数を測定するには、わずか 5 μl のサンプル量と 10 nM の酵素濃度が必要です。MST では、両方の基質が異なる蛍光色素で標識されている場合、分析者は 2 つの異なる基質の修飾を一度に測定できます (多重化)。したがって、基質競合実験を実行できます。

放射性同位体アッセイは、基質への放射能の取り込み、または基質からの放射能の放出を測定するものです。これらのアッセイで最も頻繁に使用される放射性同位体は、 ^14C、^32P、^35S、および^125Iです。放射性同位体を用いることで基質の単一原子を特異的に標識できるため、これらのアッセイは非常に高感度かつ特異的です。生化学分野で頻繁に用いられ、粗抽出物（細胞溶解時に生成される複雑な酵素混合物）中の特定の反応を測定する唯一の方法となる場合も少なくありません。

これらの手順では、通常、シンチレーションカウンターを使用して放射能が測定されます。

クロマトグラフィー分析では、反応混合物をクロマトグラフィーによって成分に分離することで生成物の生成を測定します。これは通常、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行われますが、より簡単な薄層クロマトグラフィーの手法を使用することもできます。このアプローチでは多くの材料が必要になる場合がありますが、基質/生成物を放射性または蛍光タグで標識することで感度を高めることができます。また、HPLC装置よりも数倍高いポンプ圧力で動作する改良されたクロマトグラフィー装置（例えば、超高圧液体クロマトグラフィー）にプロトコルを切り替えることで、分析の感度も向上しています（高速液体クロマトグラフィー#ポンプ圧力を参照）。^{[ 11 ]}

ほとんどの酵素は、極めて高い塩濃度に耐えることができません。塩イオンがタンパク質の弱いイオン結合を阻害するためです。一般的な酵素は、1～500 mMの塩濃度で活性を示します。もちろん、好塩性藻類や好塩性細菌など、例外も存在します。

すべての酵素は、生物に特有の温度範囲内で機能します。温度の上昇は一般的に反応速度の上昇につながります。しかし、温度が高くなると反応速度が急激に低下するため、上昇には限界があります。これは、酵素活性部位の三次元構造を安定させる弱いイオン結合と水素結合の破壊によってタンパク質構造が変性（変化）するためです。 ^{[ 12 ]}ヒトの酵素の「最適」温度は通常35～40 ℃です。ヒトの平均体温は37 ℃です。ヒトの酵素は40 ℃を超えると急速に変性し始めます。温泉に生息する好熱性古細菌の酵素は100 ℃まで安定しています。^{[ 13 ]}しかし、酵素反応の「最適」速度という考え方は誤解を招きます。どの温度でも観察される速度は、反応速度と変性速度の2つの速度の積だからです。 1秒間の活性を測定するアッセイを用いると、高温では高い活性が得られますが、1時間以上かけて生成物の形成を測定するアッセイを用いると、これらの温度では低い活性が得られます。    

ほとんどの酵素はpHに敏感で、特定の活性範囲を持っています。すべての酵素には最適pHが存在します。pHは、イオン結合や水素結合を切断することで酵素の三次元構造を変性（変化）させ、酵素活性を停止させることがあります。ほとんどの酵素はpH6～8の範囲で機能しますが、胃の中のペプシンはpH2で、トリプシンはpH8で最もよく機能します。

基質濃度を上げると反応速度（酵素活性）は上昇します。しかし、酵素飽和によって反応速度は制限されます。酵素は、すべての分子の活性部位がほとんどの時間占有されている状態になると飽和します。飽和点に達すると、どれだけ基質を追加しても反応速度は上がりません。反応速度のグラフは横ばい状態になります。

溶液中に大量の高分子が存在すると、高分子混雑と呼ばれる効果によって酵素反応の速度と平衡定数が変化する。^{[ 14 ]}