発現ベクター

発現ベクターには、遺伝子発現に必要な要素が含まれていなければなりません。これには、プロモーター、リボソーム結合部位や開始コドンなどの正しい翻訳開始配列、終止コドン、転写終止配列などが含まれます。^{[ 2 ]}原核生物と真核生物ではタンパク質合成の機構に違いがあるため、発現ベクターには選択した宿主に適した発現要素が含まれていなければなりません。たとえば、原核生物の発現ベクターは、リボソーム結合のために翻訳開始部位にシャイン・ダルガノ配列を持ち、真核生物の発現ベクターはコザックコンセンサス配列を含みます。

プロモーターは転写を開始するため、クローン化遺伝子の発現を制御するポイントとなります。発現ベクターで使用されるプロモーターは通常誘導性であり、 IPTGなどの誘導物質の導入によって必要な場合にのみタンパク質合成が開始されます。ただし、一部の発現ベクターでは、遺伝子発現が構成的（すなわち、タンパク質が常に発現している）である場合もあります。厳密に制御されたプロモーターを持つ発現ベクターであっても、低レベルの構成的タンパク質合成が起こる可能性があります。

遺伝子産物の発現後、発現したタンパク質を精製する必要がある場合があるが、宿主細胞の大部分のタンパク質から目的のタンパク質を分離することは、時間がかかるプロセスになる可能性がある。この精製プロセスを容易にするために、クローン化された遺伝子に精製タグを追加することができる。このタグは、ヒスチジン（His）タグ、他のマーカーペプチド、またはグルタチオンS-トランスフェラーゼやマルトース結合タンパク質などの融合パートナーである可能性がある。^{[ 3 ]}これらの融合パートナーの中には、発現したタンパク質の溶解度を高めるのに役立つものもある。緑色蛍光タンパク質などの他の融合タンパク質は、クローン化された遺伝子の成功を識別するためのレポーター遺伝子として機能したり、細胞イメージングでタンパク質発現を研究するために使用したりすることができる。^{[ 4 ] [ 5 ]}

発現ベクターは、タンパク質合成のために宿主細胞に導入またはトランスフェクションされる。発現ベクターの中には、形質転換や宿主染色体へのDNA挿入のための要素を持つものがあり、例えば、植物形質転換のためのvir遺伝子や、染色体への組み込みのためのインテグラーゼ部位などが挙げられる。

一部のベクターには、発現させたタンパク質を細菌のペリプラズム空間などの特定の場所に標的化するための標的配列が含まれている場合がある。

多くのタンパク質の発現に好んで用いられる発現宿主は、大腸菌（Escherichia coli）である。大腸菌における異種タンパク質の生産は比較的簡単で便利であり、迅速かつ安価である。また、様々なニーズに対応できる多数の大腸菌発現プラスミドが利用可能である。タンパク質生産に用いられる他の細菌としては、枯草菌（Bacillus subtilis）などがある。

ほとんどの異種タンパク質は、大腸菌の細胞質で発現されます。しかし、形成されたすべてのタンパク質が細胞質に可溶性であるとは限らず、細胞質で形成された不適切に折り畳まれたタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性凝集体を形成する可能性があります。このような不溶性タンパク質は再折り畳みが必要となり、これは複雑なプロセスになる可能性があり、必ずしも高収率が得られるとは限りません。^{[ 6 ]}ジスルフィド結合を持つタンパク質は、細胞質の還元環境によってこのような結合の形成が阻害されるため、正しく折り畳むことができない場合が多く、考えられる解決策は、 N末端シグナル配列を使用してタンパク質をペリプラズム空間に標的化することです。別の可能性としては、細胞質の酸化還元環境を操作することが挙げられます。^{[ 7 ]}さらに高度なシステムも開発されており、このようなシステムによって、糖タンパク質など、これまで大腸菌では不可能と考えられていたタンパク質の発現が可能になるかもしれません。^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]}

これらのベクターに使用されるプロモーターは通常、 lacオペロンのプロモーターまたはT7プロモーターに基づいており、^{[ 11 ]}通常はlacオペレーターによって制御されます。これらのプロモーターは、異なるプロモーターのハイブリッドである場合もあります。たとえば、Tacプロモーターはtrpプロモーターとlacプロモーターのハイブリッドです。^{[ 12 ]}最も一般的に使用されるlacまたはlac由来のプロモーターは、カタボライト抑制に感受性のないlac UV5変異体に基づいていることに注意してください。この変異体により、野生型lacプロモーターを使用するとグルコースが遺伝子発現を阻害するため、増殖培地にグルコースが含まれている場合でもlacプロモーターの制御下でタンパク質を発現できます。 ^{[ 13 ]}ただし、一部のシステムでは、グルコースの存在は残留阻害によってバックグラウンド発現を低減するために依然として使用される場合があります。^{[ 14 ]}

大腸菌発現ベクターの例としては、グルタチオンS-トランスフェラーゼを融合パートナーとして用い、遺伝子発現がtacプロモーターの制御下にあるpGEXシリーズのベクター^{[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]}や、 T7プロモーターを使用するpETシリーズのベクター^{[ 18 ]}などがある。

異なるプラスミドを使用することで、大腸菌で 2 つ以上の異なるタンパク質を同時に発現させることが可能です。ただし、2 つ以上のプラスミドを使用する場合は、各プラスミドで異なる抗生物質選択と異なる複製起点を使用する必要があり、そうしないと、いずれかのプラスミドが安定的に維持されない可能性があります。一般的に使用されているプラ​​スミドの多くはColE1レプリ​​コンに基づいているため、互いに互換性がありません。ColE1 ベースのプラスミドが同じ細胞内で別のプラスミドと共存するためには、もう 1 つのプラスミドが異なるレプリコン、例えば pACYC シリーズのプラスミドのような p15A レプリコンベースのプラスミドである必要があります。^{[ 19 ]}別のアプローチとしては、単一の 2 つのシストロン ベクターを使用するか、コード配列を二シストロンまたは多シストロン構造としてタンデムに設計する方法があります。^{[ 20 ] [ 21 ]}

タンパク質生産によく用いられる酵母はPichia pastorisである。^{[ 22 ]} Pichiaにおける酵母発現ベクターの例としてはpPIC シリーズベクターがあり、これらのベクターはメタノールで誘導可能なAOX1プロモーターを使用している。^{[ 23 ]}プラスミドには、酵母ゲノムへの外来 DNA の挿入要素と、発現タンパク質の分泌のためのシグナル配列が含まれている場合がある。ジスルフィド結合とグリコシル化を持つタンパク質は、酵母で効率的に生産できる。タンパク質生産に用いられる別の酵母はKluyveromyces lactisであり、この遺伝子は強力なラクターゼLAC4 プロモーターの変異体によって発現される。^{[ 24 ]}

サッカロミセス・セレビシエは、酵母における遺伝子発現研究、例えばタンパク質間相互作用の研究のための酵母ツーハイブリッドシステムなどに広く用いられています。 ^{[ 25 ]}酵母ツーハイブリッドシステムで使用されるベクターには、クローン化された2つの遺伝子の融合パートナーが含まれており、クローン化された遺伝子から発現される2つのタンパク質間に相互作用がある場合にレポーター遺伝子の転写を可能にします。

昆虫細胞に感染する棒状ウイルスであるバキュロウイルスは、このシステムで発現ベクターとして使用されます。 ^{[ 26 ]}ヨトウガ（ Spodoptera frugiperda）などの鱗翅目（ガやチョウ）由来の昆虫細胞株が宿主として使用されます。キャベツヨトウ由来の細胞株は、細胞増殖を促進するために通常必要とされる高価な血清なしで急速に増殖するように開発されているため、特に注目されています。^{[ 27 ] [ 28 ]}シャトルベクターはバクミドと呼ばれ、遺伝子発現は強力なプロモーターpPolhの制御下にあります。^{[ 29 ]}バキュロウイルスは、 BacMamシステムで哺乳類細胞株にも使用されています。^{[ 30 ]}

バキュロウイルスは通常、糖タンパク質の生産に用いられるが、その糖鎖修飾は脊椎動物に見られるものとは異なる場合がある。一般的に、バキュロウイルスは宿主範囲が限られており、改変なしに脊椎動物に感染しないため、哺乳類ウイルスよりも安全に使用できる。

多くの植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラスミドに基づいている。^{[ 31 ]}これらの発現ベクターでは、植物に挿入されるDNAはT-DNAにクローニングされる。T- DNAは、両端に25bpの直接反復配列を持つDNA断片であり、植物ゲノムに組み込まれることができる。T-DNAには選択マーカーも含まれている。アグロバクテリウムは形質転換、植物ゲノムへの組み込みのメカニズムを提供し、そのvir遺伝子のプロモーターはクローニングされた遺伝子にも使用できる。しかし、細菌またはウイルスの遺伝物質が植物に伝達されることへの懸念から、植物ゲノムの機能的同等物を使用するイントラジェニックベクターと呼ばれるベクターが開発され、異種からの遺伝物質が植物に伝達されないようにしている。^{[ 32 ]}

アグロバクテリウム法はすべての植物に有効ではないため、植物ウイルスをベクターとして使用することができます。使用されている植物ウイルスの例としては、タバコモザイクウイルス（TMV）、ジャガイモウイルスX、ササゲモザイクウイルスなどがあります。^{[ 33 ]}タンパク質は、ウイルスの外被タンパク質との融合タンパク質として発現され、組み立てられたウイルス粒子の表面に提示されるか、または融合していないタンパク質として植物内に蓄積されます。植物ベクターを使用した植物での発現は、多くの場合構成的であり、^{[ 34 ]}植物発現ベクターで一般的に使用される構成的プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターです。^{[ 35 ] [ 36 ]}

哺乳類発現ベクターは、細菌発現系に比べて哺乳類タンパク質の発現において、適切な折り畳み、翻訳後修飾、および関連する酵素活性など、大きな利点を提供する。また、発現されるタンパク質が正しいグリコシル化を持たない可能性のある他の真核生物非哺乳類系よりも望ましい場合もある。特に、適切な折り畳みと安定性のためにシャペロンを必要とする膜結合タンパク質や、多数の翻訳後修飾を含むタンパク質の生産に有用である。しかし、欠点は、原核生物ベクターと比較して製品の収量が低いこと、および関連する技術が高価であることである。その複雑な技術と、哺乳類細胞発現における動物ウイルスによる汚染の可能性も、大規模な工業生産での使用を制限している。^{[ 37 ]}

チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞やCOS細胞などの培養哺乳類細胞株、およびHEK細胞やHeLa細胞などのヒト細胞株は、タンパク質の生産に使用できます。ベクターは細胞に導入され、安定的な導入の場合は相同組換えによってDNAがゲノムに組み込まれ、細胞は一時的に導入されます。哺乳類発現ベクターの例としては、アデノウイルスベクター^{[ 38 ]} 、 pSVおよびpCMVシリーズのプラスミドベクター、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスベクター^{[ 39 ] 、バキュロウイルス[ 30 ]}などがあります。サイトメガロウイルス（CMV）およびSV40のプロモーターは、遺伝子発現を駆動するために哺乳類発現ベクターで一般的に使用されています。伸長因子（EF）-1プロモーターなどの非ウイルス性プロモーターも知られています^{[ 40 ] 。}

転写と翻訳に必要な細胞成分を含む大腸菌細胞溶解液が、このin vitroタンパク質生産法で使用されます。このようなシステムの利点は、細胞培養に時間を必要としないため、in vivoで生産されるタンパク質よりもはるかに速くタンパク質を生産できることですが、コストも高くなります。大腸菌発現に使用されるベクターはこのシステムで使用できますが、このシステム専用に設計されたベクターも利用可能です。真核細胞抽出物は、他の無細胞システム、例えば小麦胚芽無細胞発現システムでも使用できます。^{[ 41 ]}哺乳類無細胞システムも作成されています。^{[ 42 ]}

発現ベクターを発現宿主内で用いる方法は、現在、研究室で研究用タンパク質を生産する際の一般的な方法となっている。ほとんどのタンパク質はE. coliで生産されるが、糖鎖修飾タンパク質やジスルフィド結合を持つタンパク質については、酵母、バキュロウイルス、哺乳類細胞系が用いられることもある。

現在、ほとんどのタンパク質医薬品は、発現ベクターを用いた組換えDNA技術によって製造されています。これらのペプチドおよびタンパク質医薬品には、ホルモン、ワクチン、抗生物質、抗体、酵素などがあります。^{[ 43 ]} 疾患管理に使用された最初のヒト組換えタンパク質であるインスリンは、1982年に導入されました。^{[ 43 ]}バイオテクノロジーにより、以前は希少であったり入手困難であったりしたペプチドおよびタンパク質医薬品を大量生産することが可能になりました。また、宿主ウイルス、毒素、プリオンなどの汚染物質のリスクも低減されます。過去の例としては、ヒトの死体から採取された下垂体から抽出された成長ホルモンにプリオンが混入し、小人症の治療を受けている患者にクロイツフェルト・ヤコブ病を引き起こした事例[ ^{44 ]}や、ヒトの血液から分離された凝固因子VIIIにウイルスが混入し^、肝炎やエイズなどのウイルス性疾患の伝播を引き起こした事例などがあります。^{[ 45 ] [ 46 ]}タンパク質がヒト以外の宿主細胞で生産される場合、このようなリスクは軽減されるか、完全に排除される。

近年、発現ベクターは、植物や動物に特定の遺伝子を導入して遺伝子組み換え生物を生産するために使用されており、例えば農業では遺伝子組み換え植物の生産に使用されています。発現ベクターは、ビタミンAの前駆体であるベータカロテンをイネに導入するために使用されており、この製品はゴールデンライスと呼ばれています。このプロセスは、殺虫剤であるバチルス・チューリンゲンシス毒素またはBt毒素を生成する遺伝子を植物に導入するためにも使用されており、改変された生物によって生成されるため、農家が殺虫剤を使用する必要性が軽減されます。さらに、発現ベクターは、トマトの腐敗を引き起こす化学物質の生成量を減らすように植物を改変することで、トマトの成熟を延長するためにも使用されています。^{[ 47 ]}発現ベクターを使用して作物を改変することについては、未知の健康リスク、企業が特定の遺伝子組み換え食品作物を特許化する可能性、倫理的懸念があることから論争がありました。それにもかかわらず、この技術は依然として使用され、集中的に研究されています。

遺伝子組み換え動物は、動物の生化学的プロセスやヒトの疾患を研究するため、あるいは医薬品やその他のタンパク質を生産するためにも作られてきました。また、有利な特性や有用な特性を持つように遺伝子操作されることもあります。緑色蛍光タンパク質は、蛍光を発する動物を標識として用いることがあり、これは蛍光魚類であるグローフィッシュの生産に商業的に利用されています。

遺伝子治療は、ベクターによって運ばれる「正常な」遺伝子をゲノムに挿入して「異常な」遺伝子を置き換えたり、特定の遺伝子の発現を補ったりすることで、多くの疾患に対する有望な治療法です。一般的にはウイルスベクターが使用されますが、他の非ウイルス性の送達方法も開発されています。この治療法は、使用されるウイルスベクターが悪影響を及ぼす可能性があるため、依然としてリスクの高い選択肢です。たとえば、挿入変異を引き起こし、癌につながる可能性があります。^{[ 48 ] [ 49 ]}しかし、有望な結果が得られています。^{[ 50 ] [ 51 ]}

発現ベクターは、分子生物学およびバイオテクノロジーにおいて、クローン化された遺伝子を宿主細胞内で発現させるための基本的なツールであり、遺伝子機能の研究や組換えタンパク質の生産を可能にします。研究におけるその広範な利用のため、参照発現ベクターは、公共の生物資源センターや非営利のリポジトリによって保存されており、世界中の科学者が標準化された材料にアクセスしやすくなっています。こうしたリポジトリには、BCCM/GeneCornerやAddgeneなどがあります。