彼のタグ

ポリヒスチジンタグは、最も一般的には6つのヒスチジン残基から構成されます。ただし、最大12個のヒスチジン残基を持つタグや、短いリンカーを介して取り付けられたデュアルタグも珍しくなく、アフィニティー樹脂への結合を強化することで精製結果を改善し、洗浄の厳密性を高め、内因性タンパク質からの分離を可能にする可能性があります。^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}このタグは、ほとんどの精製タグに共通する方法を使用して、目的の遺伝子に追加できます。最も基本的な方法は、目的の遺伝子をポリヒスチジンタグ配列を含むベクターにサブクローニングすることです。さまざまな発現システムで使用するための多くのベクターが、さまざまな位置にポリヒスチジンタグがあり、異なるプロテアーゼ切断部位、他のタグなどを備えています。^{[ 9 ]}ただし、適切なベクターが入手できない場合、またはタグをタンパク質のN末端またはC末端以外の場所に挿入する必要がある場合は、ポリヒスチジンタグ配列を含む目的遺伝子を直接合成するか、 PCRに基づくさまざまな方法を使用してタグを遺伝子に追加することができます。一般的なアプローチは、ポリヒスチジンタグのコード配列をオーバーハングとしてPCRプライマーに追加することです。 ^{[ 10 ] [ 11 ]}

最も一般的には、ポリヒスチジンタグはタンパク質のN末端またはC末端に融合され、プロテアーゼ切断部位を含む可能性のある短い柔軟なリンカーを介して結合されます。 ^{[ 10 ] [ 9 ]}あまり一般的ではありませんが、タグはN末端とC末端の両方に追加したり、露出したループ内などのタンパク質の中間部分に挿入したりすることもできます。^{[ 12 ] [ 8 ]}タグの位置の選択は、各タンパク質の特性と選択した精製戦略に依存します。タグを異なる位置に付けた複数のコンストラクトをテストする必要があるかもしれません。^{[ 6 ] [ 10 ]}ポリヒスチジンタグは通常、タンパク質の特性を変化させないと考えられていますが、タグの追加によって、タンパク質のオリゴマー状態に影響を与えるなど、望ましくない影響が生じる可能性があることが実証されています。^{[ 13 ]}

固体樹脂支持体に結合した様々な担体マトリックスが市販されており、これらに金属カチオンを充填することができる。この目的にはイミノ二酢酸（IDA）およびニトリロ三酢酸（NTA）の誘導体が最も頻繁に使用され、様々な用途において異なるマトリックスにはそれぞれ利点と欠点がある。^{[ 14 ]}

いくつかの金属カチオンは、Hisタグの官能基であるイミダゾールに対して高い親和性を示します。二価カチオンM ²⁺（M = Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Znなど）遷移金属イミダゾール錯体がこの目的で最も頻繁に使用されます。カチオンの選択は、一般的に結合容量と純度の間の妥協点です。ニッケルはこれらの要素のバランスが良いためよく使用されますが、コバルトは内因性タンパク質に対する親和性が低いため、精製の純度を高めたい場合は使用できます。ただし、結合容量はニッケルに比べて低くなります。^{[ 14 ] [ 10 ]}

Hisタグ付きタンパク質をキャリアから溶出させるには、いくつかの方法があり、必要に応じて組み合わせて使用​​することも可能です。タンパク質の変性を避けるため、一般的にはできるだけ穏やかな方法を用いることが望ましいです。

• 類似製品との競争

Hisタグ付きタンパク質をキャリアから遊離させるには、Hisタグと類似した構造を持ち、かつ固定化された金属イオンと配位錯体を形成する化合物を用いる。キャリア上のHisタグ付きタンパク質にこのような化合物を添加すると、固定化された金属イオンをめぐってタンパク質と競合する。高濃度で添加された化合物は、キャリアに結合したタンパク質をほぼ完全に置換し、その結果、キャリアから溶出される。イミダゾールはヒスチジンの側鎖であり、溶出には通常100～500 mMの濃度で使用される。ヒスチジン自体も使用できる。

• pHの低下

pHが低下すると、ヒスチジン残基がプロトン化され、金属タグとの結合が不可能になるため、タンパク質が溶出される。金属イオンとしてニッケルを用いた場合、pH約4で溶出され、コバルトを用いた場合はpH約6で溶出される。

• 金属イオンの除去

EDTAのような強力なキレート剤を添加すると、担体に固定化されていた金属イオンが失われるため、タンパク質は担体から分離する。