lacオペロン

大腸菌を含む細菌の表現型を表すために、3文字の略語が用いられる。

例としては以下のようなものがあります。

• ラク（乳糖を利用する能力）、
• 彼（アミノ酸ヒスチジンを合成する能力）
• 運動性（遊泳運動）
• Sm ^R（抗生物質ストレプトマイシンに対する耐性）

Lac の場合、野生型細胞は Lac ⁺であり、ラクトースを炭素源およびエネルギー源として利用できますが、Lac ⁻変異体誘導体はラクトースを利用できません。特定の表現型に関与する遺伝子をラベル付けするために、通常は同じ 3 文字 (小文字、イタリック体) が使用されますが、それぞれの異なる遺伝子はさらに追加の文字で区別されます。酵素をコードするlac遺伝子は、 lacZ、lacY、およびlacAです。4 番目のlac遺伝子は、ラクトース リプレッサーをコードするlacIです。「I」は誘導性を表します。

酵素をコードする構造遺伝子と、遺伝子発現に影響を与えるタンパク質をコードする調節遺伝子を区別することができる。現在の用法では、表現型の命名法をタンパク質にも適用するように拡張している。例えば、LacZはlacZ遺伝子のタンパク質産物であるβ-ガラクトシダーゼである。遺伝子ではない様々な短い配列も遺伝子発現に影響を与える。例えば、 lacプロモーター（lac p）やlacオペレーター（lac o）などである。厳密には標準的な用法ではないが、歴史的な理由から、 lac oに影響を与える変異はlac o ^cと呼ばれる。

lacリプレッサーは、同一のサブユニットからなる四量体タンパク質である。各サブユニットは、DNAに結合可能なヘリックス・ターン・ヘリックス（HTH）モチーフを含んでいる。リプレッサーが結合するオペレーター部位は、逆反復対称性を持つDNA配列である。オペレーターの2つのDNAハーフサイトは、リプレッサーの2つのサブユニットに結合する。このモデルでは、リプレッサーの他の2つのサブユニットは何も機能していないが、この性質は長年理解されていなかった。

最終的に、 lac調節にはさらに 2 つのオペレーターが関与していることが発見されました。 ^{[ 11 ]} 1 つ (O _{3 ) は}lacI遺伝子の末端でO ₁の約 -90 bp 上流に位置し、もう 1 つ (O _{2 ) は}lacZの初期部分でO ₁の約 +410 bp 下流に位置しています。これらの 2 つの部位は、機能が重複しており、個々の変異が抑制にあまり影響しないため、初期の研究では発見されませんでした。O ₂または O _{3のいずれかの単一変異は、2 ～ 3 倍の効果しかありません。しかし、O 2}と O ₃の両方に欠陥のある二重変異体が劇的に脱抑制される (約 70 倍)という事実によって、それらの重要性が実証されています。

現在のモデルでは、lacリプレッサーはメインオペレーターO1とO2またはO3のいずれかに同時に結合している_。介在_するDNA_は複合体からループ状に伸びている。2つのマイナーオペレーターが冗長であることから、重要なのは特定のループ状複合体ではないと考えられる。一つの考え方として、このシステムはテザリングによって機能しているというものがある。結合したリプレッサーが一時的にO1から解離しても_{、マイナーオペレーターへの結合によってその近傍に留まり、すぐに再結合できる。これにより、リプレッサーのO1}に対する親和性が高まる。

誘導メカニズム

リプレッサーはアロステリックタンパク質であり、つまり、互いに平衡状態にある2つのわずかに異なる形状のいずれかをとることができます。一方の形状では、リプレッサーはオペレーターDNAに高い特異性で結合し、もう一方の形状では特異性を失います。古典的な誘導モデルによれば、アロラクトースまたはIPTGのいずれかの誘導物質がリプレッサーに結合すると、リプレッサーの2つの形状間の分布に影響します。したがって、誘導物質が結合したリプレッサーは、非DNA結合コンフォメーションで安定化されます。しかし、この単純なモデルではすべてを説明できません。なぜなら、リプレッサーはDNAに非常に安定して結合しているにもかかわらず、誘導物質の添加によって急速に解離するからです。したがって、リプレッサーがすでにDNAに結合している場合でも、誘導物質がリプレッサーに結合する可能性があることは明らかです。結合の正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。^{[ 12 ]}

ラクトースオペロンの研究に有用なラクトース誘導体または類似体が数多く報告されている。これらの化合物は主に置換ガラクトシドであり、ラクトースのグルコース部分が別の化学基に置き換えられている。

• イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）は、生理学的研究においてlacオペロンの誘導剤として頻繁に使用される。 IPTGはリプレッサーに結合して不活性化しますが、β-ガラクトシダーゼの基質ではありません。in vivo研究におけるIPTGの利点の1つは、大腸菌によって代謝されないことです。その濃度は一定のままであり、 lac p/o制御遺伝子の発現速度は実験で変動しません。IPTGの摂取は、 P. fluorescensではラクトースパーミアーゼの作用に依存しますが、大腸菌では依存しません。^{[ 14 ]}
• フェニル-β-D-ガラクトース（フェニル-Gal）はβ-ガラクトシダーゼの基質ですが、リプレッサーを不活性化しないため、誘導物質ではありません。野生型細胞はβ-ガラクトシダーゼをほとんど産生しないため、フェニル-Galを炭素源およびエネルギー源として増殖できません。リプレッサーを欠損した変異株はフェニル-Gal上で増殖できます。したがって、炭素源およびエネルギー源としてフェニル-Galのみを含む最小培地は、リプレッサー変異株およびオペレーター変異株を選択的に増殖させます。野生型株の10⁸個の細胞をフェニル-Galを含む寒天培地に播種すると^、増殖するまれなコロニーは主にリプレッサーに影響を与える自然発生変異株です。リプレッサー変異株とオペレーター変異株の相対的な分布は、標的のサイズによって影響を受けます。リプレッサーをコードするlacI遺伝子はオペレーターの約50倍大きいため、選択ではリプレッサー変異株が優勢になります。
• チオメチルガラクトシド[TMG]は別のラクトース類似体である。これらはlacIリプレッサーを阻害する。誘導物質濃度が低い場合、TMGとIPTGの両方がラクトース透過酵素を介して細胞内に入ることができる。しかし、誘導物質濃度が高い場合、両方の類似体は独立して細胞内に入ることができる。TMGは細胞外濃度が高い場合、増殖速度を低下させることができる。^{[ 15 ]}
• その他の化合物は、β-ガラクトシダーゼ活性の色彩指標として機能する。
  • ONPGは分解されて濃い黄色の化合物であるオルトニトロフェノールとガラクトースを生成し、一般的にin vitroでのβ-ガラクトシダーゼのアッセイの基質として使用されます。^{[ 16 ]}
  • β-ガラクトシダーゼを産生するコロニーは、 β-ガラクトシダーゼの人工基質であるX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）によって青色に変化します。X-galの切断によりガラクトースと4-Cl,3-Brインジゴが生成され、濃い青色になります。^{[ 17 ]}
• アロラクトースはラクトースの異性体であり、 lacオペロンの誘導物質です。ラクトースはガラクトース-β(1→4)-グルコースであるのに対し、アロラクトースはガラクトース-β(1→6)-グルコースです。ラクトースは、加水分解反応とは別の反応でβ-ガラクトシダーゼによってアロラクトースに変換されます。大腸菌細胞内で「真の」誘導物質を生成する上でのLacZの役割を示す生理学的実験として、 lacZのヌル変異株は、アロラクトースの非加水分解性アナログであるIPTGとともに培養するとLacYパーミアーゼを生成できますが、ラクトースとともに培養すると生成できないという観察結果があります。これは、細胞内で誘導物質を生成するには、ラクトースからアロラクトースへの処理（β-ガラクトシダーゼによって触媒される）が必要であることを説明しています。

^{ジェイコブとモノ[ 21 ]}の概念的ブレークスルーは、調節物質と、それらが遺伝子発現を変化させる作用部位との区別を認識したことだった。元兵士のジェイコブは、特別な無線送信または信号を受信すると致死性の貨物を放出する爆撃機のアナロジーを使用した。機能するシステムには、地上送信機と航空機内の受信機の両方が必要である。ここで、通常の送信機が故障したとしよう。このシステムは、2番目の機能する送信機を導入することで機能させることができる。対照的に、欠陥のある受信機を持つ爆撃機を考えてみよう、と彼は言った。この爆撃機の挙動は、2番目の機能する航空機を導入しても変更できない。

lacオペロンの調節変異体を解析するために、Jacobはlac遺伝子（lacIとそのプロモーター、およびlacZYAとそのプロモーターとオペレーター）の2つ目のコピーを1つの細胞に導入できるシステムを開発した。lac遺伝子に関しては二倍体であるが、それ以外は正常なこのような細菌の培養物について、調節表現型を検査する。特に、IPTGが存在しない場合でもLacZとLacYが産生されるかどうか（変異遺伝子によって産生されるラクトースリプレッサーが機能しないため）を調べる。このように遺伝子または遺伝子クラスターをペアで検査する実験は、相補性試験と呼ばれる。

このテストは図に示されています（簡略化のためlacAは省略されています）。まず、特定の半数体状態（つまり、細胞がlac遺伝子を 1 コピーのみ持つ状態）が示されています。パネル (a) は抑制、(b) は IPTG による誘導、(c) と (d) はそれぞれlacI遺伝子またはオペレーターの変異の影響を示しています。パネル (e) では、リプレッサーの相補性テストが示されています。lac 遺伝子の 1 コピーが lacI に変異を持ち、もう 1 コピーが lacI の野生型である場合、結果として生じる表現型は正常ですが、誘導物質 IPTG に曝されると lacZ が発現します。リプレッサーに影響を与える変異は野生型に対して劣性（野生型は優性）であると言われており、これはリプレッサーが細胞内を拡散できる小さなタンパク質であるという事実によって説明されます。欠陥のあるlacI遺伝子に隣接するlacオペロンのコピーは、2 つ目のlacIコピーから生成されるタンパク質によって効果的に遮断されます。

同じ実験をオペレーター変異を用いて行うと、異なる結果が得られる（図（f））。変異型オペレーター部位と野生型オペレーター部位をそれぞれ1つずつ持つ細胞の表現型は、誘導物質IPTGが存在しない場合でもLacZとLacYが産生されることである。これは、損傷したオペレーター部位が、構造遺伝子の転写を阻害するリプレッサーの結合を許さないためである。このオペレーター変異は優性である。リプレッサーが結合しなければならないオペレーター部位が変異によって損傷した場合、同じ細胞内に2つ目の機能的な部位が存在しても、変異部位によって制御される遺伝子の発現には影響しない。

この実験のより洗練されたバージョンでは、標識されたオペロンを使用してlac遺伝子の 2 つのコピーを区別し、制御されていない構造遺伝子が変異オペレーターの隣にあることを示す (パネル (g))。たとえば、一方のコピーがlacZ を不活性化する変異によって標識され、LacY タンパク質のみを生成できる一方、もう 1 つのコピーはlacYに影響を与える変異を持ち、LacZ のみを生成できるとします。このバージョンでは、変異オペレーターに隣接するlacオペロンのコピーのみがIPTG なしで発現されます。オペレーターの変異はシス優性であると言います。これは野生型に対して優性ですが、すぐ隣にあるオペロンのコピーにのみ影響します。

この説明は重要な点で誤解を招く。なぜなら、実験の説明から始まって、結果をモデルに基づいて説明しているからである。しかし実際には、モデルが先に作られ、そのモデルを検証するために実験が考案されることが多い。ヤコブとモノは、まずDNAの中にオペレーターの特性を持つ部位が存在するはずだと考え、それを証明する相補性試験を設計したのである。

オペレーター変異体の優勢性は、それらを特異的に選択する手順を示唆している。上記のように、フェニルガラクトースを用いて野生型培養物から調節変異体を選択する場合、標的サイズが非常に小さいため、リプレッサー変異体と比較してオペレーター変異はまれである。しかし、代わりにlac領域全体を2コピー持つ株（つまりlacに関して二倍体）から始めると、リプレッサー変異（依然として発生する）は回収されない。これは、2番目の野生型lacI遺伝子による相補作用によって野生型表現型が付与されるためである。対照的に、オペレーターの1コピーの変異は、2番目の野生型コピーに対して優性であるため、変異表現型を付与する。

出典: ^{[ 22 ]}

二相性増殖の解明は、古典的モデルで説明されているもの以外の、lac遺伝子に影響を与える追加の変異の特性評価に依存していた。その後、 lac遺伝子から遠く離れた位置にマッピングされたcya遺伝子とcrp遺伝子という2つの遺伝子が同定され、これらの遺伝子に変異が生じると、 IPTG存在下、さらにはリプレッサーやオペレーターを欠く細菌株においても、発現レベルが低下することがわかった。大腸菌におけるcAMPの発見により、 cya遺伝子に欠陥があるがcrp遺伝子には欠陥がない変異株は、培地にcAMPを添加することで完全な活性に回復できることが実証された。

cya遺伝子は、cAMPを生成するアデニル酸シクラーゼをコードしています。cya変異体では、cAMPの欠如により、lacZYA遺伝子の発現が正常の10分の1以下になります。cAMPを添加すると、cya変異体に特徴的な低Lac発現が補正されます。2番目の遺伝子crpは、カタボライト活性化タンパク質（CAP）またはcAMP受容体タンパク質（CRP）と呼ばれるタンパク質をコードしています。^{[ 23 ]}

しかし、グルコースとラクトースの両方が存在する場合、ラクトース代謝酵素は少量ながら生成されます（これをリーキー発現と呼ぶこともあります）。これは、CAPが存在しない場合でもRNAポリメラーゼが結合して転写を開始できることがあるためです。リーキー発現は、グルコース源が消費された後、lac発現が完全に活性化される前に、一部のラクトースを代謝するために必要です。

要約すれば：

• ラクトースが存在しない場合、Lac酵素の産生は非常に少なくなる（オペレーターにはLacリプレッサーが結合している）。
• ラクトースが存在するが、好ましい炭素源（グルコースなど）も存在する場合、少量の酵素が生成される（Lacリプレッサーはオペレーターに結合しない）。
• グルコースが存在しない場合、CAP-cAMPはプロモーターの上流にある特定のDNA部位に結合し、RNAポリメラーゼ（RNAP）と直接的なタンパク質間相互作用を起こし、RNAPのプロモーターへの結合を促進する。

成長段階間の遅延は、十分な量の乳糖代謝酵素を生成するのに必要な時間を反映しています。まず、CAP調節タンパク質がlacプロモーター上に集合し、 lac mRNAの産生が増加します。lac mRNAのコピー数が増えると、LacZ（β-ガラクトシダーゼ、乳糖代謝用）とLacY（乳糖を細胞内に輸送する乳糖透過酵素）のコピー数が著しく増加します（翻訳を参照）。乳糖代謝酵素のレベルを上げるのに必要な遅延の後、細菌は新たな急速な細胞増殖段階に入ります。

カタボライト抑制の2つの謎は、cAMPレベルがグルコースの存在とどのように連動しているか、そしてなぜ細胞がわざわざそうするのかという点に関係している。ラクトースが分解されると、実際にはグルコースとガラクトース（グルコースに容易に変換される）が生成される。代謝の観点から言えば、ラクトースはグルコースと同様に優れた炭素源およびエネルギー源である。cAMPレベルは細胞内グルコース濃度ではなく、アデニル酸シクラーゼの活性に影響を与えるグルコース輸送速度に関係している。（さらに、グルコース輸送はラクトース透過酵素の直接的な阻害にもつながる。）大腸菌がなぜこのように機能するのかについては、推測するしかない。すべての腸内細菌はグルコースを発酵するため、グルコースに頻繁に遭遇することを示唆している。グルコースとラクトースの輸送または代謝の効率のわずかな違いが、細胞がこのようにlacオペロンを制御することを有利にしている可能性がある。 ^{[ 24 ]}