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マルチクローニングサイト（MCS）は、ポリリンカーとも呼ばれ、多数の（最大約20個の）制限酵素部位を含む短いDNA断片であり、人工プラスミドの標準的な特徴である。[ 1 ] MCS内の制限酵素部位は通常一意であり、特定のプラスミド内に1回しか存在しない。プラスミドにおけるMCSの目的は、DNA断片をその領域に挿入できるようにすることである。[ 2 ]
MCSは、標的DNAのコピー数を増やすためのクローニングベクターや、タンパク質産物を作成するための発現ベクターなど、さまざまなベクターに見られます。 [ 3 ]発現ベクターでは、MCSは遺伝子転写を可能にするためにプロモーターの下流に位置しています。[ 2 ] MCSは、lacZαなどの非必須遺伝子内に挿入されることが多く、組換え体選択のための青白スクリーニングを容易にします。[ 4 ]さまざまな制限酵素の認識配列を含めることで、MCSは分子クローニングワークフローの柔軟性と効率を大幅に向上させ、合成生物学、遺伝子工学、およびトランスジェニック生物の開発において正確なDNA挿入を可能にします。[ 1 ] [ 4 ]
場合によっては、ベクターに MCS が含まれていないことがあります。むしろ、ベクターに MCS を追加することができます。[ 5 ]最初のステップは、制限酵素部位と、消化後にベクターに相補的な追加の塩基を含む相補的なオリゴヌクレオチド配列を設計することです。次に、オリゴヌクレオチド配列をアニーリングして、消化および精製されたベクターにライゲーションすることができます。消化されたベクターは、オリゴヌクレオチド挿入オーバーハングに相補的な制限酵素で切断されます。ライゲーション後、ベクターを細菌に形質転換し、シーケンスによって挿入を確認します。この方法は、マルチクローニングサイトに新しい制限部位を追加するためにも使用できます。
複数のクローニングサイトは、ベクターの完全性を維持しながら柔軟性を最大限に高めるように戦略的に設計されています。主な考慮事項は、独自の制限酵素認識配列を含めることです。つまり、各制限部位は、消化中にオフターゲット切断を防ぐために、プラスミドのバックボーンに一度だけ出現します。これらの酵素は、さまざまな切断オプション（たとえば、平滑末端と粘着末端）を提供するように選択され、不要な断片化を避けるために、その認識部位が必須ベクター要素または挿入配列自体に出現しないことが確認されています。[ 6 ]
方向性クローニングは、挿入領域を挟む2つの異なる制限酵素を使用して、遺伝子が単一の方向で組み込まれることを保証するもう1つの重要な設計戦略です。この方法は、単一の制限部位を使用する非方向性クローニングで必要となる方向のスクリーニングの必要性を最小限に抑えます。[ 7 ]
発現ベクターの場合、MCSはN末端またはC末端タグとインフレームで配置されることが多く、挿入されたコード配列が正しいオープンリーディングフレームに留まるようにします。特に融合タンパク質構築物では、リーディングフレームの連続性を維持するために追加のヌクレオチドが加えられることがあります。さらに、制限酵素部位を挟む短いバッファー配列は、適切な結合と切断に十分なDNAを提供することで、酵素活性の向上に役立ちます。[ 8 ]
マルチクローニングサイトは、プラスミドの残りの部分を破壊することなく外来DNAを挿入できる機能であり、バイオテクノロジー、バイオエンジニアリング、および分子遺伝学において非常に有用です。[ 1 ] MCSは、遺伝子工学を使用して、より一般的には遺伝子組み換え生物（GMO）として知られるトランスジェニック生物の作製に役立ちます。遺伝子工学でMCSを利用するには、MCSが切り開かれる製造中に、目的の遺伝子をベクターに追加する必要があります。[ 9 ] MCSが作製され、連結されると、目的の遺伝子が含まれ、細菌宿主内で遺伝子コピー数を増やすために増幅できます。細菌が複製された後、目的の遺伝子を細菌から抽出できます。場合によっては、発現ベクターを使用してタンパク質製品を作成できます。製品が分離された後、インスリンの製造、ワクチンの作成、抗生物質の製造、遺伝子治療の作成など、さまざまな用途があります。
マルチクローニングサイトは有用であるものの、いくつかの制限がある。よくある問題は、ベクターと挿入配列の両方に適合する固有の制限酵素部位が限られていることである。挿入遺伝子にMCS内の酵素に対する内部認識配列が含まれている場合、消化中に切断される可能性があり、部位特異的変異導入または代替クローニング戦略が必要となる。[ 10 ]
さらに、複数の隣接する制限酵素部位が存在すると、mRNA転写産物中にヘアピンやステムループなどの二次構造が形成されることがあります。これらの構造、特に5'非翻訳領域（UTR）にある構造は、リボソームの結合を妨げ、挿入された遺伝子の翻訳効率を低下させる可能性があります。[ 11 ]
もう一つの制限は、配列コンテキストの変動性にある。同じ MCS 内の異なる制限部位にクローンされた挿入物は、異なる上流または下流の非翻訳領域を持つ可能性があり、mRNA の安定性、転写終結、またはタンパク質発現に影響を与える。[ 12 ]また、一部の MCS 設計では、特に挿入物を改変または積み重ねる際に、意図せず隠れた調節配列やフレームシフトを導入することがわかっており、実験間の再現性を妨げる可能性がある。
MCSは、使用されるベクターの種類に応じて、明確な構造的特徴を持つ。
クローニングベクターでは、MCSは通常、pUCベクターのlacZα遺伝子などの選択マーカー内に配置されます。この構成により、MCSへの外来DNAの挿入によってマーカー遺伝子が不活性化されるため、組換えプラスミドの効率的なスクリーニングが可能になり、青白スクリーニングやその他の選択方法が可能になります。[ 4 ]この領域のMCSには、ベクターへの外来DNAの挿入を可能にするために利用できる多くの制限酵素部位があります。この挿入により、選択マーカーの連続性が破壊され、機能しなくなり、挿入の選択が可能になります。[ 4 ] 目的の遺伝子は、このタイプのベクターのMCSに挿入され、その後、複製および増殖するために細菌に導入されます。このベクターにより、実験に使用するための特定のDNA配列を迅速に蓄積できます。[ 13 ]
発現ベクターでは、遺伝子発現を制御するために、MCSがプロモーターとターミネーターの間に配置されます。上流のプロモーターは構成的または誘導性であり、特定の化学誘導物質に反応することができます。一方、下流のターミネーターは転写の適切な終結を促進し、プラスミドの安定性を高めます。[ 4 ]このタイプのベクターのMCSは、その後の発現（転写と翻訳）のために目的の遺伝子を挿入することを可能にします。プロモーターとターミネーター配列の間にMCSを配置することで、開始配列と終結配列を持つ機能的に発現する遺伝子の作成が容易になります。[ 4 ]これらのベクターは、特定の遺伝子の発現を細胞内で誘導するために、原核細胞または真核細胞に準備され挿入されます。 [ 14 ]
レポーターベクターでは、通常、MCSは蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェラーゼ、またはlacZなどのレポーター遺伝子の近くに配置されます。これにより、プロモーター配列をMCSに追加して、レポーター遺伝子の発現をモニタリングすることで、プロモーター活性と遺伝子制御の研究を容易にすることができます。 [ 4 ] MCSは、さまざまなタイプのプロモーターを簡単かつ柔軟に挿入できるため、レポーター遺伝子の発現レベルを研究して、特定のプロモーターの動態を理解するために使用できます。[ 4 ]
マルチクローニングサイトは、治療遺伝子の挿入を容易にするためにウイルスベクターで広く使用されています。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターでは、通常、逆方向末端反復配列（ITR）内のプロモーターとポリアデニル化シグナルの間にMCSが挿入され、組織特異的発現のための目的遺伝子のシームレスなクローニングが可能になります。[ 16 ]
分裂細胞および非分裂細胞への安定した遺伝子導入によく用いられるレンチウイルスベクターは、蛍光レポーター、転写因子、 shRNA発現カセットなど、多様な挿入物を収容するための中央MCSを備えていることが多い。[ 17 ] MCSの存在により、ベクターの再設計を必要とせずにレンチウイルスバックボーンを迅速にカスタマイズできるため、遺伝子治療アプローチの汎用性が向上する。
さらに、アデノウイルスシャトルプラスミドには、ウイルスゲノムの欠失したE1またはE3領域を置き換えるMCS領域が含まれており、トランスジーンの挿入を容易にします。これらのモジュール型プラスミドは、アデノウイルスバックボーンと組み換えられ、複製欠損ベクターが生成されます。[ 18 ]これにより、MCSは多様なウイルス送達システム全体にわたる普遍的な挿入部位として機能します。
スタンレー・N・コーエンとハーバート・W・ボイヤーは1973年に、異なる種の遺伝子を細菌細胞に挿入して発現させることができることを実証する実験を行った。[ 19 ]彼らは、細菌種サルモネラ・パナマ由来の天然プラスミドであるプラスミドpSC101を使用し、これを単一のEcoRI制限酵素部位とテトラサイクリン耐性遺伝子を持つように改変した。[ 19 ] pSC101プラスミドには正式なマルチクローニング部位はなかったが、その設計は遺伝子挿入における制限酵素部位の有用性を強調し、ベクターにおける制限酵素構築物を拡張してクローニング部位の柔軟性を高めるための基礎となった。[ 20 ]
これまでの研究から、1977年に科学者のフランシスコ・ボリバルとレイモンド・L・ロドリゲスはpBR322プラスミドを構築した。[ 21 ]正式にはマルチクローニングサイトではないものの、このプラスミドは複数の固有の制限酵素部位を持つ最初のベクターの1つであった。[ 21 ]これらの部位は、抗生物質耐性遺伝子やlacZなどの配列の戦略的な場所に挿入され、組換えクローンを識別するための挿入不活化に使用できた。[ 21 ] [ 22 ]これにより、外来DNA断片の挿入の柔軟性が高まり、pUC部位などの将来のベクターに指定されたMCS領域を持つという大きな進歩が示された。
pUCベクターシリーズは、1982年にジェフリー・ヴィエイラとヨアヒム・メッシングによってM13mp7から構築されました。[ 23 ]これらのベクターには、多数の独立した制限酵素部位を持つ特定の領域があり、MCSの概念を正式に定義しています。[ 23 ] pUCベクターは、配列決定とクローニングを容易にし、分子クローニング手順を大幅に向上させました。[ 23 ]
MCS設計における近年の進歩により、クローニングはより効率的、柔軟、かつ容易に行えるようになり、分子生物学において頻繁に利用されるようになった。
現代の合成生物学は、モジュール式で拡張可能な遺伝子アセンブリを可能にするために、MCS アーキテクチャの革新を推進してきました。BioBrick 標準は、パーツの接合部を標準化するために、フランキング制限部位 (EcoRI、XbaI、SpeI、PstI など) の使用を先駆的に導入し、プロモーター、遺伝子、ターミネーターなどの遺伝要素を共通のフレームワークに相互にクローニングできるようにしました。これを基に、Modular Cloning (MoClo) やGolden Gate Assemblyなどの新しいシステムでは、認識部位の外側を切断する Type IIS 制限酵素を使用し、単一の反応で複数のパーツを無傷かつ方向性をもって挿入できるようにしています。[ 6 ]これらのシステムは通常、シームレスなマルチパーツアセンブリを可能にするために、フランキング BsaI または BsmBI 部位を持つ MCS 領域を設計しています。
一部のプラットフォームでは、ベクターバックボーン、発現ホスト、またはアセンブリ方法間で互換性を可能にする相同アームまたはユニークサイトに挟まれた最適化された短い配列であるユニバーサルMCSが導入されています。[ 24 ]このようなモジュール性により、クローニングワークフローが効率化され、エラーが減り、合成生物学ラボ全体での標準化が向上します。
MCSにおける制限酵素部位の配置と戦略的な選択は、柔軟性と互換性を最適化し、潜在的なクローニングの問題を軽減します。また、幅広い実験やアプリケーションに対応するための作業性と汎用性を向上させます。MCSでは、近接した複数の固有の制限酵素部位の存在により、酵素選択の制約が少なくなります。[ 4 ]このような設計により、特定の位置での酵素切断が可能になり、さまざまなアプリケーションに合わせて特定のMCS挿入と変更が可能になります。[ 4 ] pUC19やその他のpUCプラスミドなど、広く使用されているプラスミドは、効果的なクローニングを容易にするために、MCSに制限酵素部位を意図的に配置しており、分子利用におけるMCSの柔軟性に貢献しています。[ 25 ]
バイオインフォマティクスと分子技術の進歩により、望ましくない制限部位の特定と除去が可能になり、クローニングのプロセスが効率化されます。バイオインフォマティクスツールは、MCSまたはベクターバックボーン内の不要な制限部位のスクリーニングと特定に役立ちます。[ 4 ]不要な制限部位は、その位置に応じてタンパク質発現に大きな変動を引き起こす可能性があり、MCSに位置する場合は、目的遺伝子の発現を非常に強く制限するものもあります。[ 4 ]これらの問題のある部位を攻撃して除去することで、研究者は均一で効果的なタンパク質発現を得るためのMCSを作成できます。[ 4 ]
現代の MCS はモジュール性を念頭に置いて設計されており、遺伝要素の統合や交換が容易で、特に合成生物学の分野で有益です。MCS 構築における標準化された隣接遺伝子配列により、遺伝要素の容易な置換が可能になります。[ 4 ]モジュール設計により、特定の研究ニーズに合わせてベクターを迅速に組み立て、カスタマイズできます。[ 4 ] MoClo システムは、モジュール設計により、DNA 断片をマルチジーン構築物に効率的に組み立てることができます。[ 26 ] [ 27 ]このシステムにより、DNA 断片 (不要な配列なし) を簡単に結合できるため、プロセスのサイズ効率と効率が向上します。[ 26 ]例えば、MoClo システムは、異なる MCS 由来のプロモーター配列とコーディング配列など、2 つの遺伝子を不要な配列を組み込むことなく、単一のマルチジーン構築物に効率的に結合できます。[ 26 ]
現代の MCS は、高度なクローニング技術と互換性を持つように設計されており、遺伝子操作の精度と効率を高めています。現代の MCS 設計は、ギブソンアセンブリ、ゴールデンゲートクローニング、ユニバーサル MCS などの技術を容易にし、複数の DNA 断片の並列アセンブリなど、従来の制限酵素ベースのプロトコルよりも利点があります。[ 4 ] [ 28 ]このような互換性により、MCS 領域の効率と有用性が向上します。この互換性は、さまざまな遺伝子コンポーネントの効果的かつ正確なアセンブリが複雑な遺伝子回路や代謝経路の構築に不可欠な遺伝子工学や合成生物学において不可欠です。[ 4 ]
MCS近傍の配列コンテキストに細心の注意を払うことで、効果的なクローニングと適切な遺伝子発現が保証されます。MCS内のDNA構成要素（プロモーターやオープンリーディングフレームなど）間に生じる可能性のある二次構造を排除することで、制限酵素活性への干渉を防ぎ、MCSの機能を最適化できます。[ 25 ]例えば、5'非翻訳領域内の二次構造はリボソームの結合を妨げ、挿入された遺伝子の翻訳効率を低下させる可能性があります。[ 25 ]さらに、早期終止コドンの追加配置を防ぎ、リーディングフレームの中断を防ぐことで、タンパク質産物を短縮する可能性のある早期終止コドンなどの望ましくない転写または翻訳エラーを排除し、ベクターにおけるMCSの信頼性をさらに最適化できます。[ 25 ]
最適化や進歩にもかかわらず、MCS 設計にはいくつかの課題が残っており、継続的な研究と革新が必要とされています。これらの課題の 1 つは、遺伝子またはベクター内の内部制限部位の発生であり、これは制限酵素の活性とクローニング効率を阻害する可能性があります。[ 25 ]さらに、MCS の構造環境は、意図しない制御特性をもたらす可能性があります。[ 25 ]例えば、プロモーター領域から遠すぎる場所に挿入された MCS は、二次構造の形成を引き起こし、MCS 内の遺伝子の発現を阻害する可能性があります。[ 25 ]また、配列コンテキストの変動 (例えば、プロモーターまたは近位制御要素への近接性の違い) は、不均一な遺伝子発現につながる可能性があります。[ 4 ]この変動は、周囲の配列の変動の結果として生じ、転写効率、mRNA の安定性、または翻訳の開始を阻害する可能性があります。[ 4 ]このような変動を最小限に抑えるためには、さまざまな遺伝子構築物で均一な性能を発揮する標準化された MCS 設計を設計するための革新が必要です。[ 4 ]
遺伝子工学でプラスミドクローニングベクターとして使用される細菌プラスミドの1つはpUC18です。そのポリリンカー領域は、複数の制限酵素認識部位から構成されており、これらは単一のクラスター（ポリリンカー）に設計されています。EcoRI、BamHI、PstIなどのさまざまな制限酵素の制限部位があります。遺伝子工学で使用されるもう1つのベクターはpUC19で、pUC18に似ていますが、ポリリンカー領域が逆になっています。大腸菌は、入手しやすさ、成長速度の速さ、汎用性から、細菌宿主としてもよく使用されます。挿入タンパク質を改変するプラスミドクローニングベクターの例は、pFUSE-Fcプラスミドです。
インスリンを遺伝子操作するには、まず使用するプラスミドのMCSを切断します。[ 29 ] MCSが切断されると、ヒトインスリンの遺伝子を追加してプラスミドを遺伝子操作することができます。その後、遺伝子操作されたプラスミドを細菌宿主に入れ、分裂させます。需要の高い大量生産を行うために、宿主細胞を宿主にとって最適な環境である大型発酵槽に入れます。プロセスは、宿主からインスリンを濾過することで完了します。その後、精製が行われ、インスリンは包装されて糖尿病患者に配布されます。
マルチクローニングサイトは、CRISPR遺伝子編集システムにおいて中心的な役割を果たします。多くのCRISPR- Cas9プラスミドは、U6プロモーターのすぐ下流にMCSを備えており、BbsIやBsmBIなどのIIS型制限酵素部位に挟まれています。この設計により、標的編集用の20ヌクレオチドのシングルガイドRNAをコードする合成オリゴヌクレオチドを効率的に挿入できます。[ 30 ]
CRISPRマルチプレックスは、多くの場合、タンデムMCSに依存しており、複数のシングルガイドRNA発現カセットが単一のベクターにクローニングされます。ゴールデンゲート法またはギブソンアセンブリ法を使用すると、標準化されたMCSを介して複数のガイドを挿入でき、複数の遺伝子座の同時ノックアウトまたは制御が可能になります。[ 31 ]
さらに、相同組換え修復（HDR）に用いられるCRISPRプラスミドには、蛍光レポーターやエピトープタグなどのドナーテンプレートを挿入するためのMCS（マルチコントロール部位）がしばしば含まれている。MCSの存在により、挿入配列の構成と位置を正確に制御できるため、複雑な実験に適したゲノム編集ベクターを容易にカスタマイズできる。