Loading article…
分子生物学の分野では、エピトランスクリプトームは細胞内のRNA（トランスクリプトーム）のすべての生化学的修飾を含みます。[ 1 ]「ヌクレオチド配列の変化を伴わない、ゲノムに対する機能的に関連する変化」を説明するエピジェネティクスに類似して、エピトランスクリプトミクスはリボヌクレオチド配列の変化を伴わない、トランスクリプトームに対するすべての機能的に関連する変化を含みます。したがって、エピトランスクリプトームは、そのような機能的に関連する変化の集合として定義できます。
遺伝子発現に影響を与えるRNA修飾にはいくつかの種類があります。これらの修飾は、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、小型核RNA（snRNA）など、多くの種類の細胞内RNAで起こります。現在、最も一般的でよく理解されているmRNA修飾はN6-メチルアデノシン（m6A ）であり、これはmRNA分子1つあたり平均3回発生することが観察されています。
現在、研究はRNA修飾の種類と場所の特定[ 2 ] 、これらの修飾に機能があるかどうか、ある場合はその作用機序は何かの解明に重点が置かれている。エピゲノムと同様に、エピトランスクリプトームにはRNAにマークを付ける「ライター」と「イレイザー」、そしてそれらのマークを機能に変換する「リーダー」が存在する。解明された機能の1つは、RNAに作用する酵素アデノシンデアミナーゼ（ADAR）である。ADARは、選択的スプライシング、マイクロRNA、自然免疫系など一連の細胞プロセスに影響を与え、特に中枢神経系の重要な受容体のタンパク質の再コード化につながる。[ 3 ]
m 6 A は、mRNA 内のアデノシン塩基の 6 位の窒素のメチル化を表します。1974 年に発見された[ 4 ] m 6 A は、最も豊富な真核生物mRNA 修飾です。[ 5 ]ほとんどの mRNA には約 3 つの m 6 A 残基が含まれています。[ 6 ]しかし、一部の mRNA 転写産物には m 6 A がまったく含まれていないものもあれば、10 個以上含まれているものもあります。[ 7 ]「エピトランスクリプトーム」という用語は、m 6 A 部位のトランスクリプトーム全体のマッピングに続いて作られましたが、[ 8 ] [ 9 ]他の転写後 mRNA 修飾を必ずしも除外するものではありません。細胞が内因的に m 6 A メチル化のレベルをどのように、またどのような刺激に応答して制御しているかは、現時点では不明です。しかし、このエピトランスクリプトームマークのレベルは、胚発生中に動的に変化することが知られています。さらに、ストレスなどの環境刺激もm6Aのレベルを変化させる可能性がある。[ 10 ]
異なる真核生物のm 6 A mRNAメチロームには、2つの共通の特徴があります。まず、このマークは通常、R[G > A]m 6 AC[U>A>C>]またはRRm 6 ACH配列に見られます。次に、このマークはトランスクリプトームの特定の領域に豊富に存在し、主に終止コドンの近く、3'-UTR、および長い内部エクソンに見られます。[ 6 ]それにもかかわらず、m 6 Aレベルは、細胞内の異なるRNA間、および同じ生物の異なる細胞型間で異なります。一部のタイプのRNAへのm 6 Aの付加を制御するメカニズムは説明されていますが、他のメカニズムは不明のままです。[ 10 ]
真核生物では、mRNAへのm6Aの使用には、一般的に「ライター」と呼ばれるメチルトランスフェラーゼ複合体が関与し、メチル基を導入します。[ 11 ]このm6A修飾は、「リーダー」と呼ばれる特殊なタンパク質によって認識されます。[ 12 ]リーダーの数は、生物によって異なります。特に脊椎動物では、「イレイザー」に分類されるタンパク質の存在がm6Aの除去を促進し、mRNAへのm6Aの沈着を動的に制御することを可能にしていると考えられています。[ 11 ]
m 6 A マークは、転写後にam 6 Aメチルトランスフェラーゼライター複合体によって付加されます。このライター複合体は、 METTL3、METTL14、Wilms 腫瘍 1 関連タンパク質 (WTAP)、KIAA1429、およびRBM15から構成されています。[ 12 ] METTL3 は触媒サブユニットであり、METTL14 は複合体の安定性と RNA のリクルートに関与しています。WTAP も mRNA のリクルートを助けるために必要ですが、RBM15 とそのパラログである RBM15B は lncRNA のリクルートにのみ関与しています。RBM15 と RBM15B が他のタイプの RNA をメチルトランスフェラーゼ複合体にリクルートする役割は不明です。[ 13 ]ライターの特定の認識部位は不明ですが、必要な最小配列は 5'-Rm 6 AC-3' です。[ 7 ] METTL3はm6Aマークの「リーダー」でもあると提唱されている。この機能は細胞質に局在し、そこでeIF3のリクルートを促進する。[ 11 ] METTL3複合体の発見は、m6Aの導入が制御されたプロセスである可能性を示唆しており、これはエピトランスクリプトミクスの分野の進歩と関心にとって極めて重要であった。[ 14 ]
YTHドメインタンパク質ファミリーのメンバーはm6Aの「リーダー」として機能します。これらのタンパク質の研究は、mRNAメチル化の機能と影響を理解する上で重要でした。[ 12 ]ヒトYTHドメインファミリータンパク質の3つのメンバーは、メチル化mRNAに対してより高い結合親和性を持つことが示されています。[ 15 ] YTHタンパク質YTHDF2は、メチル化mRNAを翻訳プールからmRNA分解部位に誘導することでmRNAに影響を与えます。その結果、mRNA上のm6Aの存在は、非メチル化mRNAよりも短い半減期と相関しています。
これまでのところ、m 6 A マークの「消去酵素」は 2 つ特定されています。ALKBH5 は、哺乳類に見られる脱メチル化酵素で、m 6 Aのメチル基を除去します。 [ 12 ] 2 つ目は、脂肪量および肥満関連タンパク質 ( FTO ) で、m 6 A をアデノシンに戻す脱メチル化酵素です。FTO は、mRNA キャップに近いm 6 Aを優先的に脱メチル化します。 [ 12 ]この酸化プロセスには 3 つのステップと 2 つの中間体、N 6 -ヒドロキシメチルアデノシン (hm 6 A) と N 6 -ホルミルアデノシン (f 6 A) があります。FTO は、核斑に最も一般的に見られますが、一部の種では、低レベルの FTO が細胞質にも見られます。[ 6 ] FTO の機能不全は体重の変化や疾患と相関しており、Alkbh5 ノックアウトマウスは生殖能力が低下しています。[ 15 ]これらの2つの事実は、m 6 A修飾の適切な制御が正常な身体機能にとってどれほど重要であるかを反映している。さらに、FTOの変異は、発達障害、脳萎縮、成人期の生理的障害につながる可能性がある。[ 10 ]
mRNAメチル化は、一部の転写産物の代替ポリアデニル化（APA）から始まるmRNAのライフサイクル全体を通して重要です。m6A部位は、多くの場合、最後のエクソン、主に3'非翻訳領域（3'-UTR）に位置しています。3'-UTRにm6Aが存在すると、近位APA部位の使用が促進され、結果として3'-UTRが短くなります。pre-mRNA転写産物のスプライシングはm6Aの影響を受ける可能性がありますが[ 16 ]、この効果はさまざまな生物システムで異なる場合があります[ 17 ] 。さらに、成熟mRNAの核外輸送はm6Aに依存しており、 m6A「ライター」が阻害されると、成熟mRNAの輸送が遅延します。ただし、正常な核外輸送はm6Aのみに依存するわけではなく、 5'-メチルシトシン（m5C）などの他のmRNAマークも関与しています[ 11 ]。
m 6 A マークは翻訳ダイナミクスに顕著な影響を与える。[ 18 ] m 6 A が翻訳効率に関与するさまざまな方法がある。たとえば、この修飾は tRNA の組み込みプロセスの複数のステップを調節する。一方では、EF-TuによるGTP加水分解を12 倍、ペプチジル転移反応を 2 倍遅くする。また、ペプチジル転移あたりの GTP 加水分解量を 1.5 倍増加させるため、多くの校正が必要であることがわかる。さらに、m 6 A は単なる修飾アデノシン塩基であるため、デコード中にウリジンと塩基対を形成する。しかし、アデノシンのメチル化は tRNA の適合と翻訳の伸長を妨げる。 m 6 A 修飾コドンがそのコグネイト tRNA (特定のコドンに相補的なアンチコドンを持つ tRNA) と相互作用する場合、コグネイト コドン相互作用ではなく、ニア コグネイト コドン相互作用のように機能します。これは、m 6 A が m RNA コドン内のどの位置にあるか、および翻訳の精度がどの程度かに依存する tRNA の適合の遅延で確認できます。全体として、この m 6 A 修飾は、18 倍の速度低下につながります。[ 18 ]要約すると、m 6 Aを持つコドンでは翻訳伸長ダイナミクスが遅くなり、mRNA コドン内のこれらの修飾ヌクレオチドの位置の違いがデコードダイナミクスに異なる影響を与えます。
しかし、このマークは翻訳効率を高めることもできる。m 6 A「リーダー」YTHDF1は、修飾されたmRNAとリボソームの結合を誘導する。さらに、METTL3とは独立して翻訳開始因子eIF3をmRNAにリクルートする。加えて、eIF3はmRNAの5'-UTRに位置するam 6 Aの「リーダー」としても機能し、その結果、 40S翻訳前開始複合体がリクルートされる。[ 14 ]この相互作用は、熱ショックストレスに対する細胞応答中に起こるキャップ非依存性翻訳に関与している。 [ 11 ]
m 6 A メチル化は mRNA の安定性も調節します。[ 19 ] 「リーダー」YTHDF2 は m 6 A を含む mRNA に結合し、メチル化依存性 mRNA 分解と呼ばれるプロセスで、それらをP ボディにリクルートすることで安定性を低下させます。 [ 11 ]このプロセスは、多能性幹細胞が特定の細胞系統に分化できるように、多能性転写因子転写産物を迅速に分解するために必要です。 [ 20 ]マウス胚におけるm 6 A レベルの低下は、発生の初期段階で胚致死につながります。[ 10 ]
ステムループ構造は、イントロンに見られることがある。これらのステムループに存在するm 6 A残基は、ステム内の塩基対相互作用を弱め、それによってmRNAの構造を変化させる。この現象はm 6 Aスイッチとして知られている。[ 12 ] m 6 Aマークは、 hnRNPCの結合部位へのアクセス性を高めるため、選択的スプライシングにおいて重要な役割を果たす。ヘテロ核リボヌクレオプロテインC（hnRNPC）は、ヘテロ核RNA（hnRNA）とpre-mRNAの両方と複合体を形成してpre-mRNAプロセシングに関与するRNA結合タンパク質である。hnRNPCは、通常ステムループを形成できるイントロン内のウリジンに富む領域に結合する。ステムループの不安定化によりhnRNPC結合部位が露出し、タンパク質のその領域へのアクセス性が高まる。[ 21 ] hnRNPCはその機能を果たすためにpre-mRNAに結合する必要があるため、アクセス性の向上はhnRNPCの活性の上昇を意味します。したがって、イントロンのステムループに位置するm 6 A残基はhnRNPCの活性を高め、その結果、選択的スプライシングが増加します。この主張を裏付ける証拠として、トランスクリプトーム中のm 6 Aレベルの低下がhnRNPC結合の大幅な減少につながることが明らかになりました。[ 12 ]
m 6 A は、 YTHDC1の結合部位として機能することによって、選択的スプライシングにおいて追加の役割を果たします(YTHDC1 は、選択的エクソンに存在する m 6 A 残基に結合します)。YTHDC1 は、選択的スプライシングにおいて二重の役割を果たします。まず、エクソンの取り込みを促進するセリンおよびアルギニンに富むスプライシング因子 3 (SRSF3) をリクルートします。さらに、YTHDC1 は、エクソンスキッピングに関与するタンパク質である SRSF10 の結合を阻害します。[ 12 ]
選択的スプライシングにおけるm 6 Aの役割により、pre-mRNAは成熟mRNAよりもm 6 Aのレベルが高い。さらに、m 6 Aは、単一のアイソフォームをコードする遺伝子と比較して、選択的スプライシングを受けるmRNAに多く存在する。これは、選択的スプライシングされたmRNAにMETTL3結合部位が豊富に存在するためである。Mettl3ノックアウトマウスではスプライシングが影響を受け、エクソンスキッピングとイントロン保持の頻度が増加する。[ 11 ]しかし、m 6 Aは一般的な非特異的スプライシング因子ではなく、特定のmRNAおよびlncRNAの選択的スプライシングにのみ関与する。[ 10 ]
m 6 AはmRNAだけでなく、さまざまな非コードRNAにも存在します。例えば、X染色体不活性化を開始するlncRNAであるXISTは、m 6 Aが豊富に含まれています。これらのm 6 AはYTHドメインタンパク質YTHDC1によって認識され、結合されます。XISTがm 6 Aで修飾されていない場合、XISTを介したX染色体のサイレンシングは悪影響を受けます。[ 11 ]
m 6 Aを含むRNA分子は、UV誘発DNA損傷修復機構に関与している。DNAが損傷すると、多数のm 6 A残基を含むポリ(A)+転写産物がその領域に蓄積する。これにより、DNAポリメラーゼKなどのDNA修復タンパク質がアクセスしやすくなり、その機能を果たすことができるようになる。[ 11 ]
m6A標識の付加または除去につながる経路の変化は、遺伝子発現および細胞機能の障害を引き起こし、疾患につながる可能性がある。
正常な m 6 A レベルは、多くの癌で変化しています。METTL3および/または METTL14 のダウンレギュレーションによるm 6 A レベルの低下は、ADAM メタロペプチダーゼドメイン 19 (ADAM19) をコードする遺伝子など、多くの癌遺伝子の活性化につながります。さらに、m 6 A の喪失は、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 2A (CDKN2A) や乳癌 2 (BRCA2)などの腫瘍抑制因子のダウンレギュレーションも引き起こします。一方、m 6 A レベルの上昇は、特定の種類の癌で腫瘍の進行を抑制します。 [ 14 ]さらに、 FTO をコードする遺伝子の単一ヌクレオチド多型(SNP) は、乳癌および膵臓癌のリスク増加と関連付けられています。m 6 A レベルの変化は、低酸素誘導による乳癌幹細胞表現型の濃縮にも寄与します。[ 22 ]あらゆることを考慮すると、m 6 A マークの「ライター」と「イレイザー」は、癌治療における有望な薬剤標的となる可能性がある。
代謝障害もFTOの役割によりm6Aマークの影響を受ける。FTOの過剰発現は体脂肪量の増加をもたらすが、FTOの喪失は除脂肪体重の減少につながる。しかし、FTO発現の変化が体脂肪量に影響を与えるメカニズムは解明されていない。[ 14 ]
m6aエピトランスクリプトームの現在の研究は、m6aとその虚血性脳卒中発症後の生理的影響の意義を明らかにし続けています。ミクログリアを介した反応と、FTOやALKBH5などの脱メチル化酵素が、脳のm6aエピトランスクリプトームの変化に寄与しているようです。大うつ病性障害などの気分障害も、m6aエピトランスクリプトームの変化に関連する疾患プロセスとして特定されています。[ 23 ]
N1-メチルアデノシンは、アデノシン塩基のN1にメチル基が付加された修飾ヌクレオシドです。この修飾により、メチル基が付加された窒素原子に正電荷が生じます。これは、修飾された窒素が結合を形成するために、その非共有電子対をメチル基の炭素原子に供与するためです。N1-メチルアデノシン修飾は、tRNAおよびrRNAの安定性を調節するだけでなく、タンパク質-RNA相互作用やRNA二次構造を変化させる可能性もあると考えられています。この修飾は、RNA構造の変化により、二本鎖RNAの融解を引き起こします。N1-メチルアデノシン修飾はm6A修飾よりも一般的ではなく、修飾された転写産物は通常、単一のm1A修飾のみを含みますが、 m6A残基は複数含まれる場合があります。[ 24 ]
これらの修飾の研究は、それらを特定するための確固たる方法論が不足しているため、なかなか進展していません。MeRIP-seqやm 1 A-ID-seqなどのいくつかの方法が開発されていますが、修飾される特定のアデノシンはまだ特定されていません。これらの方法から生成されたデータに基づくRAMPedと呼ばれる計算ツールが、これらの特定の修飾を特定するために開発されました。[ 25 ]
病気
m1aの修飾は、癌生物学および腫瘍形成との相関性が高いことから注目されています。m1aの関与は、増殖、浸潤、細胞死、腫瘍微小環境、または癌代謝のカテゴリーに分類できます。癌細胞の増殖は、特定のm1a「ライター」によって促進されることがわかっています。たとえば、調節因子TRMT6は、脳または脊髄のグリア細胞の不適切な増殖を特徴とする癌であるグリオーマの患者で過剰発現していることがわかっています。さらに、ALKBH3の調節は、特定の乳癌および卵巣癌における癌細胞の浸潤性をサポートおよび強化することがわかっています。[ 26 ]
5-メチルシトシン（一般的に「m 5 C」と略される）は、tRNAで最初に同定された化学修飾です。最初に同定されて以来、5-メチルシトシンは、さまざまなRNAやDNAなど、さまざまな細胞構造で発見されています。2種類のRNA m 5 C「ライター」が同定されています。NOP2/SUN RNAメチルトランスフェラーゼ（NSUN）とDNAメチルトランスフェラーゼ-2です。DNMT-2はDNMTファミリーに属するタンパク質であり、このファミリーにはゲノムに関連してメチル化活性を示すことが知られている他の3つのDNMT（1、3a、および3b）が含まれていることに注意することが重要です。DNMT-2は、DNAとRNAの両方をメチル化することが確認されている唯一のDNMTですが、その全体的なDNAメチル化機能は、他のDNMTに比べて著しく低いです。[ 27 ]これらのライターは特定されているが、現時点では、m 5 C「消去剤」は知られていない。より広い意味では、これは、5-メチルシトシンがシトシンに戻る変換がRNAで観察されていないことを意味する。[ 28 ] 5-メチルシトシン修飾は、通常、翻訳開始部位から約100ヌクレオチド下流で見られる。これは、これらの修飾の目的についての洞察を与える可能性がある。たとえば、これは、これらの修飾が、mRNAの場合に翻訳されるかどうかなど、RNAの運命を制御するために重要であることを示している可能性がある。しかし、RNAの特定のシトシンでのメチル化の正確な目的は、現在不明である。可能性の1つは、Aly/REF輸出因子が既知のm 5 C結合タンパク質であることから、m 5 CがRNA輸送に関連している可能性があることである。[ 28 ]一方、m 5 C 修飾は、RNA 全体の翻訳運命の調節を介して、エネルギーおよび脂質代謝に関与する遺伝子の調節と関連している可能性がある。[ 15 ]
アデノシンからイノシンへの（A-to-I）修飾は、エピトランスクリプトミクスの概念が生まれるずっと前から記述されていました。これらの修飾は神経系の組織や細胞で非常に一般的であり、この脱アミノ化の機能不全はさまざまなヒト疾患を引き起こす可能性があります。A-to-I脱アミノ化は、RNA全体の構造の変化やタンパク質をコードするmRNAの変化を引き起こすことが示されていますが、コドンやそれらがコードするアミノ酸の変化は一般的には見られません。[ 29 ] A-to-I RNA編集については、 RNA編集のページでより詳しく説明されています。
クエウイン（Q）は、tRNAの34番目の位置にある修飾ヌクレオチドです（クエオシンはヌクレオシドの名前で、クエインはヌクレオチドの名前です）。tRNAは最も修飾されているRNAの1つであるため、tRNAのヌクレオチド修飾は珍しいことではなく、約80種類の修飾ヌクレオチドが同定されています。クエオシンは、グアノシン（G）の非常に高度に修飾されたバージョンです。[ 30 ] tRNAの修飾は、遺伝子発現を制御および調節する能力があることがよく知られています。遺伝子発現の調節は通常、tRNAのステムループ構造の構造変化によって行われます。tRNAが受ける編集は、まれなコドンへの応答として発達した可能性があり、tRNAは修飾塩基を利用することによってフレームシフトを打ち消します。ヌクレオチドに対する他の同様の修飾は、tRNAの翻訳開始能力に影響を与え、遺伝子発現を阻害します。[ 31 ]
この修飾は特に広く見られ、さまざまな生物に見られることから、このヌクレオシドの発達において収斂進化が起こった可能性が示唆される。真核細胞はクエオシンを合成できないため、体内でクエオシンを生成し、その利用可能性を高めるために、マイクロバイオームの原核生物に頼らなければならない。Q34（34位のクエイン）のレベルの低下は、腫瘍の発生と関連している。[ 32 ]
2'-O-メチル化とは、RNAヌクレオチド内のリボースの2'ヒドロキシル基のメチル化を指します。[ 33 ] 2'-O-メチル化は、高等真核生物のmRNAの5'キャップに見られます。[ 34 ]これは、自己mRNAと非自己mRNAの区別に関与しています。[ 15 ] [ 35 ] 2'-O-メチル化マークがないと、免疫系はI型インターフェロン活性のレベルを上昇させます。 [ 34 ] [ 15 ]この修飾が特定の現象への応答であるとは現在知られていませんが、小さなRNA分子の研究の難しさから、この修飾のメカニズムについてすべてが完全に理解されているわけではありません。しかし、この修飾がRNAの安定性に及ぼす影響は、転写レベルを調節するために制御される可能性があります。
プソイドウリジン（Ψ、5-リボシルウラシル）は最も豊富なRNA修飾であり、実際、かつては「5番目のヌクレオチド」と考えられていました。このウリジンの異性体は、snRNA、tRNA、小型核小体RNA（snoRNA）など、さまざまなタイプのRNAに見られます。[ 28 ]プソイドウリジンは、糖リン酸骨格をより強固にし、塩基スタッキング相互作用を促進することによって（プソイドウリジンは余分な水素結合供与体を含んでいます）、修飾RNAの安定性を高めます。ワトソンクリック塩基対相互作用に関しては、プソイドウリジン-アデノシン塩基対はウリジン-アデノシン塩基対よりも安定しているため、プソイドウリジンは安定性を高めます。[ 29 ]この修飾はRNAの安定性を高めるだけでなく、翻訳の調節にも関与しています。すべての真核生物の終止コドンは1つのウリジン（UAA、UAG、UGA）を含んでいます。このウリジンをシュードウリジンに変換すると、翻訳終結が抑制され、予期しないセンスコドンが生成されます。[ 28 ] [ 29 ]シュードウリジル化の人工的なプロセスは、mRNAの機能に影響を与えます。リボソームのデコードセンターで非標準的な塩基対形成を可能にすることで、遺伝暗号が変わります。[ 36 ]
シュードウリジン化反応は、シュードウリジンシンターゼドメインを含む酵素によって触媒されます。ヒトではこのような酵素が13種類同定されており、シュードウリジンシンターゼ（PUS）と呼ばれています。これらの酵素は、標的部位への誘導に小さなRNAが必要かどうかによって、RNA依存性またはRNA非依存性のいずれかになります。さらに、異なるPUS酵素は異なる細胞区画で機能します。例えば、ほとんどのmRNAシュードウリジン化を担うPUS4（TruBシュードウリジンシンターゼファミリーメンバー1、TRUB1としても知られる）とPUS7は、核または細胞質に存在します。一方、PUS1やTRUB2などのいくつかのPUS酵素はミトコンドリアに存在し、多数のミトコンドリアmRNA（mt-mRNA）を修飾します。[ 28 ] tRNAでは、PUS1とPUS7はUGUARコンセンサス配列の2番目のウリジンを修飾するが、この配列はtRNAの非常に構造化された領域に位置している。[ 37 ]
現在までに、プソイドウリジン消去酵素や読み取り酵素は特定されていない。プソイドウリジル化はおそらく不可逆的なプロセスであると考えられている。[ 29 ]
シュードウリジンはtRNAに最も多く見られ、ほとんどすべてのtRNA分子には少なくとも1つのシュードウリジンが含まれています。したがって、シュードウリジンの付加はtRNAの通常の処理中に起こるため、エピトランスクリプトームマークとはみなされません。しかし、シュードウリジンは脳のmRNAとncRNAのエピジェネティックマークとして機能します。これらの2つのRNAのシュードウリジル化は細胞のストレスと分化に動的に反応するため、[ 22 ]シュードウリジル化はRNA機能の重要な調節機構として機能する可能性があると考えられます。[ 38 ] mRNAのシュードウリジル化は保存的、組織特異的、または誘導可能であり、可塑性と調節機能を反映しています。[ 29 ]さらに、主に脳で発現するTRBU1の発現は恐怖条件付けによって上昇します。加えて、RNA依存性PUS酵素を誘導するために必要なncRNAの発現も恐怖に応じて上昇します。[ 22 ]
RNA中のシュードウリジンの位置特異的マッピングには、Pseudo-seq、Ψ-seq、PSI-seqと呼ばれる3つの主要な手法があります。これらの方法はすべて、シュードウリジンとN-シクロヘキシル-N'-(2-モルホリノエチル)カルボジイミドメト-p-トルエンスルホン酸（CMCT）との特異的な反応に基づいています。分析対象のRNAを断片化し、CMCTとインキュベートします。CMCTはU、G、Ψ残基と共有結合を形成できますが、アルカリ加水分解に耐性があるのはΨ-CMCのみです（U-CMCとG-CMCは加水分解されます）。次に、逆転写を行い、シュードウリジン残基の1ヌクレオチド下流で終結するcDNAライブラリーを取得します。cDNAライブラリーの次世代シーケンシングにより、修飾されたシュードウリジン残基がRNAのどこにあるかが示されます。このために、2 つの cDNA ライブラリーが準備されます。 1 つは RNA が CMC 処理されているもので、もう 1 つは CMC 処理されていないものです。 2 つのライブラリー間のリードの長さの違いは、Ψ 残基の位置を示します。[ 28 ] [ 37 ]別の方法として CeU-Seq と呼ばれるものがあり、これはCMCT のビオチン化誘導体を使用します。 これにより、ストレプトアビジンカラムを使用してビオチン化転写産物 (シュードウリジンで修飾された転写産物) を精製および濃縮することができ、ライブラリー サイズを縮小し、感度を高めます。[ 29 ]
その他のプソイドウリジン検出法としては、部位特異的切断と放射性標識に続いて、ライゲーション補助抽出と薄層クロマトグラフィー（SCARLET）および質量分析法を用いる方法がある。
リボソームRNA（rRNA）は、リボソームの核酸成分を形成します。rRNAの修飾は、リボソームの活性部位であるペプチジル転移酵素中心とその周辺で起こります。修飾には、シュードウリジン、主鎖糖の2'-O-メチル化、およびメチル化塩基などがあります。これらの修飾がrRNA分子に及ぼす生物学的影響はよくわかっていませんが、リボソームの構造を安定化させ、特にリボソーム形成時にその機能を高めるのに役立つという仮説があります。さらに、これらの修飾はrRNAの化学的性質を変化させ、正しい三次構造が優先される可能性があります。2'-O-メチル化は主鎖の加水分解を防ぎます。その他の注目すべき修飾も、rRNAの二次構造を安定化させ、rRNA鎖の損傷を防ぐのに役立つようです。2'-O-メチル化は塩基スタッキング力を増加させ、rRNAの二次構造と三次構造をさらに安定化させるのにも役立ちます。これらのrRNAの修飾は、リボソーム機能にとって不可欠である。[ 15 ]
翻訳に関与するRNAである転移RNAは、あらゆる種類のRNAの中で最も多くの修飾を含んでおり、真核生物ではこれらの分子のヌクレオシドの最大4分の1が何らかの修飾を含んでいます。[ 15 ] tRNAに見られる多様な修飾にはいくつかの既知の理由があります。まず第一に、このような修飾により、開始tRNA Metと伸長tRNA Metを分離するなど、異なるtRNA分子を容易に区別できます。さらに、tRNA全体の安定性を高めます。いくつかの研究では、tRNAの修飾は動的であり、環境の変化に適応できることが示されています。例としては、体内の栄養素の枯渇に応じてtRNAメチルトランスフェラーゼ（Trm4）によるシトシン基のメチル化が挙げられます。tRNAの十字形構造は、その全体的な機能にとって非常に重要であり、このような複雑な構造は転写後修飾によって維持されています。その代表的な例として、 tRNA構造内の接合部におけるグアノシンのメチル化が挙げられる。これらのメチルグアノシンは、潜在的な標準的な水素結合（従来のワトソン・クリック塩基対である水素結合）を破壊することで、全体の三次構造に影響を与え、tRNAのコアにループを形成する。その他の修飾は、構造の極端な屈曲の形成と維持に不可欠である。[ 39 ]
メッセンジャーRNAは、遺伝暗号と生成されるタンパク質との橋渡し役であり、タンパク質に翻訳されるために必要な情報を運ぶ役割を担っています。実際の物理的な遺伝暗号への改変は有害となる可能性が高いため、メチル化などの軽微なmRNAへの改変が望ましいとされています（ただし、ゲノム全体で改変は依然として見られます）。mRNAに施される主な4種類の改変は、N7-メチルグアニン（5'キャップ）、N6-メチルアデノシン、5-メチルシトシン、および2'-O-メチル化です。5'キャップに見られる改変は、mRNAへの改変がその機能にどのように影響するかを完璧に示しています。5'キャップは翻訳を開始するために必要だからです。したがって、RNAプロセシング中のN7-メチルグアニンなどの5'キャップへの改変は、リボソームの翻訳開始能力に影響を与える可能性があります。 mRNAに起こるすべての修飾がエピジェネティックなものではなく、N7-メチルグアノシンキャップのようにRNA編集であるものもあることに注意することが重要です。
mRNA分子は「修飾化学量論」と呼ばれる現象を示します。修飾化学量論とは、転写産物の一部のみが特定の修飾部位で特定の修飾を受ける状態を指します。通常、正常な細胞条件下では、修飾化学量論は非常に低く、特定の修飾を受ける転写産物はごく少数です。しかし、細胞条件が変化すると、修飾された転写産物の割合も変化する可能性があります。[ 40 ]他の種類のRNAと同様に、修飾はmRNAの全体構造に影響を与えます。構造が変化すると、mRNAが異なる経路をたどる可能性があります。たとえば、正常な転写産物は翻訳される運命にあるかもしれませんが、修飾塩基の導入によってその構造が破壊され、別の経路をたどることになり、その特定の転写産物は分解の標的となる可能性があります。[ 40 ]
修飾は、小型核RNA（snRNA）やマイクロRNA （miRNA）などの短い非コードRNAでも起こり得る。[ 41 ] [ 15 ]ただし、これらの修飾はmRNA、tRNA、rRNAの修飾よりも一般的ではない。[ 41 ]
トランススプライシングされたsnRNAの中には、N 2 ,N 2 ,7-トリメチルグアノシンキャップを持つものも観察されている。 [ 41 ]このグアノシンキャップの特定の修飾はsnRNAではまれである。トランススプライシングは、2つの異なる一次RNA転写産物のエクソンが連結される現象である。[ 42 ]これらのまれな変異体はC.elegansの発生中に見られ、ポリソームと関連している。[ 41 ]この修飾が特定の細胞型でどのように制御されているか、またこの修飾の正確な機能はほとんど不明であるが、この修飾がトリメチルグアノシン制御RNAの特別なサブセットを定義するのに役立つ可能性があると推測されている。[ 41 ]
植物のmiRNAの中には、メチルトランスフェラーゼHEN1によって付加されるリボース糖の修飾である2'-O-メチル化を含むものがあることがわかっている。この修飾は、miRNAをポリウリジル化から保護し、その後の分解を防ぐと考えられている。[ 15 ]
さらに、pri-miRNAにはm6Aが含まれていることが示されている。この可逆的な修飾は、miRNAプロセシング中の細胞内局在と機能に影響を与える可能性がある。[ 15 ]
長鎖ノンコーディングRNAファミリーには、環状RNA（circRNA）、核lncRNA、長鎖遺伝子間ノンコーディングRNA、エンハンサーRNAなど、さまざまな種類のRNAが含まれます。次世代シーケンシング技術の発展により、lncRNAの研究がより容易になりました（lncRNAは他の種類のRNAに比べて細胞内であまり一般的ではないため）。
lncRNAの編集と修飾は、RNA発現と突然変異率の変化をもたらすことが実証されている。[ 43 ] 5-メチルシトシン（m5C ）、N6-メチルアデノシン（m6A ）、およびシュードウリジンは、lncRNAで発生する最も一般的で最も研究されている3つの修飾である。[ 28 ]ヌクレオチド構造の修飾は、lncRNAの構造に影響を与え、その全体的な機能を調節する可能性が高い。これらの修飾の可逆性の研究は、活発な研究分野である。これらの修飾は、lncRNAの機能や翻訳の開始など、さまざまな特性に影響を与える。lncRNAの修飾は、細胞内での局在に影響を与えることが実証されており、tRNAの十字架のような複雑な構造は通常lncRNAには見られないが、修飾によってその構造が変化し、lncRNAの全体的な機能と経路に影響を与える可能性がある。[ 15 ]
ウイルスエピトランスクリプトミクスは、転写産物の配列には影響を与えないが機能的に重要なウイルス転写産物のRNA修飾を研究する分野である。これまでのところ、研究は哺乳類ウイルスのウイルス転写産物に焦点を当ててきた。哺乳類ウイルス転写産物は哺乳類細胞内で機能する必要があるため、宿主細胞と同じエピジェネティックマークを獲得する必要がある。このために、ウイルスは宿主細胞に存在する多数のmRNA修飾酵素を利用する。[ 37 ]
哺乳類ウイルスで最も広く記述されているRNA修飾はm6Aであり、これは1976年にインフルエンザウイルスmRNAで初めて同定された。 [ 11 ]ウイルス転写産物のエピトランスクリプトーム解析により、ウイルス転写産物と細胞転写産物のm6Aレベルは類似していることが明らかになった。しかし、アデノウイルス2などの一部のウイルスでは、ウイルスmRNAのm6Aレベルが高い。[ 37 ]細胞RNAと同様に、m6Aは主にMETTL3によって核内で付加され、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15/RMB15Bなどのいくつかの補因子の助けを借りる。最近の研究では、致死的な皮膚癌であるメルケル細胞癌のメルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPyV）の小型T抗原にm6Aが存在することが示されている。 [ 44 ]
ウイルスのm 6 Aマークの研究は、主にHIVで行われてきました。[ 13 ]このウイルスの変異率が高いにもかかわらず、m 6 A部位は進化的に保存されています。これは、m 6 AがHIVライフサイクルの複数の段階の調節に関与しているためです。m 6 Aは、pre-mRNAスプライシング、核外輸送、mRNA安定性、翻訳において通常の機能を持つだけでなく、 Toll様受容体およびRIG-1受容体によるウイルス転写産物の認識も阻害します。その結果、m 6 Aはウイルス複製に正の影響を与えます。[ 7 ]一方、HIVは、多くの細胞mRNAへのm 6 Aマークの付加も調節します。例えば、HIV感染中にm 6 Aのみを含む56の細胞転写産物が同定されています。このマークがウイルス感染の過程で細胞転写産物に及ぼす影響は不明です。[ 37 ]
m 6 A 標識ウイルス転写産物がさまざまなウイルスの遺伝子発現の調節に関与しているとしても、そのメカニズムはまだ解明されていません。現在までに、3 つの可能性のあるモデルが提案されています。 [ 13 ]
METTL3とMETTL14は主に核に局在していますが、細胞質にも存在し、細胞質RNAウイルスのゲノムと転写産物をメチル化します。核ウイルスとは対照的に、C型肝炎ウイルス（HCV、細胞質RNAウイルス）のm6Aの喪失は感染性HCVビリオンの産生を増加させ、この特定のウイルスではm6Aマークがウイルス産生に負の影響を与えることを示しています。しかし、デングウイルスや黄熱ウイルスなどの他の細胞質RNAウイルスでは、m6A部位が進化の過程で選択されており、m6Aマークがこれらのウイルスにとって有益であることを示唆しています。[ 7 ]
m 6 A はウイルス複製を促進するため、m 6 A は抗ウイルス療法の標的として使用できます。主な課題は、通常存在する細胞内の m 6 A マークも減少するため、宿主細胞に大きな影響を与えることなく、ウイルス転写産物中のこのマークを標的にすることです。S-アデノシルホモシステイン(SAC) ヒドロラーゼ阻害剤である 3-デアデノシン (DAA) は、m 6 Aの付加を阻害するため、抗ウイルス薬として使用できます。[ 7 ]しかし、この薬にオフターゲット効果があるかどうかはまだ確認されていません。[ 13 ]
m 6 A は、ウイルス RNA に見られる唯一の RNA 修飾ではありません。たとえば、N 6 ,2-O-ジメチルアデノシン (m 6 A m ) は、インフルエンザウイルスや単純ヘルペスウイルス 1 型に見られますが、このマークがこれらのウイルスのライフサイクルに及ぼす影響は不明です。最近、 HIV -1 RNA上のシチジンのNAT10 を介したアセチル化が報告されました。[ 45 ]コロナウイルス、フラビウイルス、ポックスウイルス(これらはすべて細胞質ウイルスです)によく見られる別の修飾は、リボース部分の 2'-O-メチル化です。このマークの付加は、ウイルスのメチルトランスフェラーゼによって触媒されます。2'-O-メチル化は、炎症性サイトカインの産生を活性化する Toll 様受容体 7 (TLR-7) に結合してこれを阻害します。さらに、この改変により、ウイルスRNAは、ウイルス複製を制限するインターフェロン誘導タンパク質のファミリーであるIFITタンパク質の抗ウイルス作用を回避できるようになる。[ 13 ]
MODOMICSは、RNA修飾に関する情報を含む包括的なデータベースです。MODOMICSは、修飾RNAの化学構造、RNA修飾経路、RNA配列中の修飾の位置、修飾に関与する酵素、および修飾RNAの液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）データなどの情報を提供します。2017年11月現在、このデータベースには163種類のRNA修飾と、修飾に関与する340種類の酵素および補因子が含まれています。このデータベースは、RNA修飾経路を開始点に基づいて分類しています。LC/MSデータは、修飾RNAの比質量を決定するのに非常に役立ち、修飾の同定を容易にします。[ 46 ]
ENCORE (ENCORE) は、 RMBaseのアップグレード版であり、数十種類の新しいソフトウェアとツールを備えた包括的なエピトランスクリプトームプラットフォームで、数千のハイスループットシーケンスデータを分析することにより、70 種類以上の RNA 修飾の分布パターン、メタジーンプロファイル、生合成メカニズム、制御機能、相互作用、進化的保存、新規リーダータンパク質を解読します。[ 47 ] [ 48 ]