ノックアウトマウス

ノックアウトマウスとは、研究者が既存の遺伝子を人工DNAに置き換えたり、その機能を阻害したりすることで不活性化（ノックアウト）した遺伝子改変マウス（Mus musculus ）のことである。ノックアウトマウスは、配列は解読されているものの機能が未解明な遺伝子の役割を研究するための重要な動物モデルである。マウスの特定の遺伝子を不活性化し、正常な行動や生理機能との違いを観察することで、研究者はその遺伝子の機能を推測することができる。

マウスは現在、ノックアウト技術を容易に適用できるヒトに最も近い実験動物種である。ノックアウト実験、特にヒトの生理機能に関連する遺伝学的問題を調査する実験で広く使用されている。ラットでの遺伝子ノックアウトははるかに難しく、2003年以降にようやく可能になった。^{[ 1 ] [ 2 ]}

史上初めてノックアウトマウスが記録されたのは、 1989年にマリオ・R・カペッキ、マーティン・エバンス、オリバー・スミシーズによってであり、彼らはその功績により2007年のノーベル生理学・医学賞 を受賞した。ノックアウトマウスの作製技術の側面、およびマウス自体は、多くの国で民間企業によって特許が取得されている。

遺伝子の活性を阻害することで、その遺伝子が通常どのような働きをしているかについての情報が得られます。ヒトはマウスと多くの遺伝子を共有しています。そのため、ノックアウトマウスの特性を観察することで、研究者は類似の遺伝子がヒトの疾患の原因となったり、疾患の発症に寄与したりする仕組みをより深く理解するための情報を得ることができます。

ノックアウトマウスが有用であった研究例としては、様々な種類の癌、肥満、心臓病、糖尿病、関節炎、薬物乱用、不安症、老化、パーキンソン病の研究およびモデル化が挙げられる。ノックアウトマウスはまた、薬剤やその他の治療法を開発・試験するための生物学的・科学的な基盤を提供する。

毎年、何百万匹ものノックアウトマウスが実験に使用されている。^{[ 3 ]}

ノックアウトマウスには数千種類の異なる系統が存在する。^{[ 3 ]} 多くのマウスモデルは、不活性化された遺伝子にちなんで命名されている。例えば、p53ノックアウトマウスは、細胞分裂を停止したりアポトーシスを誘導したりすることで通常は腫瘍の増殖を抑制するタンパク質をコードするp53遺伝子にちなんで命名されている。p53遺伝子を不活性化する変異を持って生まれたヒトは、リー・フラウメニ症候群を患っており、この疾患は若年で骨癌、乳癌、血液癌を発症するリスクを劇的に高める。他のマウスモデルは、その身体的特徴や行動に基づいて命名されている。

ノックアウトマウスを作製する手順にはいくつかのバリエーションがあるが、以下はその典型的な例である。

1. ノックアウトする遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーから単離されます。次に、元の遺伝子とその近傍配列と非常によく似ているものの、遺伝子が機能しなくなるように十分に改変された新しいDNA配列が設計されます。通常、この新しい配列にはマーカー遺伝子も付加されます。マーカー遺伝子とは、通常のマウスには存在せず、特定の毒性物質（例えばネオマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子、または目に見える変化（例えば色や蛍光）を引き起こす遺伝子です。さらに、完全な選択を行うために、ヘルペスtk+などの第2の遺伝子も構築物に含められます。
2. 胚性幹細胞は、マウスの胚盤胞（非常に若い胚）から分離され、体外で培養されます。この例では、白いマウスから幹細胞を採取します。
3. ステップ1で得られた新しい配列は、エレクトロポレーションによってステップ2の幹細胞に導入されます。相同組換えの自然なプロセスにより、エレクトロポレーションされた幹細胞の一部は、ノックアウトされた遺伝子を含む新しい配列を元の遺伝子の代わりに染色体に組み込みます。組換えが成功する確率は比較的低いため、改変された細胞の大部分は、関連する2つの染色体のうち1つにのみ新しい配列を持ちます。これらの細胞はヘテロ接合体と呼ばれます。ネオマイシン耐性遺伝子とヘルペスtk+遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞は、相同組換えによって生じた形質転換を選択するために、ネオマイシンとガンシクロビルを含む溶液中で培養されます。ランダム挿入によって生じたDNAの挿入は、ネオマイシン耐性遺伝子とヘルペスtk+遺伝子の両方に対して陽性反応を示すため、死に至ります。ヘルペスtk+遺伝子の産物はガンシクロビルと反応して致死的な毒素を生成します。さらに、遺伝物質を全く取り込まない細胞は、両方の遺伝子について検査で陰性となり、ネオマイシンによる中毒の結果死に至る。
4. ノックアウト遺伝子を取り込んだ胚性幹細胞は、ステップ1で用いたマーカー遺伝子を用いて、改変されていない細胞から分離される。例えば、改変された細胞が耐性を持つ毒性物質を用いて、改変されていない細胞を死滅させることができる。
5. ステップ4でノックアウトした胚性幹細胞をマウスの胚盤胞に挿入します。この例では、灰色のマウスの胚盤胞を使用します。胚盤胞には、元の幹細胞（灰色のマウス由来）とノックアウトした細胞（白いマウス由来）の2種類の幹細胞が含まれています。これらの胚盤胞は雌マウスの子宮に移植され、そこで発育します。したがって、生まれたマウスはキメラとなります。体の一部は元の幹細胞に由来し、他の部分はノックアウトした幹細胞に由来します。毛皮には白と灰色の斑点が現れ、白い斑点はノックアウトした幹細胞に由来し、灰色の斑点は移植された胚盤胞に由来します。
6. 生まれたばかりのキメラマウスの中には、ノックアウトされた幹細胞由来の生殖腺を持つ個体がおり、そのためノックアウトされた遺伝子を含む卵子や精子を産生する。これらのキメラマウスを野生型マウスと交配させると、その子孫の一部は、すべての細胞にノックアウトされた遺伝子のコピーを1つずつ持つことになる。これらのマウスは灰色マウスのDNAを一切保持しておらず、キメラではないが、ヘテロ接合体である。
7. これらのヘテロ接合体の子孫を交配させると、その子孫の一部は両親からノックアウトされた遺伝子を受け継ぎます。つまり、元の改変されていない遺伝子の機能的なコピーを持たない（すなわち、その対立遺伝子に関してホモ接合体である）のです。

ノックアウト（KO）マウスの作製方法に関する詳細な説明は、2007年ノーベル生理学・医学賞のウェブサイトに掲載されています^{。[ 4 ]}

米国国立衛生研究所はこの技術の重要な限界について論じている。^{[ 5 ]}

ノックアウトマウス技術は貴重な研究ツールである一方で、いくつかの重要な制約も存在する。遺伝子ノックアウトの約15％は発生致死であり、遺伝子改変された胚は成体マウスに成長できない。この問題は、条件付き突然変異を用いることで克服されることが多い。成体マウスの不足は研究を胚発生段階に限定し、ヒトの健康との関連で遺伝子の機能を特定することをより困難にする。場合によっては、遺伝子が発生中の胚とは異なる機能を成体で果たすこともある。

遺伝子をノックアウトしても、マウスでは目に見える変化が生じない場合や、同じ遺伝子を不活性化したヒトで観察される特徴とは異なる特徴が生じる場合もある。例えば、p53遺伝子の変異はヒトのがんの半数以上に関連しており、特定の組織に腫瘍が発生することが多い。しかし、マウスでp53遺伝子をノックアウトすると、マウスは異なる組織に腫瘍を発症する。

全体的な手順には、幹細胞が由来する系統によって大きく異なる変動性がある。一般的には、129系統由来の細胞が使用される。この特定の系統は多くの実験（例えば、行動実験）には適していないため、子孫を他の系統と戻し交配することが非常に一般的である。ゲノム上のいくつかの遺伝子座は、ノックアウトが非常に困難であることが証明されている。その理由としては、反復配列の存在、広範なDNAメチル化、またはヘテロクロマチンなどが挙げられる。遺伝物質のノックアウトセグメント上に隣接する129遺伝子が存在することは、「隣接遺伝子効果」と呼ばれている。^{[ 6 ]}この問題に対処するための方法とガイドラインが提案されている。^{[ 7 ] [ 8 ]}

もう一つの制約は、従来型の（すなわち非条件型の）ノックアウトマウスは、研究対象の遺伝子が存在しない状態で発生するという点です。発生過程における遺伝子活性の喪失は、特にその遺伝子が発達の様々な段階に関与している場合、成体における遺伝子の役割を覆い隠してしまう可能性があります。そのため、目的遺伝子の除去を行う前に、マウスが正常に発生・成熟するのを待つ、条件付き／誘導性変異導入法が必要となります。

もう一つの深刻な制限は、野生型動物が自然に突然変異した後に起こりうる進化的な適応がノックアウトモデルには欠けていることである。例えば、赤血球特異的なGLUT1とストマチンの共発現は、ビタミンCを合成できない哺乳類における代償機構を構成している。^{[ 9 ]}

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