ローリングサークルレプリケーション

ローリングサークル複製( RCR ) は、プラスミド、バクテリオファージのゲノム、ウイロイドの環状 RNAゲノムなど、DNAまたはRNAの環状分子の複数のコピーを迅速に合成できる一方向の核酸複製プロセスです。一部の真核生物ウイルスも、ローリングサークルメカニズムを介して DNA または RNA を複製します。

自然なローリングサークル複製の簡易版として、等温DNA増幅技術であるローリングサークル増幅が開発されました。RCAメカニズムは、分子生物学やバイオメディカルナノテクノロジー、特にバイオセンシングの分野（信号増幅法として）で広く使用されています。 ^[1]

ローリングサークルDNA 複製は、プラスミドまたはバクテリオファージ DNA によってコードされるイニシエータータンパク質によって開始され、このタンパク質は二本鎖環状 DNA 分子の一方の鎖を二本鎖起点 (DSO) と呼ばれる部位で切断します。イニシエータータンパク質は切断された鎖の 5' リン酸末端に結合したまま、遊離した 3' ヒドロキシル末端が解放され、DNA ポリメラーゼ IIIによる DNA 合成のプライマーとして機能します。切断されていない鎖をテンプレートとして使用して、環状 DNA 分子の周囲で複製が進行し、切断された鎖が一本鎖 DNA として置き換えられます。切断された鎖の置き換えは、プラスミド複製開始タンパク質の存在下で、PcrA (plasmid copy Reduced の略) と呼ばれる宿主によってコードされるヘリカーゼによって実行されます。

継続的な DNA 合成により、コンカテマーと呼ばれる連続した頭から尾までの一連の元の DNA の一本鎖線状コピーが複数生成されます。これらの線状コピーは、次のプロセスによって二本鎖の環状分子に変換されます。

まず、イニシエータータンパク質が DNA に別の切れ目を入れて、最初の (リーディング) 鎖の合成を終了します。次に、 RNA ポリメラーゼと DNA ポリメラーゼ III が一本鎖起点 (SSO) DNA を複製して、別の二本鎖環状 DNA を作成します。DNAポリメラーゼ I がプライマーを除去して DNA に置き換え、DNA リガーゼが末端を結合して別の二本鎖環状 DNA 分子を作成します。

要約すると、典型的なDNAローリングサークル複製には5つのステップがあります。^[2]

1. 環状 dsDNA は「切り込み」が入ります。
2. 3' 末端は、「切断されていない」 DNA をリーディング鎖 (テンプレート) として使用して伸長され、5' 末端は置換されます。
3. 置換された DNA はラギング鎖であり、一連の岡崎断片を介して二本鎖になります。
4. 「切り込みのない」ssDNAと置換されたssDNAの両方の複製。
5. 置換された DNA は環状になります。

一部のDNA ウイルスは、ローリング サークル複製を介して宿主細胞内でゲノム情報を複製します。たとえば、ヒトヘルペスウイルス 6 (HHV-6)(hibv) は、このプロセスに関与していると考えられる一連の「初期遺伝子」を発現します。^[3]結果として生じる長いコンカテマーは、その後、HHV-6 ゲノムの pac-1 領域と pac-2 領域の間でリボザイムによって切断され、個々のウイルス粒子にパッケージ化されます。^[4]

ヒトパピローマウイルス 16 型(HPV-16) は、ローリング複製を利用して子孫を高率に生産する別のウイルスです。HPV-16 はヒト上皮細胞に感染し、2 本鎖の環状ゲノムを持っています。複製中、起点では、E1 ヘキサマーが 1 本鎖 DNA に巻き付き、3' から 5' の方向に移動します。通常の双方向複製では、2 つの複製タンパク質は衝突時に分離しますが、HPV-16 では E1 ヘキサマーが分離しないため、連続的なローリング複製につながると考えられています。HPV のこの複製メカニズムは、ウイルスが宿主染色体に組み込まれ、最終的に子宮頸がんに進行するという生理学的意味を持つ可能性があると考えられています。^[5]

さらに、ジェミニウイルスは、複製機構としてローリング サークル複製も利用します。これは、キャッサバ、綿、豆類、トウモロコシ、トマト、オクラなど、多くの主要な作物を枯死させる原因となっているウイルスです。このウイルスは、宿主植物細胞で複製する環状の一本鎖 DNA を持っています。プロセス全体は、ジェミニウイルスの複製開始タンパク質である Rep によって開始されます。Rep は、複製機構の一部として宿主環境を変更する役割も担っています。Rep は、N 末端にモチーフ I、II、III が存在する点で、真正細菌の他のほとんどのローリング複製開始タンパク質と非常によく似ています。ローリング サークル複製中、ジェミニウイルスの ssDNA は dsDNA に変換され、Rep は TAATATTAC の起点配列で dsDNA に結合します。Rep は、他の複製タンパク質とともに dsDNA に結合してステム ループを形成し、DNA はナノマー配列で切断されて鎖の置換を引き起こします。この置換により、複製フォークは3'から5'方向に進行し、最終的に新しいssDNA鎖とコンカテマーDNA鎖が生成されます。^[6]

バクテリオファージT4の DNA複製中間体には、環状および分岐環状の連鎖構造が含まれます。^[7] これらの構造は、複製のローリングサークル機構を反映していると考えられます。

一部の RNA ウイルスとウイロイドも、ローリング サークル RNA 複製を通じてゲノムを複製します。ウイロイドの場合、 Pospiviroidae (非対称複製) とAvsunviroidae (対称複製)の科のメンバーがそれぞれ従う 2 つの代替 RNA 複製経路があります。

ポスピウイロイド科（PSTVd様）では、環状プラス鎖RNAは宿主RNAポリメラーゼによってオリゴマーマイナス鎖に転写され、次にオリゴマープラス鎖に転写される。^[8]これらのオリゴマープラス鎖は宿主RNaseによって切断され、宿主RNAリガーゼによって連結されてモノマープラス鎖の環状RNAが再形成される。これはローリングサークル複製の非対称経路と呼ばれる。アヴスンウイロイド科（ASBVd様）のウイロイドは、ローリングサークル複製の対称経路によってゲノムを複製する。^[9]この対称経路では、オリゴマーマイナス鎖が最初に切断され、連結されてモノマーマイナス鎖が形成され、次にオリゴマープラス鎖に転写される。これらのオリゴマープラス鎖はその後切断され、連結されてモノマープラス鎖が再形成されます。対称複製経路は、プラス鎖とマイナス鎖の両方が同じ方法で生成されることから名付けられました。

オリゴマープラス鎖とマイナス鎖の切断は、アブスンウイロイド科に存在する自己切断型ハンマーヘッドリボザイム構造によって媒介されるが、ポスピウイロイド科にはそのような構造は存在しない。 ^[10]

ローリングサークル複製の派生形は、非常に少量の開始材料からのDNA増幅に効果的に使用されてきた。 ^[1]この増幅技術は、ローリングサークル増幅（RCA）と呼ばれている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの従来のDNA増幅技術とは異なり、RCAは等温核酸増幅技術であり、ポリメラーゼが環状テンプレートにアニールされたプライマーに単一のヌクレオチドを連続的に付加し、数十から数百のタンデムリピート（環状テンプレートに相補的）を含む長いコンカテマーssDNAを生成する。^[11]

RCA 反応を実行するために必要な重要な要素は 5 つあります。

1. DNAポリメラーゼ
2. ポリメラーゼと互換性のある適切なバッファー。
3. 短いDNAまたはRNAプライマー
4. 環状DNAテンプレート
5. デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）

RCA で使用されるポリメラーゼは、 DNA 増幅用のPhi29、Bst、および Vent エキソDNA ポリメラーゼと、RNA 増幅用の T7 RNA ポリメラーゼです。Phi29 DNA ポリメラーゼは、前述のすべてのポリメラーゼの中で最も優れた処理能力と鎖置換能力を備えているため、RCA 反応で最も頻繁に使用されています。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) とは異なり、RCA は自由溶液でも固定化ターゲットの上でも (固相増幅)、一定温度 (室温から 65℃) で実行できます。

DNA RCA 反応には通常 3 つのステップが含まれます。

1. 環状テンプレートライゲーションは、テンプレートを介した酵素ライゲーション（例：T4 DNA リガーゼ）または特殊な DNA リガーゼ（CircLigase）を使用したテンプレートフリーライゲーションによって実行できます。
2. プライマー誘導による一本鎖 DNA 伸長。複数のプライマーを使用して同じサークルとハイブリダイズすることができます。その結果、複数の増幅イベントが開始され、複数の RCA 製品が生成されます (「マルチプライム RCA」)。
3. 増幅産物の検出と可視化は、蛍光検出によって最も一般的に行われ、蛍光体が結合した dNTP、蛍光体が結合した相補的分子ビーコン、または蛍光標識された分子ビーコンが使用されます。蛍光アプローチに加えて、ゲル電気泳動も RCA 産物の検出に広く使用されています。

RCA は、各環状テンプレートが一定時間一定の速度で成長するにつれて、DNA の線形増幅を生成します。PCR のように収量を増やして指数関数的増幅を実現するために、いくつかのアプローチが研究されてきました。その 1 つは、ハイパーブランチ ローリング サークル増幅 (HRCA) です。これは、元の RCA 産物にアニールするプライマーが追加され、さらに拡張されるものです。^[12]この方法では、元の RCA によって増幅可能なテンプレートがさらに作成されます。もう 1 つは、サークル ツー サークル増幅 (C2CA) です。これは、RCA 産物が制限酵素で消化され、制限オリゴを使用して新しい環状テンプレートに連結され、その後、増幅用の大量の環状テンプレートを使用して新しいラウンドの RCA が行われます。^[13]

RCA は、単一の分子結合イベントを 1000 倍以上増幅できるため、極微量のターゲットを検出する場合に特に便利です。RCA 反応は、自由溶液環境だけでなく、ガラス、マイクロビーズまたはナノビーズ、マイクロウェルプレート、マイクロ流体デバイス、さらには紙片などの固体表面でも実行できます。この特徴により、RCA は固相免疫測定( ELISAなど) で信号を増幅するための非常に強力なツールになります。このように、RCA は、ゲノミクス、プロテオミクス、診断、バイオセンシングの幅広い用途を持つ、非常に汎用性の高い信号増幅ツールになりつつあります。

免疫RCAは、高特異性かつ高感度なタンパク質検出および定量のための等温信号増幅法である。この技術は、ヌクレオチド増幅を可能にするRCAと、細胞内または遊離バイオマーカーに特異的な抗体を使用する免疫測定の2つの分野を組み合わせたものである。その結果、免疫RCAは特異的な増幅信号（高い信号対雑音比）を与え、液相免疫測定^{[14] [15] [16]}および免疫組織化学における低存在量のタンパク質マーカーの検出、定量、可視化に適している。

免疫RCAは、ELISAまたは免疫組織化学組織染色における典型的な免疫吸着反応に従います。^[17]免疫RCA反応で使用される検出抗体は、重鎖の末端にssDNAオリゴヌクレオチドを結合することによって修飾されます。そのため、検出抗体のFab（フラグメント、抗原結合）セクションは特定の抗原に結合でき、オリゴヌクレオチドはRCA反応のプライマーとして機能します。

典型的な抗体媒介免疫RCA手順は次のとおりです。

1. 検出抗体は特定のタンパク質ターゲットを認識します。この抗体もオリゴヌクレオチドプライマーに結合します。

2. 環状 DNA が存在する場合、それがアニールされ、プライマーが環状 DNA の相補配列と一致します。

3. 環状 DNA テンプレートの相補配列は何百回もコピーされ、抗体に付着したままになります。

4. RCA 出力（伸長した ssDNA）は、蛍光顕微鏡またはマイクロプレートリーダーを使用して蛍光プローブで検出されます。

抗体媒介免疫RCAに加えて、ssDNA RCAプライマーをDNAアプタマーの3'末端に結合させることもできる。プライマーテールはローリングサークル増幅によって増幅することができる。生成物は蛍光レポーターの標識によって視覚化することができる。^[19]このプロセスは右の図に示されています。

RCAのさまざまな誘導体は、バイオセンシングの分野で広く使用されています。たとえば、RCAは臨床サンプルからウイルスや細菌のDNAの存在を検出するために効果的に使用されており、^{[20] [21] 、}感染症の迅速診断に非常に有益です。また、核酸（DNAとRNAの両方）マイクロアレイアッセイのオンチップ信号増幅法としても使用されています。 ^[1]

バイオセンシング用途における増幅機能に加えて、RCA技術はDNAナノ構造やDNAハイドロゲルの構築にも応用できる。RCAの生成物は、ナノ種やタンパク質の周期的集合、金属ナノワイヤの合成^{[22] 、ナノアイランドの形成[1]}のテンプレートとしても使用できる。

• セレクタテクニック

• 小さな環状 DNA 分子を用いた DNA 複製システムGenomes 2、T. Brown 他、NCBI Books
• MicrobiologyBytes: ウイロイドとウィルスイド
• http://mcmanuslab.ucsf.edu/node/246