プラスミド調製

プラスミド調製は、プラスミドDNAのDNA抽出および精製法である。多くの分子生物学実験において重要なステップであり、研究やバイオテクノロジーにおいてプラスミドをうまく利用するために不可欠である。^{[1] [2]}細菌からプラスミドDNAを精製するための多くの方法が開発されてきた。^{[1] [3]}精製手順中に、プラスミドDNAは多くの場合、混入タンパク質やゲノムDNAから分離される。

これらの方法には、細菌培養の増殖、細菌の収穫と溶解、プラスミドDNAの精製という3つのステップが必ず含まれます。^{[4]プラスミドの精製は}分子クローニングの中心です。精製されたプラスミドは、配列決定や細胞への トランスフェクションなど、多くの標準的な用途に使用できます。

プラスミドはほとんどの場合、形質転換され分離された液体細菌培養物（通常は大腸菌）^{から精製される。 [5] [6]}一般的に使用されるほぼすべてのプラスミドベクターは、選択マーカーとして1つ以上の抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性またはカナマイシン耐性をコードする遺伝子をコードしており、これにより形質転換に成功した細菌は阻害されずに増殖することができる。^{[7] [8] [9]}プラスミドベクターを取り込まなかった細菌は耐性遺伝子を欠いているとみなされ、したがって形質転換に成功したコロニーのみが増殖すると予想される。^{[5] [9] [10]} 細菌は好ましい条件下で増殖する。

細胞溶解にはアルカリ溶解、機械的溶解、酵素溶解などいくつかの方法がある。^{[11] [12] [13] [14]}

最も一般的な方法はアルカリ溶解であり、これは水酸化ナトリウムなどの高濃度の塩基性溶液を使用して細菌細胞を溶解する。^{[15] [16] [17]細菌を}アルカリ条件（pH 12.0〜12.5）で溶解すると、染色体DNAとタンパク質の両方が変性するが、プラスミドDNAは安定したままである。 ^{[16] [17]} ssDNAの発生を減らすために、使用するNaOHの濃度を0.1Mに下げる科学者もいる。酢酸を含む中和緩衝液を加えて pHを約7に下げると、大きくて超らせん構造の少ない染色体 DNAとタンパク質が大きな複合体を形成して沈殿するが、小さな細菌DNAプラスミドは溶液中に残る。^{[17] [14]}

機械的溶解では、粉砕や超音波処理などの物理的な力を利用して細菌細胞を分解し、プラスミドDNAを放出します。フレンチプレス、ビーズビーティング、超音波処理など、いくつかの異なる機械的溶解方法が使用できます。^{[11] [12] [13] [14]}

酵素溶解はリゾチーム溶解とも呼ばれ、酵素を使用して細胞壁を消化し、プラスミドDNAを放出します。^[11]この目的で最も一般的に使用される酵素はリゾチームであり、グラム陽性細菌の細胞壁のペプチドグリカンを分解します。リゾチームは通常、細菌培養物に加えられ、その後培養物を加熱および/または振盪してプラスミドDNAを放出します。^{[11] [12] [13] [14]}

プラスミドの調製は、調製の規模に基づいて、ミニ調製、ミディ調製、マキシ調製、メガ調製、ギガ調製の5つの主要なカテゴリに分類できます。どの方法を使用するかは、必要なプラスミドDNAの量と、それが使用される特定の用途によって異なります。^{[18] [19]}

プラスミドDNAを精製するためのキットは様々なメーカーから販売されており、細菌培養のサイズとそれに対応するプラスミド収量によって名前が付けられています。キットの名前は、小さい順に、ミニプレップ、ミディプレップ、マキシプレップ、メガプレップ、ギガプレップです。プラスミドDNAの収量は、プラスミドのコピー数、種類、サイズ、細菌株、増殖条件、キットによって異なります。^[2]

プラスミドDNAのミニプレパレーションは、細菌からプラスミド DNAを迅速に小規模に分離する方法である。^{[20] [21]}一般的に使用されるミニプレップ法には、アルカリ溶解法とスピンカラムベースのキットがある。^{[3] [22]}これはアルカリ溶解法に基づく。ミニプレップの実行によって抽出されたプラスミドDNAは、それ自体が「ミニプレップ」と呼ばれることが多い。ミニプレップは、分子クローニングのプロセスで細菌クローンを分析するために使用される。ミニプレップの典型的なプラスミドDNA収量は、細胞株に応じて5〜50μgである。多数のプラスミドのミニプレップは、細胞を溶解してプラスミドをろ紙に溶出させることによって、ろ紙上で簡単に行うこともできる。^[21]

大腸菌の初期培養量は、溶原性培地（LB）15～25 mLで、予想される DNA 収量は 100～350 μg です。

開始時の大腸菌培養量は LB 100～200 mL で、予想される DNA 収量は 500～850 μg です。

開始時の大腸菌培養量は 500 mL ～ 2.5 L の LB で、予想される DNA 収量は 1.5 ～ 2.5 mg です。

大腸菌培養の開始容量は LB 2.5～5 L で、予想される DNA 収量は 7.5～10 mg です。

精製法を選択する際には、プラスミド DNA の下流用途を考慮することが重要です。たとえば、プラスミドをトランスフェクションやエレクトロポレーションに使用する場合は、純度が高くエンドトキシンレベルが低い精製法が望ましいです。同様に、プラスミドをシーケンシングや PCR に使用する場合は、収量が高く汚染物質が最小限に抑えられる精製法が望ましいです。^[2] ただし、核酸の精製法は複数存在します。^{[23] [24] [25]いずれも、核酸のみが沈殿するか、他の}生体分子のみが沈殿する条件を生成するという原理に基づいており、核酸を分離することができます。^{[15] [23]}

ハイスループット DNA 抽出ワークフローでは、96 ウェル プレート テンプレートなどの実験装置を利用して、複数のサンプルを並行して効率的に処理できます。これらのテンプレートを使用すると、抽出プロトコルを自動化できるため、大規模なサンプル セット全体で一貫性を保ちながら、プラスミド DNA 分離のスループットを大幅に向上できます。自動液体処理システムと組み合わせて使用​​すると、96 ウェル プレート テンプレートは細菌培養物からプラスミド DNA を抽出するプロセスを効率化し、均一性を確保して、精製ステップ中の手動エラーを削減するのに役立ちます。

エタノール沈殿法は、プラスミドDNAを含む核酸の精製と濃縮に広く使用されている方法です。 ^[26]この方法の基本原理は、核酸はエタノールやイソプロパノールには溶けないが、水には溶けるというものです。したがって、エタノールをDNAの抗溶媒として使用し、DNAを溶液から沈殿させ、遠心分離で回収することができます。可溶性画分は他の生体分子を除去するために廃棄されます。^[27]

スピンカラムベースの核酸精製は、 スピンカラムフィルターを使用してサンプルからDNA、RNA、またはプラスミドを精製する方法です。^{[25]この方法は、スピンカラム内の固体マトリックスに核酸を選択的に結合させ、}タンパク質や塩などの他の汚染物質を洗い流すという原理に基づいています。次に、条件を変更して、適切な溶出バッファーを使用して精製された核酸をカラムから溶出します。^[25]

フェノール-クロロホルム抽出の基本原理は、DNAとRNAはフェノールとクロロホルムに比較的溶けにくいが、他の細胞成分はこれらの溶媒に比較的溶けやすいというものである。フェノール/クロロホルム混合物を加えると、タンパク質と脂質の汚染物質が溶解し、核酸が水相に残る。また、DNaseなどのタンパク質も変性するため、プラスミドを酵素消化に使用する場合は特に重要である。そうでなければ、酵素制限されたプラスミドDNAではスメアリングが発生する可能性がある。^[24]

ビーズベースの抽出では、一般的に鉄イオンで作られた磁性ビーズを含む混合物を加えるとプラスミドDNAに結合し、磁性棒または磁気スタンドによって不要な化合物から分離されます。^{[25]プラスミドに結合したビーズは磁場を除去することで解放され、}形質転換や制限消化などの下流の実験のために溶出溶液に抽出されます。この形式のミニプレップは自動化することもでき、機械的なエラーを減らしながら利便性を高めます。

• http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Plasmid/Miniprep/
• 精製および洗浄中に珪藻土を使用して DNA を結合するミニプレップ手順。