プラスミドコピー数

細胞生物学では、プラスミドのコピー数は、細胞内の特定のプラスミドのコピー数です。プラスミドが確実に生存し、継続的に増殖するには、コピー数を調整する必要があります。プラスミドのコピー数が多すぎると、細胞機構を占有しすぎてエネルギーを使いすぎるため、宿主に過度の負担をかける可能性があります。一方、コピー数が少なすぎると、宿主の子孫すべてにプラスミドが存在しない可能性があります。プラスミドは、低コピー数、中コピー数、高コピー数のいずれかであり、低コピー数プラスミドと中コピー数プラスミドの間の調整メカニズムは異なります。低コピー数プラスミド（宿主あたり5コピー以下）では、各娘細胞がプラスミドを受け取ることを保証するために、分割システムまたはCcdA/CcdBなどの毒素-抗毒素ペアが必要です。たとえば、BAC（細菌人工染色体）の起源であるFプラスミドは、プラスミド起源のすぐ隣のオペロンにコード化された分割システムを持つ単一コピープラスミドです。分割システムは隔壁装置と相互作用して、各娘細胞がプラスミドのコピーを受け取るようにします。多くのバイオテクノロジー用途では、複製時に高コピー数になる変異プラスミドが利用されています。たとえば、pBR322は中コピー数プラスミド (~20 コピー/細胞) で、このプラスミドから突然変異誘発によって、よく知られている pUC シリーズなどの高コピー数クローニングベクター(>100 コピー/細胞) がいくつか派生しました。^[1]これにより、プラスミド DNA の収量が増えるという利便性が得られますが、高コピー数による追加の負担により、プラスミドのサイズが制限されます。より大きな高コピー数プラスミド (>30kb) は好ましくなく、欠失突然変異誘発によってサイズが縮小される傾向があります。

中コピー数プラスミド (リラックスプラスミドとも呼ばれる) には、細胞内のプラスミド数が特定のしきい値に達すると複製が確実に抑制されるシステムが必要です。リラックスプラスミドは、通常、アンチセンス RNAまたはイテロン結合グループの 2 つのメカニズムのいずれかによって制御されます。低コピー数プラスミド (ストリンジェントプラスミドとも呼ばれる) には、複製をより厳密に制御する必要があります。

ColE1由来のプラスミドでは、複製は主にRNA Iと呼ばれる小さなプラスミドコード化RNAによって制御される。ColE1では単一のプロモーター、RNA IIプロモーターによって複製が開始される。RNA II転写産物は複製起点付近のDNAテンプレート鎖と安定したRNA-DNAハイブリッドを形成し、そこでRNaseHによって処理されて3' OHプライマーが生成され、 DNAポリメラーゼIはこれを使用してリーディング鎖DNA合成を開始する。RNA Iは、濃度がプラスミドのコピー数に比例する、このプロセスの主要なプラスミドコード化阻害剤として機能している。RNA IはRNA IIの5'末端と完全に相補的である（RNA IIと同じDNA領域の反対鎖から転写されるため）。RNA IとRNA IIはキッシング複合体を形成する。キッシング複合体はRop （プライマーのリプレッサー）と呼ばれるタンパク質によって安定化され、二本鎖RNA-I/RNA-II RNA二重鎖が形成される。この変化した形状により、RNA II が DNA とハイブリダイズして RNaseH から処理され、プラスミド複製の開始に必要なプライマーが生成されなくなります。プラスミド濃度が増加すると RNA I がより多く生成され、複製がますます阻害され、コピー数の調節につながります。^{[2] [3]}

ほとんどのプラスミドは、通常 Rep と呼ばれるプラスミドコード化タンパク質を必要とし、これがDNA 複製を開始するために複製起点( oriV ) で DNA 鎖を分離する。Rep はプラスミドの種類に固有のoriV内の特定の DNA 配列に結合します。Rep タンパク質の合成は、プラスミドの複製を制限し、したがってコピー数を制御するために制御されます。R1プラスミドでは、 RepA は 2 つの異なるプロモーターから転写されます。プラスミドがそのコピー数に達するまで、RepA は第 1 プロモーターから作成され、コピー数に達すると、タンパク質 CopB がこの第 1 プロモーターを抑制します。^{[3] RepA の発現は、} CopAと呼ばれるアンチセンス RNA によって第 2 プロモーターから転写後にも制御されます。CopA は RepA mRNA 内の RNA 標的と相互作用し、キッシング複合体を形成し、次に RNA-RNA 二重鎖を形成します。結果として生じる二本鎖 RNA はRNase IIIによって切断され、RepA の合成が妨げられます。プラスミドの濃度が高くなるほど、CopA RNAの生成量が増加し、RepAタンパク質の合成量が減少し、プラスミド複製の阻害が増加します。^[4]

低コピー数ColIb-P9の複製は、repZ遺伝子の発現によって生成されるRepに依存します。repZの発現には、mRNAの擬似ノットの形成が必要です。repZは、 repZ mRNAに結合してInc RNA-mRNA二重鎖を形成し、擬似ノットの形成を防ぎ、repZからRepへの翻訳を阻害する小さなアンチセンスInc RNAによって抑制されます。このイベントでは、複製はもはや発生しません。^[5]

FおよびRK2関連プラスミドを含むイテロンプラスミドは、 17-22 bpのイテロン配列の複数（約3-7）の繰り返しを含むoriV領域を持っています。 ^[3] pSC101は、イテロンプラスミドの単純なモデルを表しています。イテロンプラスミドは、低コピー数のストリンジェントプラスミドに適した2つの方法を組み合わせてコピー数を制御します。 1つの方法は、RepA合成の制御です。 RepAは、pSC101での複製に必要な唯一のプラスミドコードタンパク質です。 RepAタンパク質は、自身のプロモーター領域に結合して自身の転写をブロックすることにより、自身の合成を抑制します（転写自己調節）。 したがって、RepAが多く作られるほど、その合成は抑制され、結果としてプラスミドの複製が制限されます。^[3]カップリング仮説は、2番目の方法はRepタンパク質とイテロン配列を介したプラスミドのカップリングであると提案しています。プラスミド濃度が高い場合、イテロンに結合したRepAプラスミドは2つのプラスミドの間に二量体を形成し、複製起点でそれらを「手錠」にして複製を阻害します。^[6]

プラスミドは、同じ複製制御機構を共有している場合、非互換となる可能性があります。このような状況では、両方のプラスミドが総コピー数に寄与し、一緒に制御されます。これらは別個のプラスミドとして認識されません。そのため、プラスミドの1つがもう1つによってコピーされ、細胞分裂中に失われる可能性が高くなります（細胞はプラスミドから「治癒」されます）。^{[3]これは、コピー数の少ないプラスミドで特に起こりやすいです。プラスミドは、共有された}パーティションシステムのために非互換となることもあります。