酵母人工染色体

酵母人工染色体（YAC）は、酵母Saccharomyces cerevisiaeのDNAから作られた遺伝子操作された染色体である。そして、それを細菌プラスミドに連結する。100～1000  kbの大きなDNA断片を挿入することで、挿入された配列をクローニングし、染色体ウォーキングと呼ばれるプロセスを用いて物理的にマッピングすることができる。これは当初ヒトゲノムプロジェクトで使用されたプロセスであるが、安定性の問題から、YACは細菌人工染色体の使用に置き換えられた。

パン酵母S. cerevisiaeは、真核生物の分子遺伝学を研究するための最も重要な実験生物の1つである。^{[ 1 ]}

Rankin ら、Strul ら、Hsaio らによる初期の研究から始まり、本来脆弱な染色体は、必要な自律複製配列(ARS) を発見することによって安定化されました。^{[ 2 ]}このデータを利用した改良型 YAC は、1983 年に Murray らによって記述されました。^{[ 3 ]}

YACの主要構成要素はARS、セントロメアである。テロメア​S. cerevisiae由来。さらに、抗生物質耐性や可視マーカーなどの選択マーカー遺伝子が、形質転換酵母細胞を選択するために利用される。これらの配列がないと、染色体は細胞外複製中に安定せず、ベクターのないコロニーと区別できない。^{[ 4 ]}

YACは、通常制限酵素を用いて線状DNA分子に切断される初期の環状DNAプラスミドを使用して構築されます。次に、 DNAリガーゼを使用して、目的のDNA配列または遺伝子を線状DNAに連結し、単一の大きな環状DNA断片を形成します。^{[ 3 ]}線状酵母人工染色体の基本的な生成は、主に6つのステップに分けられます。

染色体IIIはS. cerevisiaeで3番目に小さい染色体であり、パルスフィールドゲル電気泳動研究からそのサイズは300～360kbと推定されている^{[ 10 ] 。}

この染色体は、特に交配型制御に関わる 3 つの遺伝子座 (MAT、HML、HMR) が含まれていることから、集中的な研究の対象となってきた。^{[ 11 ]} 2014 年 3 月、ニューヨーク大学ランゴン医療センターのJef Boeke氏は、彼のチームがS. cerevisiae の16 個の酵母染色体の 1 つである染色体 III を合成し、synIIIと名付けたと発表した。^{[ 12 ] [ 13 ]}この手順では、元の染色体の遺伝子を合成バージョンに置き換え、完成した合成染色体を酵母細胞に組み込んだ。これには、元の染色体の 316,667 対よりも少ない 273,871 対の DNA を設計および作成する必要があった。

YAC、YIps（酵母インテグレーションプラスミド）、YEps（酵母エピソームプラスミド）などの酵母発現ベクターは、翻訳後修飾を必要とする真核生物タンパク質の発現に使用できるという点で、細菌人工染色体（BAC）よりも優れています。YACは大きなDNA断片を挿入できるため、生物の全ゲノムをクローニングして組み立てるために利用できます。^{[ 14 ]} YACを酵母細胞に挿入すると、線状人工染色体として増殖させることができ、その過程で挿入されたDNA領域をクローニングします。これが完了すると、2つのプロセスを使用して、配列決定されたゲノムまたは目的の領域を取得できます。

1. 物理地図作成
2. 染色体ウォーキング^{[ 15 ]}

これは、ゲノムの特定領域の詳細なマッピングを可能にするという点で重要である。X染色体などのヒト染色体全体が調べられており^{[ 16 ]} 、多数の遺伝性疾患や形質の遺伝子マーカーの位置が明らかになっている^{[ 17 ] 。}

米国では、ヒトゲノムプロジェクトは、1988年2月に国立研究評議会（NRC）の報告書「ヒトゲノムのマッピングとシーケンス」が発表されたことで初めて明確な形になった。^{[ 18 ]} YACはBACよりも安定性が著しく低く、「キメラ効果」が生じる 。これは、クローン化されたDNAの配列が実際には単一のゲノム領域ではなく複数の領域に対応するアーティファクトである。キメラ現象は、複数のゲノムセグメントが単一のYACに共連結されるか、同じ宿主酵母細胞で形質転換された2つ以上のYACが組み換えられることによって生じる可能性がある。^{[ 19 ]}キメラ現象の発生率は50%にも達する可能性がある。^{[ 20 ]}その他のアーティファクトとしては、クローン化された領域からのセグメントの欠失や、ゲノムセグメントの再配置（逆位など）がある。これらのケースすべてにおいて、YACクローンから決定された配列は元の自然な配列とは異なり、クローンの情報に頼ると結果が不整合になり、解釈に誤りが生じる。これらの問題のため、ヒトゲノムプロジェクトは最終的にYACの使用を放棄し、これらのアーティファクトの発生率が非常に低い細菌人工染色体に切り替えた。安定性の問題、特にキメラ事象が比較的頻繁に発生することに加えて、YACはヒトゲノム全体をカバーする最小タイリングパスを生成する際に非効率的であることが判明した。クローンライブラリの生成には時間がかかる。また、適切なクローンを選択する際の参照点として配列タグ付きサイト（STS）に依存する性質上、さらにライブラリを生成する必要がある大きなギャップが存在する。この追加の障害が、プロジェクトが代わりにBACを使用するように促した。^{[ 21 ]}これは2つの要因によるものである。^{[ 22 ]}

1. BACは生成がはるかに速く、クローンの冗長ライブラリを生成する際には、これは不可欠です。
2. BACを用いることでSTSによるより高密度なカバレッジが可能となり、その結果、より完全かつ効率的な最小タイルパスがコンピュータ上で生成される。

しかし、線虫C. elegansのゲノムの場合に実証されたように、両方のアプローチを利用することも可能である。ゲノムの大部分はBACでタイル状に分割され、ギャップはYACで埋められた。^{[ 21 ]}

• 細菌人工染色体（BAC）
• コスミッド
• フォスミド
• 遺伝子工学
• ヒト人工染色体
• 自律複製配列（ARS）
• クローニングベクター

• 米国国立医学図書館の医学主題見出し（MeSH）における「酵母＋人工染色体」
• ノースダコタ州立大学のクローニングとクローニングベクターに関するリソース（2018年12月27日にWayback Machineにアーカイブ済み）
• 分子細胞生物学 第4版 [NCBIデータベース]：プラスミドベクターを用いたDNAクローニング、第7章
• ワシントン大学ゲノム研究所
• サッカロミセスゲノムデータベース