モノクローナル抗体

モノクローナル抗体( mAb 、まれにmoAbと呼ばれる) は、固有の白血球をクローン化して作られた細胞系統から生成される抗体です。この方法で生成された後続の抗体はすべて、固有の親細胞に由来します。

モノクローナル抗体は一価の親和性を持ち、同じエピトープ（抗体によって認識される抗原の部分）にのみ結合します。 ^[3]対照的に、ポリクローナル抗体は複数のエピトープに結合し、通常はいくつかの異なる抗体分泌形質細胞系統によって生成されます。二重特異性モノクローナル抗体は、 1つのモノクローナル抗体の治療標的を2つのエピトープに増やすことによって設計することもできます。

ほぼあらゆる適切な物質に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製することが可能であり、それらの抗体は物質の検出や精製に使用できます。この能力は、生化学、分子生物学、医学の分野で調査ツールとなっています。モノクローナル抗体は、がんや感染症などの病気の診断に使用され^[4]、がんや炎症性疾患 などの治療にも使用されます。

1900 年代初頭、免疫学者の ポール・エールリッヒは、病原体を選択的に標的とし、その病原体に毒素を送達できる化合物として考えられた「魔法の弾丸」であるザウバークーゲルの概念を提唱しました。これがモノクローナル抗体とモノクローナル薬物複合体の概念の基礎となりました。エールリッヒとエリー・メチニコフは、免疫学の理論的基礎を提供したことにより、 1908 年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。

1970年代までに、多発性骨髄腫（ B細胞に影響を及ぼす癌）の形で、単一の抗体を産生するリンパ球が知られるようになった。これらの異常な抗体またはパラプロテインが抗体の構造研究に使用されたが、特定の抗原に特異的な同一の抗体を産生することはまだ不可能であった。^{[5] : 324} 1973年、ジェロルド・シュヴァーバーは、ヒトとマウスのハイブリッド細胞を使用したモノクローナル抗体の産生について説明した。^[6]この研究は、ヒト由来のハイブリドーマを使用した研究の中で、今でも広く引用されている。^[7] 1975年、ジョルジュ・ケーラーとセザール・ミルシュタインは、骨髄腫細胞株とB細胞を融合して、既知の抗原に特異的で不死化された抗体を産生できるハイブリドーマを作成することに成功した。^[8]彼らとニールス・カイ・イェルネは、この発見により1984年のノーベル生理学・医学賞を共同受賞した。 ^[8]

1988年、グレゴリー・ウィンターと彼のチームはモノクローナル抗体をヒト化する技術を開発し、^[9]多くのモノクローナル抗体が一部の患者に引き起こしていた反応を排除しました。1990年代までにモノクローナル抗体を治療に利用する研究が進み、2018年にはジェームズ・P・アリソンと本庶佑が、阻害結合を防ぐモノクローナル抗体を使用して負の免疫調節を阻害することによる癌治療の発見によりノーベル生理学・医学賞を受賞しました。^[10]

これらのアイデアを実装するために必要なトランスレーショナル研究は、リー・ナドラーの功績である。NIH の記事で説明されているように、「彼はヒト B 細胞特異抗原に対するモノクローナル抗体を初めて発見した人物であり、実際、既知のヒト B 細胞特異抗原はすべて彼の研究室で発見された。彼はこれらのモノクローナル抗体を使用してヒト B 細胞白血病およびリンパ腫を分類し、患者のための治療薬を作成したため、真のトランスレーショナル研究者である。…さらに重要なことは、彼は世界で初めてヒト（B 細胞リンパ腫の患者）にモノクローナル抗体を投与した人物である。」^[11]

モノクローナル抗体の製造の背後にある研究の多くは、ハイブリドーマの製造に根ざしており、これは、目的の抗原に特異的な抗体を産生する抗原特異的形質/形質芽球細胞を特定し、これらの細胞を骨髄腫細胞と融合することを含む。 ^[8]ウサギB細胞は、ウサギハイブリドーマを形成するために使用することができる。^{[12] [13]}ポリエチレングリコールは、隣接する形質膜を融合するために使用されるが、^[14]成功率が低いため、融合細胞のみが成長できる選択培地が使用されます。これが可能なのは、骨髄腫細胞が、核酸のサルベージ合成に必要な酵素であるヒポキサンチン-グアニン-ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）を合成する能力を失っているためです。HGPRTの欠如は、 de novoプリン合成経路も破壊されない限り、これらの細胞にとって問題ではありません。細胞をアミノプテリン（ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害する葉酸類似体）にさらすと、細胞は de novo 経路を使用できなくなり、完全に核酸要求性になり、生存するためには補充が必要になります。

選択培養培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むため、 HAT 培地と呼ばれます。この培地は、融合 (ハイブリドーマ) 細胞に対して選択的です。融合していない骨髄腫細胞は、HGPRT が欠如しているため成長できず、DNA を複製できません。融合していない脾臓細胞は、寿命が限られているため、無限に成長することはできません。ハイブリドーマと呼ばれる融合ハイブリッド細胞のみが、脾臓細胞パートナーが HGPRT を供給し、骨髄腫パートナーが不死になる特性 (癌細胞と同様) を持っているため、培地内で無限に成長できます。

この細胞混合物を希釈し、マイクロタイターウェル上で単一の親細胞からクローンを増殖させます。その後、さまざまなクローンから分泌された抗体の抗原への結合能力を検査します ( ELISAや抗原マイクロアレイアッセイなどのテストを使用)。または免疫ドットブロット法を使用します。最も生産的で安定したクローンを選択して、将来の使用に備えます。

ハイブリドーマは、適切な細胞培養培地で無期限に増殖することができます。また、マウスに注入することもできます（腸の周囲の腹腔内）。そこで、ハイブリドーマは腹水と呼ばれる抗体を豊富に含む液体を分泌する腫瘍を形成します。

ハイブリドーマの成長をさらに促進するために、 in vitro選択中に培地を濃縮する必要があります。これは、フィーダー線維芽細胞層またはブリクロンなどの補助培地を使用することで実現できます。マクロファージで調整した培養培地を使用することもできます。腹水法は動物に痛みを伴うため、通常は細胞培養による生産が好まれます。代替技術が存在する場合、腹水法は非倫理的であると見なされます。^[15]

近年、いくつかのモノクローナル抗体技術が開発されており、^[16]ファージディスプレイ、^[17]単一B細胞培養、^[18]様々なB細胞集団からの単一細胞増幅^{[19] [20] [21] [22] [23]}および単一形質細胞調査技術などがある。従来のハイブリドーマ技術とは異なり、新しい技術は分子生物学技術を使用してPCRによって抗体遺伝子の重鎖と軽鎖を増幅し、組み換え技術を使用して細菌または哺乳類システムで生成する。新しい技術の利点の1つは、ウサギ、ラマ、ニワトリ、および研究室でのその他の一般的な実験動物など、複数の動物に適用できることである。

培養ハイブリドーマの培地サンプルまたは腹水サンプルのいずれかを入手した後、目的の抗体を抽出する必要があります。細胞培養サンプルの汚染物質は、主に成長因子、ホルモン、トランスフェリンなどの培地成分で構成されています。対照的に、in vivoサンプルには、宿主抗体、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、核酸、ウイルスが含まれている可能性があります。どちらの場合も、サイトカインなどのハイブリドーマによるその他の分泌物が存在する可能性があります。細菌汚染もあり、その結果、細菌によって分泌されるエンドトキシンが存在する可能性があります。細胞培養に必要な培地の複雑さ、したがって汚染物質に応じて、いずれかの方法 ( in vivoまたはin vitro ) が適している場合があります。

まずサンプルをコンディショニング、つまり精製用に準備します。細胞、細胞残渣、脂質、凝固物質は、通常、遠心分離によって最初に除去され、その後 0.45 μm のフィルターで濾過されます。これらの大きな粒子は、後の精製ステップで膜ファウリングと呼ばれる現象を引き起こす可能性があります。さらに、特に目的の抗体が低分泌細胞株によって生成される場合、サンプル内の生成物の濃度が十分でない可能性があります。そのため、サンプルは限外濾過または透析によって濃縮されます。

荷電不純物のほとんどは通常、核酸やエンドトキシンなどの陰イオンです。これらはイオン交換クロマトグラフィーで分離できます。^[24]陽イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオンが通過する間に目的の抗体がカラムに結合するのに十分低いpHで使用するか、陰イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオンが結合する間に目的の抗体がカラムを通過するのに十分高いpHで使用するかのいずれかです。さまざまなタンパク質も、等電点(pI) に基づいて陰イオンとともに分離できます。タンパク質では、等電点 (pI) は、タンパク質が正味の電荷を持たない pH として定義されます。pH > pI の場合、タンパク質は正味の負電荷を持ち、pH < pI の場合、タンパク質は正味の正電荷を持ちます。たとえば、アルブミンの pI は 4.8 で、pI が 6.1 であるほとんどのモノクローナル抗体の pI よりも大幅に低くなっています。したがって、pH 4.8 ～ 6.1 では、アルブミン分子の平均電荷はより負に帯電する傾向があり、mAbs 分子は正に帯電しているため、分離が可能です。一方、トランスフェリンの pI は 5.9 であるため、この方法では簡単に分離できません。良好な分離には、少なくとも 1 の pI の差が必要です。

トランスフェリンは、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去することもできます。この方法は、より信頼性の高いクロマトグラフィー技術の 1 つです。タンパク質を扱っているため、電荷や親和性などの特性は一定ではなく、分子がプロトン化および脱プロトン化されるにつれて pH によって変化しますが、サイズは比較的一定のままです。ただし、解像度が低い、容量が低い、溶出時間が短いなどの欠点があります。

はるかに迅速で、1 ステップの分離法は、プロテイン A/G アフィニティー クロマトグラフィーです。抗体は選択的にプロテイン A/G に結合するため、高レベルの純度 (一般に 80% 以上) が得られます。この方法の一般に厳しい条件により、損傷を受けやすい抗体が損傷する可能性があります。低 pH では結合が切断され、抗体がカラムから除去される可能性があります。製品に影響を及ぼす可能性があるだけでなく、低 pH ではプロテイン A/G 自体がカラムから漏れ出し、溶出サンプルに現れる可能性があります。高塩濃度を使用する穏やかな溶出バッファー システムを使用すると、敏感な抗体が低 pH にさらされるのを防ぐことができます。固定化されたプロテイン A/G はより高価な樹脂であるため、この方法ではコストも重要な考慮事項です。

1 回のステップで最大限の純度を達成するために、抗原を使用して抗体の特異性を提供するアフィニティー精製を行うことができます。この方法では、抗体を生成するために使用される抗原がアガロース支持体に共有結合されます。抗原がペプチドの場合、通常は末端システインを使用して合成され、これにより、開発中および精製をサポートするためにKLHなどのキャリア タンパク質に選択的に結合できます。次に、抗体を含む培地を固定化抗原とともにインキュベートします。これは、抗体がカラムを通過するときにバッチで、または抗体がカラムを通過するときに行われ、抗体は選択的に結合して保持され、不純物は洗い流されます。次に、低 pH バッファーまたはより穏やかな高塩溶出バッファーを使用した溶出を使用して、精製された抗体を支持体から回収します。

製品の異質性はモノクローナル抗体やその他の組み換え生物学的製品では一般的であり、通常は発現の上流または製造の下流で導入されます。^{[25] [26] [27]}

これらの変異体は典型的には凝集体、脱アミド化生成物、グリコシル化変異体、酸化アミノ酸側鎖、ならびにアミノ末端およびカルボキシル末端アミノ酸付加物である。^[28]これらの一見微細な構造変化は、前臨床安定性およびプロセス最適化、ならびに治療製品の効力、生物学的利用能および免疫原性に影響を及ぼす可能性がある。モノクローナル抗体のプロセスストリームの一般に受け入れられている精製​​方法には、タンパク質Aによる製品ターゲットの捕捉、溶出、潜在的な哺乳類ウイルスを不活化するための酸性化、続いて最初に陰イオンビーズ、次に陽イオンビーズによるイオンクロマトグラフィーが含まれる。 ^[要出典]

置換クロマトグラフィーは、動物薬物動態研究などのその後の前臨床評価計画に適した量で、これらの目に見えない変異体を同定し、特徴付けるために使用されています。 ^{[29] [30]}前臨床開発段階で得られた知識は、製品の品質理解を深めるために重要であり、リスク管理と規制の柔軟性の向上の基礎を提供します。最近の食品医薬品局のQuality by Designイニシアチブは、開発に関するガイダンスを提供し、製品の製造可能性を高めながら有効性と安全性プロファイルを最大化する製品とプロセスの設計を促進することを目的としています。^[31]

組み換えモノクローナル抗体の生産には、レパートリークローニング、CRISPR/Cas9、またはファージディスプレイ/酵母ディスプレイ技術が含まれます。^[32]組み換え抗体エンジニアリングでは、マウスではなくウイルスまたは酵母を使用して抗体を生産します。これらの技術は、免疫グロブリン遺伝子セグメントの迅速なクローニングに依存しており、わずかに異なるアミノ酸配列を持つ抗体のライブラリーを作成し、そこから目的の特異性を持つ抗体を選択できます。^[33]ファージ抗体ライブラリーは、ファージ抗原ライブラリーの変形です。^[34]これらの技術は、抗体が抗原を認識する特異性、さまざまな環境条件での安定性、治療効果、診断用途での検出可能性を高めるために使用できます。^[35]大規模な抗体生産には発酵チャンバーが使用されています。

マウス抗体とヒト抗体は構造的に類似していますが、マウスモノクローナル抗体をヒトに注射すると、両者の相違により免疫反応が誘発され、血液から抗体が急速に除去されるとともに、全身性炎症作用とヒト抗マウス抗体（HAMA）の生成が引き起こされます。

組換えDNAは、1980年代後半から、滞留時間を延ばすために研究されてきました。「CDRグラフティング」と呼ばれるアプローチの1つでは、^[36]モノクローナル抗体の結合部分をコードするマウスDNAを、生きた細胞内でヒト抗体産生DNAと融合させました。この「キメラ」または「ヒト化」DNAを細胞培養で発現させると、部分的にマウス、部分的にヒトの抗体ができました。^{[37] [38]}

モノクローナル抗体が生成可能であることが発見されて以来、科学者はヒト化抗体やキメラ抗体の副作用を軽減するために、完全ヒト製品の作成を目指してきました。いくつかの成功したアプローチが提案されています：トランスジェニックマウス、^[39]、 ファージディスプレイ^[17]、単一B細胞クローニング^{[16] 。}

モノクローナル抗体は、複雑なプロセスと分子の一般的なサイズのため、小分子よりも製造コストが高く、さらに新しい化学物質を患者に届けるには膨大な研究開発費がかかる。モノクローナル抗体の価格は、メーカーが通常多額の投資費用を回収できるように設定されており、米国のように価格統制のない国では、大きな価値を提供する場合は価格が高くなる可能性がある。ピッツバーグ大学の研究者7人は、「モノクローナル抗体療法の年間価格は、腫瘍学と血液学では他の疾患状態よりも約10万ドル高い」と結論付け、患者1人当たりの費用を心臓血管疾患や代謝疾患、免疫学、感染症、アレルギー、眼科の費用と比較した。^[40]

特定の物質に対するモノクローナル抗体が生成されると、その抗体を使用してその物質の存在を検出できます。タンパク質は、ウェスタンブロット法と免疫ドットブロット法を使用して検出できます。免疫組織化学では、モノクローナル抗体を使用して固定組織切片内の抗原を検出できます。同様に、免疫蛍光法を使用して、凍結組織切片または生細胞内の物質を検出できます。

抗体は、免疫沈降法を使用して混合物から標的化合物を精製するためにも使用できます。

治療用モノクローナル抗体は、標的分子の機能阻害、標的を発現する細胞におけるアポトーシスの誘導、シグナル伝達経路の調節など、複数のメカニズムを通じて作用する。 ^{[41] [42] [43]}

がんの治療法として考えられるものの一つに、がん細胞に特異的な抗原にのみ結合し、標的のがん細胞に対する免疫反応を誘導するモノクローナル抗体があります。このような mAbs は、毒素、放射性同位元素、サイトカイン、その他の活性複合体を送達できるように改変したり、標的抗原と複合体またはエフェクター細胞の両方にFab 領域で結合できる二重特異性抗体を設計したりすることができます。完全な抗体はすべて、Fc 領域で細胞受容体やその他のタンパク質に結合できます。

FDAが癌治療薬として承認したモノクローナル抗体には以下のものがある：^[45]

自己免疫疾患に使用されるモノクローナル抗体には、TNF-αに結合して阻害する能力により、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎に有効なインフリキシマブやアダリムマブなどがある。^[46]バシリキシマブとダクリズマブは活性化T細胞上のIL-2を阻害し、腎移植の急性拒絶反応の予防に役立つ。^[46]オマリズマブはヒト免疫グロブリンE （IgE）を阻害し、中等度から重度のアレルギー性喘息の治療に有用である。

研究用途のモノクローナル抗体は、抗体サプライヤーから直接、またはCiteAbなどの専門検索エンジンを使用して見つけることができます。以下は、臨床的に重要なモノクローナル抗体の例です。

2020年には、モノクローナル抗体療法であるバムラニビマブ/エテセビマブとカシリビマブ/イムデビマブが、COVID-19による入院、救急外来受診、死亡者数を減らすために米国食品医薬品局から緊急使用許可を受けた。^{[48] [49]} 2021年9月、バイデン政権は不足を抑えるために、1回2,100ドルで29億ドル相当のリジェネロン社のモノクローナル抗体を購入した。^[51] 

2021年12月現在、試験管内中和試験では、モノクローナル抗体療法（ソトロビマブとチクサゲビマブ/シルガビマブを除く）はオミクロン変異体に対して有効ではない可能性が高いことが示されています。^[52]

2021年から2022年にかけて行われた2件のコクランレビューでは、COVID-19感染症の治療に中和モノクローナル抗体を使用する根拠が不十分であることが判明した。^{[53] [54]}レビューはCOVID-19のワクチン接種を受けていない人にのみ適用され、研究中に存在していたCOVID-19の変異株のみに適用され、オミクロンなどの新しい変異株には適用されなかった。^[54]

2024年3月、モノクローナル抗体薬であるペミビバートは、中等度から重度の免疫不全患者をCOVID-19から守るための曝露前予防薬として米国FDAから緊急使用許可を受けた。 ^{[55] [56]}

ベバシズマブやセツキシマブなどのいくつかのモノクローナル抗体は、さまざまな種類の副作用を引き起こす可能性があります。^[57]これらの副作用は、一般的な副作用と重篤な副作用に分類できます。^[58]

一般的な副作用としては次のようなものがあります。

起こりうる重篤な副作用としては、以下のものがある：^[59]

• モノクローナル抗体のリスト

• 米国国立医学図書館の医学件名表題(MeSH)にあるモノクローナル抗体
• Antibodypedia は、科学コミュニティが利用できるあらゆる抗体に関するデータと解説を公開するオープン アクセスの仮想リポジトリです。
• 抗体精製ハンドブック 2008年12月5日アーカイブウェイバックマシン