サイズ排除クロマトグラフィー

サイズ排除クロマトグラフィー

サイズ排除クロマトグラフィーを実行するための装置。バッファーがカラムに送り込まれます (左)。
頭字語	SEC
分類	クロマトグラフィー
分析対象物	高分子 合成ポリマー 生体分子
メーカー	Cytiva、Bio-Rad、Bio-Works、emp Biotech、Knauer、Phenomenex。
その他のテクニック
関連している	高速液体クロマトグラフィー 水性順相クロマトグラフィー イオン交換クロマトグラフィー ミセル液体クロマトグラフィー

サイズ排除クロマトグラフィーは、分子ふるいクロマトグラフィーとも呼ばれ、^[1]溶液中の分子をその形状、場合によってはサイズによって分離するクロマトグラフィー法である。^[2]これは通常、タンパク質や工業用ポリマーなどの大きな分子または高分子複合体に適用されます。^[3]通常、水溶液を使用してサンプルをカラムに通す場合、この技術はゲル濾過クロマトグラフィーと呼ばれ、有機溶媒を移動相として使用する場合はゲル浸透クロマトグラフィーと呼ばれます。クロマトグラフィーカラムには、通常デキストラン、アガロース、またはポリアクリルアミドポリマーで構成される微細な多孔質ビーズが詰められています。これらのビーズの細孔サイズを使用して、高分子の寸法を推定します。^{[1] SECは、ポリマーの良好な}モル質量分布(Mw) 結果を提供できるため、広く使用されているポリマー特性評価法です。

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、他のクロマトグラフィー技術とは根本的に異なり、相互作用ではなく分子サイズを分類するという単純な手順に基づいて分離が行われます。^[4]

サイズ排除クロマトグラフィーの主な用途はタンパク質やその他の水溶性ポリマーの分画であり、ゲル浸透クロマトグラフィーは有機可溶性ポリマーの分子量分布を分析するために使用されます。どちらの技術も、電界を使用して分子を電荷に応じてゲルに「引き込む」ゲル電気泳動と混同しないでください。溶質が細孔内に留まる時間は、細孔のサイズによって異なります。大きな溶質はより小さな体積にアクセスでき、その逆も同様です。したがって、小さな溶質は、大きな溶質と比較して、より長い時間細孔内に留まります。^[5]

サイズ排除クロマトグラフィーは天然有機物質の研究に広く利用されていますが、限界もあります。その限界の1つは、標準的な分子量マーカーが存在しないことです。^[6]そのため、結果を比較するものがありません。正確な分子量が必要な場合は、他の方法を使用する必要があります。

この方法の利点としては、最小量の溶出液で大きな分子を小さな分子から良好に分離できること、^[7]、分離する粒子の生物学的活性を維持しながら、ろ過プロセスを妨げることなくさまざまな溶液を適用できることなどが挙げられます。この技術は一般に、酸性度、塩基性度、電荷、特定の化合物に対する親和性など、他の特性によって分子をさらに分離する他の技術と組み合わせて使用​​されます。サイズ排除クロマトグラフィーでは、分離時間が短く明確に定義され、バンドが狭いため、感度が向上します。また、溶質が固定相と相互作用しないため、サンプルの損失もありません。

この実験方法のもう 1 つの利点は、特定のケースでは、化合物のおおよその分子量を決定できることです。化合物 (溶出液) の形状とサイズによって、化合物がゲル (固定相) とどのように相互作用するかが決まります。おおよその分子量を決定するには、対応する分子量を持つ化合物の溶出容量を取得し、「K _av」対「log(Mw)」のプロットを作成します。ここで、Mw は分子量です。このプロットは、目的の化合物の分子量を概算するために使用される較正曲線として機能します。V _eコンポーネントは、カラムのビーズに部分的にアクセスできる分子などの中間分子が溶出する容量を表します。また、V _{t は}、ビーズ間の総容量とビーズ内の容量の合計です。V _oコンポーネントは、最初に溶出する大きな分子が溶出する容量を表します。^{[8] [9]}欠点としては、例えば、クロマトグラムの時間スケールが短いため、限られた数のバンドしか収容できないこと、また、一般に、良好な分解能を得るには分子量に10%の差がなければならないことが挙げられる。^[7]${\displaystyle K_{av}=(V_{e}-V_{o})/(V_{t}-V_{o})}$

この技術は、1955年にロンドンのクイーン・シャーロット病院に勤務していたグラント・ヘンリー・レイスとコリン・R・ルースベンによって発明されました。^{[10] [11]}彼らは後にこの発明によりジョン・スコット賞を受賞しました。^[12]レイスとルースベンはマトリックスとしてデンプンゲルを使用していましたが、後にジャーカー・ポラスとパー・フロディンがデキストランゲルを導入しました。 ^[13]サイズ分画特性を持つ他のゲルには、アガロースとポリアクリルアミドがあります。これらの開発に関する短いレビューが掲載されています。^[14]

合成高分子を分画する試みもあったが、1964年にダウ・ケミカル社のJC・ムーアが、孔径を制御した架橋ポリスチレンをベースとしたゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）カラムの調製に関する研究を発表して以来、この分野の研究活動は急速に増加し始めた。 ^[15]適切な較正を行えば、GPCは合成高分子のモル質量とモル質量分布の情報を提供できることがすぐに認識された。後者の情報は他の方法では入手が困難であったため、GPCは急速に広く使用されるようになった。^[16]

SEC は主に、タンパク質やポリマーなどの大きな分子の分析に使用されます。SEC は、小さな分子を吸着剤(「固定相」) の細孔に閉じ込めることにより機能します。このプロセスは通常、カラム内で実行されます。カラムは通常、さまざまなサイズの細孔を含むミク​​ロン スケールのポリマー ビーズが密に詰まった中空のチューブで構成されています。これらの細孔は、表面のくぼみまたはビーズを通るチャネルである場合があります。溶液がカラムを下って移動すると、一部の粒子が細孔に入ります。大きな粒子は、多くの細孔に入ることができません。粒子が大きいほど、溶出が速くなります。大きな分子は、細孔に入るには大きすぎるため、単に細孔を通り過ぎます。したがって、大きな分子は小さな分子よりも速くカラムを通過します。つまり、分子が小さいほど、保持時間が長くなります。

SEC の要件の 1 つは、分析対象物が固定相の表面と相互作用しないことです。分析対象物間の溶出時間の差は、理想的には、固定相との化学的または静電的相互作用ではなく、分析対象物が進入できる溶質の体積のみに基づきます。したがって、固定相の細孔システムのすべての領域に浸透できる小さな分子は、全細孔体積と粒子間体積の合計に等しい体積に進入できます。この小さな分子は、遅く (分子が細孔体積と粒子間体積のすべて、つまりカラム体積の約 80% に浸透した後) に溶出します。もう一方の極端な場合、小さな細孔に浸透できない非常に大きな分子は、粒子間体積 (カラム体積の約 35%) にしか進入できず、この量の移動相が​​カラムを通過したときに早く溶出します。SEC の基本原理は、異なるサイズの粒子は異なる速度で固定相から溶出(濾過) されるというものです。これにより、粒子の溶液がサイズに基づいて分離されます。すべての粒子が同時にまたはほぼ同時にロードされた場合、同じサイズの粒子は一緒に溶出するはずです。

しかし、高分子の大きさにはさまざまな尺度（例えば、回転半径や流体力学的半径）があるため、SECの理論における基本的な問題は、異なる種類の分子を分離するための適切な分子サイズパラメータの選択であった。実験的に、Benoitと同僚は、いくつかの異なる鎖構造と化学組成について、溶出体積と力学ベースの分子サイズ（流体力学的体積）との間に優れた相関関係があることを発見した。^[17]流体力学的体積に基づいて観察された相関関係は、普遍的なSEC較正の基礎として受け入れられるようになった。

それでも、SECデータの解釈における、動的特性に基づくサイズである流体力学的体積の使用は、完全には理解されていません。^[18]これは、SECが通常、流体力学的要因が分離にほとんど影響を与えない低流量条件下で実行されるためです。実際、理論とコンピューターシミュレーションの両方で、熱力学的分離原理が想定されています。つまり、分離プロセスは、2つの相（間隙空間に位置する希薄バルク溶液相と、カラム充​​填材の細孔内に閉じ込められた溶液相）間の溶質高分子の平衡分布（分配）によって決定されます。この理論に基づいて、細孔内のポリマーの分配に関連するサイズパラメーターは、平均スパン寸法（線上への平均最大投影）であることが示されています。^[19]この問題は完全に解決されていませんが、平均スパン寸法と流体力学的体積は強く相関している可能性があります。

各サイズ排除カラムには、分離できる分子量の範囲があります。排除限界は、カラムの「動作」範囲の上限の分子量を定義し、分子が大きすぎて固定相に捕捉されない範囲です。範囲の下限は浸透限界によって定義され、固定相のすべての細孔を透過できるほど小さい分子の分子量を定義します。この分子量未満の分子はすべて非常に小さいため、単一のバンドとして溶出されます。^[7]

最後に集められた濾過溶液は溶出液と呼ばれます。空隙容積には媒体に入るには大きすぎる粒子も含まれ、溶媒容積はカラム容積と呼ばれます。

以下は、サイズ排除クロマトグラフィーにおける多孔質ゲルビーズに一般的に使用される材料である^[20]

現実の状況では、溶液中の粒子のサイズは一定ではなく、その結果、細孔によって妨げられるはずの粒子が、そのすぐそばを通り過ぎる可能性があります。また、固定相粒子は理想的には定義されておらず、粒子と細孔の両方のサイズが異なる場合があります。したがって、溶出曲線はガウス分布に似ています。固定相は粒子と望ましくない方法で相互作用し、保持時間に影響を与える可能性もありますが、カラム製造業者は不活性な固定相を使用してこの問題を最小限に抑えるよう細心の注意を払っています。

他のクロマトグラフィーと同様に、カラムの長さを長くすると分解能が向上し、カラムの直径を大きくするとカラム容量が増加します。最大の分解能を得るには、カラムの適切な充填が重要です。カラムが過剰に充填されると、ビーズの細孔が潰れ、分解能が低下します。カラムが不足すると、小さな種がアクセスできる固定相の相対表面積が減少し、それらの種が細孔に閉じ込められる時間が短くなります。アフィニティークロマトグラフィー技術とは異なり、カラムの上部にある溶媒ヘッドにより、サンプルがロード前に拡散して下流の溶出が広がるため、分解能が大幅に低下する可能性があります。

単純な手動カラムでは、溶出液は一定量（フラクションと呼ばれる）で収集されます。粒子のサイズが類似しているほど、同じフラクションに含まれる可能性が高くなり、個別に検出されません。より高度なカラムでは、溶出液を継続的に監視することでこの問題を克服しています。

収集された画分は、溶出した粒子の濃度を決定するために分光法で検査されることがよくあります。一般的な分光検出法は、屈折率(RI) と紫外線 (UV) です。分光的に類似した種を溶出する場合 (生物学的精製中など)、各画分の内容を識別するために他の技術が必要になる場合があります。また、RI、LALLS、多角度レーザー光散乱MALS、UV、および/または粘度測定を使用して、溶出液の流れを連続的に分析することもできます。

溶出容量 (Ve) は、分子の流体力学的容積の対数にほぼ比例して減少します。カラムは、多くの場合、4～5 個の標準サンプル (例: 分子量が既知の折り畳まれたタンパク質) と、チログロブリンなどの非常に大きな分子を含むサンプルを使用して較正され、空隙容量が決定されます。(ブルーデキストランは不均質で結果が変動する可能性があるため、Vo の決定には推奨されません) 標準の溶出容量は、チログロブリンの溶出容量 (Ve/Vo) で割られ、標準の分子量の対数に対してプロットされます。

一般的に、SEC は類似種をあまりよく識別しないため低分解能クロマトグラフィーと見なされ、そのため精製の最終ステップに留保されることが多い。この技術は、高分子相互作用を保存したままネイティブ溶液条件下で実行できるため、交換時間が遅い精製タンパク質の四次構造を決定できる。SEC は、流体力学的体積 (分子量ではない) を測定するため、タンパク質の三次構造も分析でき、同じタンパク質の折り畳まれたバージョンと折り畳まれていないバージョンを区別することができる。たとえば、典型的なタンパク質ドメインの見かけの流体力学的半径は、折り畳まれた形式と折り畳まれていない形式でそれぞれ 14 Å と 36 Å である可能性がある。SEC では、折り畳まれた形式はサイズが小さいためかなり遅く溶出するため、これら 2 つの形式を分離できる。

SEC は、合成ポリマーのサイズと多分散性の両方の尺度として使用できます。つまり、ポリマー分子のサイズの分布を見つける機能です。既知のサイズの標準を事前に実行しておけば、分析用に選択した溶媒 (多くの場合THF ) 内の対象のポリマー分子のサイズを決定するための較正曲線を作成できます。別の方法として、光散乱や粘度測定などの技術をSEC でオンラインで使用して、既知の分子量の標準による較正に依存しない絶対分子量を得ることができます。分子量が同じ 2 つのポリマーでもサイズが異なるため、一般には絶対測定法の方が望ましいです。一般的な SEC システムを使用すると、サンプルのサイズと多分散性に関する情報をポリマー化学者にすばやく (約 30 分で) 提供できます。分取 SEC は、分析規模でのポリマー分画に使用できます。

SECでは、質量ではなくポリマー分子の流体力学的体積、つまり特定のポリマー分子が溶液中にあるときに占める空間の大きさが測定されます。しかし、ポリスチレンの分子量と流体力学的体積の正確な関係がわかるため、SECデータからおおよその分子量を計算することができます。このために、ポリスチレンが標準として使用されます。しかし、流体力学的体積と分子量の関係はすべてのポリマーで同じではないため、おおよその測定値しか得られません。^[21] もう1つの欠点は、固定相と分析対象物との相互作用の可能性があることです。相互作用があると溶出時間が遅くなり、分析対象物のサイズが小さくなるように見えます。

この方法を実行すると、溶出分子のバンドが広がる可能性があります。これは、移動相分子が固定相分子を通過する流れによって引き起こされる乱流によって発生する可能性があります。さらに、分子の熱拡散とガラス壁の分子と溶出液分子間の摩擦がバンドの広がりに寄与します。バンドが広がるだけでなく、バ​​ンドは互いに重なり合います。その結果、溶出液は通常かなり希釈されます。バンドが広がる可能性を防ぐために、いくつかの予防策を講じることができます。たとえば、サンプルをカラムの上部に狭く高濃度のバンドで適用することができます。溶出液が濃縮されているほど、手順は効率的になります。ただし、溶出液を濃縮することが常に可能であるとは限らず、これがもう 1 つの欠点と考えられます。^[9]

絶対サイズ排除クロマトグラフィー（ASEC）は、光散乱装置（最も一般的なものは多角光散乱（MALS）または他の形式の静的光散乱（SLS）であるが、動的光散乱（DLS）装置の場合もある）をサイズ排除クロマトグラフィーシステムに接続し、クロマトグラフィーシステムから溶出するタンパク質および高分子の絶対モル質量および/またはサイズを測定する技術である。^[22]

この場合の「絶対」の定義は、一連の参照標準を用いたカラムの保持時間の較正が、モル質量または流体力学的サイズ（流体力学的直径（単位nmのD _H）と呼ばれることが多い）を取得するのに必要ないということです。標準に対する保持時間を調整する静電的または疎水性表面相互作用などの非理想的なカラム相互作用は、最終結果に影響を与えません。同様に、分析対象物と標準の立体配座の違いは絶対測定に影響を与えません。たとえば、MALS分析では、本質的に無秩序なタンパク質のモル質量は、同じモル質量の球状タンパク質よりもはるかに早く溶出する場合でも正確に特徴付けられ、同じモル質量の線状参照標準と比較して遅く溶出する分岐ポリマーについても同様です。^{[22] [23] [24]} ASECのもう1つの利点は、モル質量および/またはサイズが溶出ピークの各ポイントで決定され、したがってピーク内の均一性または多分散性を示すことです。たとえば、単分散タンパク質の SEC-MALS 分析では、ピーク全体が同じモル質量を持つ分子で構成されていることが示されますが、これは標準的な SEC 分析では不可能です。

SLS によるモル質量の測定には、光散乱測定と濃度測定を組み合わせる必要があります。したがって、SEC-MALS には通常、光散乱検出器と示差屈折計または UV/Vis 吸光度検出器のいずれかが含まれます。さらに、MALS は、特定のサイズ制限 (通常 10 nm) を超える分子のrms 半径 R _{gを測定します。したがって、SEC-MALS は、モル質量と R g}の関係を介してポリマーの立体配座を分析できます。より小さな分子の場合、DLS またはより一般的には示差粘度計のいずれかを追加して流体力学的半径を決定し、同じ方法で分子の立体配座を評価します。

SEC-DLS では、高分子のサイズは、サイズ排除カラム セットから DLS 機器のフロー セルに溶出するときに測定されます。分子または粒子の流体力学的サイズが測定され、分子量は測定されません。タンパク質の場合、Mark-Houwink タイプの計算を使用して、流体力学的サイズから分子量を推定できます。

SECと組み合わせたDLSの主な利点は、DLS分解能が向上することです。^[25]バッチDLSは迅速かつ簡単で、平均サイズを直接測定できますが、DLSのベースライン分解能は直径の3:1の比率です。SECを使用すると、タンパク質とタンパク質オリゴマーが分離され、オリゴマーの分解能が可能になります。凝集体研究もASECを使用して行うことができます。凝集体濃度は光散乱では計算できないかもしれませんが（SEC-MALSでモル質量測定に使用されるようなオンライン濃度検出器も凝集体濃度を決定します）、凝集体のサイズは、SECカラムから溶出する最大サイズによってのみ制限されます。

DLS 検出による ASEC の制限には、流量、濃度、精度などがあります。相関関数が適切に構築されるには 3 ～ 7 秒かかるため、ピーク全体で収集できるデータ ポイントの数は限られています。SLS 検出による ASEC は流量によって制限されず、測定時間は基本的に瞬時で、濃度の範囲は DLS よりも数桁広くなります。ただし、SEC-MALS によるモル質量分析には正確な濃度測定が必要です。SEC による分離後のより包括的な絶対分析のために、MALS 検出器と DLS 検出器は 1 つの機器に統合されることがよくあります。

• PEG化
• ゲル浸透クロマトグラフィー
• タンパク質精製