イオンクロマトグラフィー

イオンクロマトグラフィー（またはイオン交換クロマトグラフィー）は、イオン交換体に対する親和性に基づいてイオンとイオン化可能な極性分子を分離するクロマトグラフィーの一種です。^[1]これは、小さな無機陰イオン、^[2]大きなタンパク質、^[3]小さなヌクレオチド、^[4]アミノ酸など、ほぼすべての種類の荷電分子に作用します。ただし、イオンクロマトグラフィーは、タンパク質の等電点から1 pH単位離れた条件で行う必要があります。 ^[5]

イオンクロマトグラフィーには、陰イオン交換と陽イオン交換の 2 種類があります。陽イオン交換クロマトグラフィーは、対象分子が正に帯電している場合に使用されます。分子が正に帯電するのは、クロマトグラフィーの pH が pI (pH(I) とも呼ばれる) よりも低いためです。^[6]このタイプのクロマトグラフィーでは、固定相が負に帯電しており、正に帯電した分子が引き付けられるようにロードされます。陰イオン交換クロマトグラフィーは、固定相が正に帯電しており、負に帯電した分子 (クロマトグラフィーの pH が pI よりも高いことを意味します) が引き付けられるようにロードされる場合です。^{[7]これは、タンパク質の精製、水分析、 [8] [9]}および品質管理でよく使用されます。タンパク質、アミノ酸、ペプチドなどの水溶性の帯電分子は、不溶性の固定相とイオン結合を形成することにより、反対に帯電した部分に結合します。 ^[10]平衡化された固定相は、分離および定量化される混合物の標的分子がカラムを通過する際に結合できるイオン化可能な官能基で構成されており、陽イオン固定相は陰イオンを分離するために使用され、陰イオン固定相は陽イオンを分離するために使用されます。分離する目的の分子が陽イオンである場合は陽イオン交換クロマトグラフィーが使用され、陰イオンを分離するには陰イオン交換クロマトグラフィーが使用されます。^[11]次に、結合した分子は、陰イオンと陽イオンを含む溶出液を使用して、カラムに高濃度のイオンを流すか、カラムの pHを変更することによって溶出および収集できます。

イオンクロマトグラフィーを使用する主な利点の 1 つは、他の分離技術とは異なり、分離に関与する相互作用が 1 つだけであることです。そのため、イオンクロマトグラフィーはマトリックス耐性が高くなります。イオン交換のもう 1 つの利点は、溶出パターンが予測可能であることです (イオン化可能な基の存在に基づく)。^[12]たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用すると、特定の陽イオンが最初に溶出し、他の陽イオンは後で溶出します。局所的な電荷バランスは常に維持されます。ただし、イオン交換クロマトグラフィーを実行する際には、技術が絶えず進化し、カラム間で一貫性がなくなるなどの欠点もあります。^[13]この精製技術の主な制限は、イオン化可能な基に限定されていることです。^[6]

イオンクロマトグラフィーは、長年にわたる知識の蓄積を通じて進歩してきました。1947 年以降、Spedding と Powell は、希土類元素の分離に置換イオン交換クロマトグラフィーを使用しました。さらに、彼らはアンモニア中の 14N および 15N 同位体のイオン交換分離を示しました。1950 年代初頭、Kraus と Nelson は、陰イオンクロマトグラフィーによる塩化物、フッ化物、硝酸塩、または硫酸塩の錯体の分離に依存する金属イオンの多くの分析方法の使用を実証しました。1960 年から 1980 年にかけて、自動インライン検出と、金属イオン分離のための新しいクロマトグラフィー方法が徐々に導入されました。Dow Chemical Co. の Small、Stevens、Bauman による画期的な方法により、現代のイオンクロマトグラフィーが誕生しました。陰イオンと陽イオンは、抑制された導電率検出システムによって効率的に分離できるようになりました。 1979年に、Gjerdeらは非抑制導電率検出を用いた陰イオンクロマトグラフィーの方法を導入した。それに続いて1980年には陽イオンクロマトグラフィーの同様の方法が導入された。^[14]

その結果、IC市場内では、サプレッサー型と非サプレッサー型の両方の導電率検出を支持する激しい競争の時代が始まりました。この競争により、新しい形態が急速に成長し、ICが急速に進化しました。^[15] ICの将来の開発で克服する必要がある課題は、高効率のモノリシックイオン交換カラムの準備であり、この課題を克服することはICの開発にとって非常に重要です。^[16]

イオン交換クロマトグラフィーのブームは、主に第二次世界大戦中の1935年から1950年の間に始まり、「マンハッタン計画」を通じてICの応用が大幅に拡大しました。イオンクロマトグラフィーは、もともと農学者のサー・トンプソンと化学者のJTウェイという2人のイギリス人研究者によって導入されました。トンプソンとウェイの研究には、水溶性肥料塩である硫酸アンモニウムと塩化カリウムの作用が含まれていました。これらの塩は雨のために地面から簡単に抽出できませんでした。彼らはイオン法を実行して粘土を塩で処理し、カルシウムの放出に加えてアンモニアの抽出をもたらしました。^{[17] [信頼できない情報源? ]} ICのさらなる理解のために理論モデルが開発されたのは1950年代と1960年代であり、連続検出器が利用されるようになったのは1970年代になってからで、低圧クロマトグラフィーから高性能クロマトグラフィーへの発展への道が開かれました。 1975 年になって初めて「イオンクロマトグラフィー」という名称が技術を指すものとして確立され、その後マーケティング目的の名称として使用されるようになりました。今日、IC は飲料水などの水性システムの調査に重要です。これは、環境関連の問題を解決するのに役立つ陰イオン元素または複合体を分析するための一般的な方法です。同様に、半導体業界でも大きな用途があります。^[18]

分離カラム、溶出システム、検出器が豊富に利用できることから、クロマトグラフィーはイオン分析の主な方法へと発展しました。^[19]

この技術が最初に開発されたとき、それは主に水処理に使用されていました。1935年以来、イオン交換クロマトグラフィーは急速に最も活用される技術の1つとなり、その原理は蒸留、吸着、ろ過を含む化学のほとんどの分野に適用されるようになりました。^[20]

イオン交換クロマトグラフィーは、それぞれの荷電基に基づいて分子を分離します。イオン交換クロマトグラフィーは、クーロン（イオン）相互作用に基づいて分析対象分子をカラム上に保持します。イオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、正と負に帯電したイオンで構成されています。 ^[21]基本的に、分子は固定相マトリックス上で反対の電荷と静電相互作用します。固定相は、荷電したイオン化可能な官能基またはリガンドを含む固定相マトリックスで構成されています。^[22]固定相表面には、反対の電荷を持つ分析対象イオンと相互作用するイオン性官能基（RX）が表示されます。電気的に中性になるように、これらの固定電荷は溶液中の交換可能な対イオンと結合します。精製されるイオン化可能な分子は、固定相上の固定電荷に結合するために、これらの交換可能な対イオンと競合します。これらのイオン化可能な分子は、その電荷に基づいて保持または溶出されます。最初は、固定相に結合しないか、結合が弱い分子が最初に洗い流されます。固定相に結合する分子を溶出するには、条件を変える必要がある。分子と結合を競う交換可能な対イオンの濃度を高めるか、pH を変えて溶出液または溶質のイオン電荷に影響を与えることができる。pH の変化は特定の分子の電荷に影響を与え、したがってそれらの結合を変える。溶質の分子の正味電荷が減少すると、それらは溶出を開始する。このように、そのような調整を使用して目的のタンパク質を放出することができる。さらに、対イオンの濃度を徐々に変化させてイオン化分子の保持に影響を与え、それらを分離することができる。このタイプの溶出はグラジエント溶出と呼ばれる。一方、対イオンの濃度を段階的に変化させるステップ溶出を使用することもできる。^{[5]このタイプのクロマトグラフィーは、さらに}陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーに細分される。正に帯電した分子は陽イオン交換樹脂に結合し、負に帯電した分子は陰イオン交換樹脂に結合します。^[23]陽イオン種M+と陰イオン種B−からなるイオン化合物は固定相によって保持される。

陽イオン交換クロマトグラフィーでは、固定相が負に帯電した官能基を示すため、 正に帯電した陽イオンが保持されます。

${\displaystyle {\text{RX}}^{-}{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}}^{-}\rightleftarrows \,{\text{RX}}^{-}{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{B}}^{-}}$

陰イオン交換クロマトグラフィーは、正に帯電した官能基を使用して陰イオンを保持します。

${\displaystyle {\text{RX}}^{+}{\text{A}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}}^{-}\rightleftarrows \,{\text{RX}}^{+}{\text{B}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{A}}^{-}}$

移動相中の C+ または A- のイオン強度を調整して平衡位置をシフトし、保持時間をシフトできることに注意してください。

イオンクロマトグラムは、陰イオン交換カラムで得られた典型的なクロマトグラムを示しています。

イオン交換クロマトグラフィーを開始する前に、平衡化する必要があります。固定相は、実験に応じて特定の要件に平衡化する必要があります。平衡化されると、固定相の荷電イオンは、Cl ^-や Na ⁺などの反対の荷電交換イオンに付着します。次に、目的のタンパク質が結合できるバッファーを選択する必要があります。平衡化後、カラムを洗浄する必要があります。洗浄相は、マトリックスに結合しないすべての不純物を溶出するのに役立ちますが、目的のタンパク質は結合したままです。このサンプルバッファーは、目的のタンパク質を結合させるために、平衡化に使用したバッファーと同じ pH である必要があります。荷電していないタンパク質は、バッファーがカラムを流れるのと同じ速度でカラムから溶出され、保持されません。サンプルがカラムにロードされ、カラムがバッファーで洗浄されて不要なタンパク質がすべて溶出されたら、マトリックスに結合している目的のタンパク質を溶出するために特定の条件で溶出が行われます。結合したタンパク質は、直線的に増加する塩濃度の勾配を利用して溶出されます。緩衝液のイオン強度が増加すると、塩イオンは目的のタンパク質と競合し、媒体の表面の荷電基に結合します。これにより、目的のタンパク質がカラムから溶出されます。塩濃度が増加してイオン強度が増加すると、正味電荷の低いタンパク質が最初に溶出されます。正味電荷の高いタンパク質をカラムから溶出するには、より高いイオン強度が必要になります。^[21]

イオン交換クロマトグラフィーは、バルクで、ガラスやプラスチックのプレートなどの媒体の薄い層に目的の固定相の層をコーティングした上で、またはクロマトグラフィーカラムで実行できます。薄層クロマトグラフィーとカラムクロマトグラフィーは、どちらも同じ支配原理に従って動作するという点で類似点があります。つまり、移動相が固定相に沿って移動すると、分子が絶えず頻繁に交換されます。交換カラムの所定の条件は、移動相と固定相の間に強い相互作用が生じるように選択されているため、サンプルを微量で追加する必要はありません。さらに、溶出プロセスのメカニズムにより、それぞれの化学的特性に基づいて異なる分子が区画化されます。この現象は、カラムの上部またはその付近で塩濃度が上昇し、その位置にある分子が移動するためです。一方、より低い位置で結合した分子は、より高い塩濃度がその領域に到達したときに後で解放されます。これらの原理により、イオン交換クロマトグラフィーは、開始容量が大きいにもかかわらず、少量のターゲット分子を迅速に生成できるため、複雑な精製手順の最初のクロマトグラフィーステップに最適な候補となります。^[6]

比較的単純な装置が、クロマトグラフィーカラムに増加する勾配の対イオンを適用するためによく使用されます。銅（II）などの対イオンは、複合体形成を通じてペプチドとアミノ酸を効果的に分離するために最もよく選択されます。^[24]

簡単な装置を使用して塩勾配を作成できます。溶出バッファーはチャンバーから混合チャンバーに継続的に引き込まれ、バッファー濃度が変化します。通常、チャンバーに入れられるバッファーは初期濃度が高いのに対し、撹拌チャンバーに入れられるバッファーは低濃度です。左チャンバーからの高濃度バッファーが混合されてカラムに引き込まれると、撹拌カラムのバッファー濃度は徐々に増加します。撹拌チャンバーと限界バッファーの形状を変更することで、凹型、直線型、凸型の対イオン勾配を作成できます。

固定相にはさまざまな媒体が使用されています。最も一般的に使用される固定化荷電基には、トリメチルアミノエチル（TAM）、トリエチルアミノエチル（TEAE）、ジエチル-2-ヒドロキシプロピルアミノエチル（QAE）、アミノエチル（AE）、ジエチルアミノエチル（DEAE）、スルホ（S）、スルホメチル（SM）、スルホプロピル（SP）、カルボキシ（C）、カルボキシメチル（CM）などがあります。^[5]

カラムの充填が成功することは、イオンクロマトグラフィーの重要な側面です。最終的なカラムの安定性と効率は、充填方法、使用する溶媒、およびカラムの機械的特性に影響を与える要因に依存します。初期の非効率的なドライ充填方法とは対照的に、適切な溶媒に懸濁した粒子を圧力下でカラムに送り込むウェットスラリー充填は、大幅な改善を示しています。ウェットスラリー充填を実行するには、バランス密度法（溶媒の密度が多孔質シリカ粒子の密度とほぼ同じ）、高粘度法（高粘度の溶媒を使用）、および低粘度スラリー法（低粘度溶媒で実行）の3つの異なるアプローチを採用できます。^[25]

ポリスチレンはイオン交換の媒体として使用される。これは、ジビニルベンゼンと過酸化ベンゾイルを使用してスチレンを重合して作られる。このような交換体は、タンパク質と不可逆な疎水性相互作用を形成する。この特性のため、ポリスチレンイオン交換体はタンパク質の分離には適していない。一方、アミノ酸の分離や水からの塩の除去における小分子の分離には使用される。大きな細孔を持つポリスチレンイオン交換体はタンパク質の分離に使用できるが、親水性物質でコーティングする必要がある。^[26]

セルロースベースの媒体は大きな細孔を持つため、大きな分子の分離に使用できます。この媒体ではタンパク質の結合が高く、疎水性は低いです。DEAEは、セルロースまたはセファデックスに結合したジエチルアミノエチルの正の側鎖から生成される陰イオン交換マトリックスです。^[27]

アガロースゲルベースの培地にも大きな細孔がありますが、デキストランと比較すると置換能力は低いです。培地が液体中で膨潤する能力は、これらの物質の架橋、使用される緩衝液のpHおよびイオン濃度に基づいています。^[26]

高温高圧の導入により、イオンクロマトグラフィーの効率が大幅に向上し、時間の短縮も実現します。温度は保持特性に影響を与えるため、選択性に影響を及ぼします。保持係数（k =（t _R ^g − t _M ^g）/（t _M ^g − t _ext））は、小さなイオンでは温度とともに増加し、大きなイオンでは逆の傾向が見られます。^{[28] [29]}

異なる媒体におけるイオン選択性にもかかわらず、40～175℃の範囲でイオン交換クロマトグラフィーを行うためのさらなる研究が行われている。^[30]

溶媒中でのカラム粒子の挙動を観察することで、適切な溶媒を選択することができます。光学顕微鏡を使用すれば、スラリーの望ましい分散状態と凝集粒子を容易に区別することができます。^[25]

「強い」イオン交換体は、カラムが平衡状態になるとマトリックス上の電荷を失わないため、幅広い pH バッファーを使用できます。「弱い」イオン交換体は、電荷を維持する pH 値の範囲を持っています。弱イオン交換カラムに使用されるバッファーの pH がマトリックスの容量範囲外になると、カラムは電荷分布を失い、目的の分子が失われる可能性があります。^[31]弱イオン交換体の pH 範囲は狭いものの、特異性が高いため、強イオン交換体よりもよく使用されます。一部の実験では、弱イオン交換体の保持時間は、高い特異性で必要なデータを取得するのにちょうど十分な長さです。^[32]

イオン交換カラムの樹脂（ビーズと呼ばれることが多い）には、弱酸/強酸や弱塩基/強塩基などの官能基が含まれている場合があります。また、陽イオンと陰イオンの両方を交換できる両性官能基を持つ樹脂を含む特殊なカラムもあります。^[33]強イオン交換樹脂の官能基の例としては、陰イオン交換体である第四級アンモニウム陽イオン（Q）や、陽イオン交換体であるスルホン酸（S、-SO _{2 OH）などがあります。} ^[34]これらのタイプの交換体は、pH範囲0～14で電荷密度を維持できます。弱イオン交換樹脂の官能基の例としては、陰イオン交換体であるジエチルアミノエチル（DEAE、-C ₂ H ₄ N（C ₂ H ₅）₂）や、陽イオン交換体であるカルボキシメチル（CM、-CH ₂ -COOH）^[35]などがあります。これら2種類の交換器は、pH 5～9の範囲でカラムの電荷密度を維持できます。^{[引用が必要]}

イオンクロマトグラフィーでは、溶質イオンと固定相の相互作用は電荷に基づいており、どのイオンがどの程度結合するかを決定します。固定相に陰イオンを引き付ける正の基がある場合、それは陰イオン交換体と呼ばれます。固定相に負の基がある場合、陽イオンが引き付けられ、それは陽イオン交換体です。^[36]イオンと固定相の間の引力は、イオン交換体として使用される樹脂、有機粒子によっても異なります。

各樹脂は、固定相上の樹脂基に結合するために競合する溶質イオンに基づいて変化する相対的な選択性を備えています。平衡定数に相当する選択係数は、樹脂と各イオンの濃度比によって決定されますが、一般的な傾向として、イオン交換体は、より高い電荷、より小さな水和半径、およびより高い分極率、またはイオンの電子雲が他の電荷によって破壊される能力を持つイオンに結合することを好みます。^[37]この選択性にもかかわらず、選択性の低いイオンがカラムに過剰に導入されると、選択係数によってイオン交換クロマトグラフィー中に発生する結合反応が変動するため、より少ないイオンが固定相に多く結合することになります。

次の表は、一般的に使用されているイオン交換体を示している^[38]

サンプルは、手動またはオートサンプラーを使用して、既知量のサンプル ループに導入されます。移動相と呼ばれる緩衝水溶液が、サンプルをループから、何らかの固定相物質を含むカラムに運びます。これは通常、共有結合した荷電官能基を持つアガロースまたはセルロースビーズからなる樹脂またはゲル マトリックスです。カラムの目的の電荷を得るには、固定相の平衡化が必要です。カラムが適切に平衡化されていない場合、目的の分子がカラムに強く結合しない可能性があります。ターゲット分析物 (アニオンまたはカチオン) は固定相に保持されますが、同様に荷電した種の濃度を上げて分析物イオンを固定相から置換することで溶出できます。たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、正に荷電した分析物は、正に荷電したナトリウム イオンを追加することで置換できます。次に、目的の分析物を何らかの方法、通常は導電率または UV/可視光吸光度で検出する必要があります。

IC システムを制御するには通常、クロマトグラフィー データ システム(CDS) が必要です。IC システムに加えて、これらの CDS の一部はガスクロマトグラフィー(GC) や HPLC も制御できます。

イオン交換クロマトグラフィーの一種である膜交換^{[39] [40]}は、ビーズを詰めたカラムを使用する際の制限を克服するために設計された比較的新しい精製方法です。膜クロマトグラフィー^{[41] [42]}装置は、メンテナンスと再検証の時間を必要とする他のクロマトグラフィー装置とは異なり、大量生産が安価で使い捨てです。物質を分離する際に通常使用される膜吸収体には、フラットシート、中空糸、ラジアルフローの3種類があります。最も一般的な吸収体であり、膜クロマトグラフィーに最適なのは、吸収体積が大きいため複数のフラットシートです。これは、質量移動の制限^[43]と圧力降下^[44]を克服するために使用できるため、ウイルス、プラスミドDNA、その他の大きな高分子の分離と精製に特に有利です。カラムには、標的タンパク質と結合できる吸着部分を含む内部孔を持つ微多孔膜が詰められています。吸着膜は様々な形状と化学的性質で利用可能であり、ビーズを使用する場合の10倍の効率で精製、分画、濃縮、清澄化に使用できます。^[45]膜は膜自体を分離することによって準備することができ、膜を正方形に切断して固定化します。より最近の方法では、支持膜に付着した生細胞を使用し、シグナル伝達分子の識別と清澄化に使用します。^[46]

イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質が荷電官能基を含むため、タンパク質の分離に使用できます。 目的のイオン (この場合は荷電タンパク質) は、荷電固体支持体上で別のイオン (通常は H ⁺ ) と交換されます。 溶質は、通常、液相 (水であることが多い) にあります。 たとえば、水中のタンパク質を考えてみましょう。これは、カラムを通過する液相です。 カラムは、特定の電荷を持つ多孔質合成粒子で満たされているため、一般に固相と呼ばれます。 これらの多孔質粒子はビーズとも呼ばれ、アミノ化 (アミノ基を含む) されているか、電荷を持つために金属イオンを持っています。 カラムは多孔質ポリマーを使用して準備できます。質量が 100 000 Da を超える高分子の場合、多孔質粒子の最適なサイズは約 1 μm ²です。 これは、細孔内での溶質の拡散が遅いため、分離品質が制限されないためです。^[47]負に帯電したタンパク質を引き付ける正に帯電した基を含むビーズは、一般にアニオン交換樹脂と呼ばれます。 pH 7（水のpH）で負に帯電した側鎖を持つアミノ酸はグルタミン酸とアスパラギン酸です。負に帯電したビーズは陽イオン交換樹脂と呼ばれ、正に帯電したタンパク質が引き寄せられます。pH 7で正に帯電した側鎖を持つアミノ酸はリジン、ヒスチジン、アルギニンです。^[48]

等電点とは、化合物（この場合はタンパク質）が正味電荷を持たない pH です。タンパク質の等電点または PI は、側鎖の pKa を使用して決定できます。アミノ（正鎖）がカルボキシル（負鎖）を打ち消すことができる場合、タンパク質は PI になります。pH 7 で電荷を持たないタンパク質には、水の代わりにバッファーを使用することをお勧めします。これにより、pH を操作してタンパク質とビーズ間のイオン相互作用を変更できるためです。^[49]弱酸性または塩基性側鎖は、pH が十分に高いか低い場合に電荷を持つことができます。分離は、タンパク質の自然な等電点に基づいて行うことができます。または、ペプチドタグをタンパク質に遺伝的に追加して、ほとんどの天然タンパク質とは異なる等電点をタンパク質に与えることができます（たとえば、陽イオン交換樹脂に結合する場合は 6 つのアルギニン、DEAE セファロースなどの陰イオン交換樹脂に結合する場合は 6 つのグルタミン酸）。

移動相のイオン強度の増加による溶出は、より微妙です。これは、移動相からのイオンが固定相上の固定化イオンと相互作用し、固定相をタンパク質から「保護」して、タンパク質を溶出させるため機能します。

イオン交換カラムからの溶出は、単一電荷の変化に敏感である可能性がある（クロマトフォーカシング）。イオン交換クロマトグラフィーは、特定の多量体タンパク質アセンブリの分離にも有用であり、荷電ペプチドタグの数と位置に応じて特定の複合体を精製することができる。^{[50] [51]}

イオン交換クロマトグラフィーでは、適用された緩衝液とイオン交換体のpHが1pH単位まで異なる場合にギブス・ドナン効果が観察されます。たとえば、陰イオン交換カラムでは、イオン交換体がプロトンを反発するため、カラム付近の緩衝液のpHは残りの溶媒よりも高くなります。 ^[52]その結果、実験者は、対象のタンパク質が「実際の」pHで安定し、適切に帯電していることに注意する必要があります。

この効果は、樹脂と溶液からそれぞれ1つずつ、同じように帯電した2つの粒子が、両側に適切に分配されないために生じ、一方のイオンが他方のイオンよりも選択的に吸収される。^{[53] [54]}たとえば、陽イオン交換樹脂であるスルホン化ポリスチレン樹脂では、塩酸緩衝液の塩素イオンが樹脂と平衡になるはずである。しかし、樹脂中のスルホン酸の濃度が高いため、HClの水素はカラムに入りにくい。これと電気的中性の必要性が相まって、樹脂に入る水素と塩素の量は最小限に抑えられる。^[54]

イオンクロマトグラフィーの用途は、銀化クロマトグラフィーに見られます。^[要出典]通常、銀とアセチレン結合およびエチレン結合を含む化合物は、非常に弱い相互作用を示します。この現象は、オレフィン化合物で広くテストされています。オレフィンが銀イオンと作るイオン錯体は弱く、π、σ、d軌道の重なりに基づいて作られ、利用可能な電子は二重結合に実際の変化を引き起こしません。この動作は、銀イオンを使用して混合物から脂質、主に脂肪酸を二重結合の数が異なる画分に分離するために操作されました。イオン樹脂に銀イオンを含浸させ、さまざまな酸（ケイ酸）にさらして、異なる特性の脂肪酸を溶出させました。

アルカリ金属イオンの検出限界は1μMまで低下します。^[55] HbA1c、ポルフィリンの測定や浄水に 使用できます。イオン交換樹脂（IER）は、その高い容量と分離プロセスの単純なシステムにより、特に医薬品で広く使用されています。合成用途の1つは、イオン交換樹脂を腎臓透析に使用することです。この方法は、セルロース膜人工腎臓を使用して血液成分を分離するために使用されます。^[56]

イオンクロマトグラフィーのもう一つの臨床応用は、クレアチンキナーゼ（CK）アイソザイムをヒト血清および剖検材料由来の組織（主に心筋や脳などのCKに富む組織が使用された）から分離するために使用される高速陰イオン交換クロマトグラフィー技術である。^[要出典]これらのアイソザイムにはMM、MB、BBが含まれ、これらはすべて異なるアミノ酸配列で同じ機能を果たす。これらのアイソザイムの機能は、ATPを使用してクレアチンをリン酸クレアチンに変換し、ADPを排出することです。ミニカラムにDEAE-Sephadex A-50を充填し、さらにさまざまな濃度のトリス緩衝液塩化ナトリウムで溶出しました（各濃度は溶出を操作するために有利に選択されました）。ヒト組織抽出物を分離のためにカラムに挿入しました。すべての画分を分析して総CK活性を確認したところ、CKアイソザイムの各ソースには特徴的なアイソザイムが含まれていることがわかりました。まず、CK-MM が溶出され、次に CK-MB、そして CK-BB が溶出されました。したがって、各サンプルで検出されたアイソザイムは組織特異的であるため、その発生源を特定するために使用できます。

結果の情報を使用して、患者の診断と最も豊富な活性が見られる CK アイソザイムの種類との相関関係を作成できます。調査結果によると、心臓発作 (心筋梗塞) を患った 71 人の患者のうち約 35 人が、CK-MM および CK-MB アイソザイムを豊富に含んでいました。さらに、腎不全、脳血管疾患、肺疾患など、他の多くの診断では、CK-MM アイソザイムのみが検出され、他のアイソザイムは検出されなかったことが調査結果から明らかになりました。この調査結果は、さまざまな疾患と検出された CK アイソザイムとの相関関係を示しており、さまざまな技術を使用した以前のテスト結果を裏付けています。この調査とイオンクロマトグラフィーの応用以来、心臓発作の患者に見られる CK-MB に関する研究は拡大しています。

1975 年以来、イオンクロマトグラフィーは多くの産業分野で広く使用されています。主な利点は、信頼性、非常に優れた精度と精密さ、高い選択性、高速性、高い分離効率、および消耗品の低コストです。イオンクロマトグラフィーに関連する最も重要な開発は、新しいサンプル調製方法、分析対象物の分離の速度と選択性の向上、検出限界と定量限界の低下、アプリケーションの範囲の拡大、新しい標準方法の開発、小型化、および新しい物質グループの分析範囲の拡大です。電気めっき浴の電解質と独自の添加剤の定量テストが可能になります。^{[57]これは、定性的な}ハルセルテストまたは精度の低い UV テストの進歩です。イオン、触媒、光沢剤、および促進剤を測定できます。 ^[57]イオン交換クロマトグラフィーは、徐々に、アニオン種とカチオン種の両方を検出するための広く知られた普遍的な技術になりました。このような目的のアプリケーションは、さまざまな関心分野、特に製薬業界で開発されているか、開発中です。近年、医薬品におけるイオン交換クロマトグラフィーの使用が増加しており、2006 年には、イオン交換クロマトグラフィーに関する章が米国薬局方- 国家処方集 (USP-NF) に正式に追加されました。さらに、2009 年の USP-NF リリースでは、米国薬局方は、導電率検出とパルス アンペロメトリック検出の 2 つの技術を使用して、イオンクロマトグラフィーのいくつかの分析を可能にしました。これらのアプリケーションの大部分は、主に医薬品の残留限界を測定および分析するために使用され、シュウ酸塩、ヨウ化物、硫酸塩、スルファミン酸、リン酸塩、およびカリウムやナトリウムなどのさまざまな電解質の限界を検出します。合計で、USP-NF の 2009 年版では、導電率検出またはパルス アンペロメトリック検出のいずれかを使用して、活性化合物または活性化合物の成分を分析するための 28 の検出方法が正式にリリースされました。^[58]

医薬品の分析における IC の応用に対する関心が高まっています。IC は、製品開発や品質管理試験のさまざまな側面で使用されています。たとえば、IC は、医薬品有効成分分子の安定性と溶解性を改善するために使用されるほか、有機溶媒に対する耐性が高いシステムを検出するためにも使用されます。IC は、溶解試験の一環として分析対象物の測定に使用されています。たとえば、カルシウム溶解試験では、媒体中に存在する他のイオンが、それら自身とカルシウムイオンから十分に分離できることが示されています。したがって、IC は、時間の経過に伴う溶解量を測定するために、錠剤やカプセルの形の医薬品に使用されています。^[59] IC は、医薬品製剤に使用される賦形剤または不活性成分の検出と定量にも広く使用されています。このような製剤中の糖と糖アルコールの検出は、これらの極性基がイオンカラムで分離されるため、IC によって行われています。IC 法は、薬物物質および製品中の不純物の分析でも確立されています。不純物や薬物の化学物質の一部ではない成分が評価され、患者に1日に投与すべき薬物の最大量と最小量についての洞察が得られます。^[60]

• 陰イオン交換クロマトグラフィー
• クロマトフォーカシング
• 高速液体クロマトグラフィー
• 等電点

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