置換クロマトグラフィー

置換クロマトグラフィーは、サンプルをカラムの先端に置き^{[n 1] 、元の混合物の成分よりも強く吸着する}溶質で置換するクロマトグラフィー技術です。その結果、成分は溶媒で分離された「ピーク」ではなく、高濃度の純粋な物質の連続した「長方形」ゾーンに分解されます。^[1]これは主に分取技術であり、他のクロマトグラフィーモードと比較して、より高い製品濃度、より高い純度、および高いスループットが得られます。

置換クロマトグラフィーの出現は、1943年にクロマトグラフィーのモードを前線、溶出、置換の3つに初めて分類したアルネ・ティセリウス[2]によるものです。置換クロマトグラフィーは、超ウラン元素[3]や生化学物質[4]の分離など、さまざまな用途に利用されています。^この技術は^、現代^の高圧カラムと装置を採用した チャバ・ホルヴァート^[5] によって再開発されました。それ以来、特に生物学的高分子の精製の分野で多くの用途が見出されています。

置換クロマトグラフィーの基本原理は、マトリックス（固定相）上の溶質の結合部位の数は限られており、ある部位が 1 つの分子によって占有されている場合、他の分子は結合できないというものです。他のクロマトグラフィーと同様に、マトリックスに結合した特定の種類の分子と、溶液中に遊離している同じ種類の分子との間には平衡が確立されます。結合部位の数は有限であるため、溶液中に遊離している分子の濃度が結合部位の解離定数に比べて大きい場合、それらの結合部位はほとんど満たされます。この結果、結合した溶質と遊離した溶質のグラフは下向きに湾曲し、最も単純なケースではラングミュア等温線が得られます。^{[n 2]マトリックスに対する}親和性が高い分子（置換分子）は、結合部位をめぐってより効率的に競合するため、移動相には親和性の低い溶質が多く残ります。移動相がカラムを通過すると、親和性の低い溶質が優先的に除去されるため、濃度が高い場合は、親和性の高い溶質が最終的に親和性の低いすべての分子を置換します。

分析開始時に、分離する溶質の混合物をカラムに流し込み、高い保持力が得られるように条件を選定します。^{[n 3]} 親和性の高い溶質はカラムの先端付近に優先的に留まり、親和性の低い溶質は下流へ移動します。最も速く移動する成分は下流で純粋なゾーンを形成し始めます。他の成分もゾーンを形成し始めますが、カラムの先端に混合原料を継続的に供給することで完全な分離が妨げられます。

サンプル全体がロードされた後、供給は、サンプルのどの成分よりも高い親和性を持つように選択されたディスプレーサーに切り替えられます。^{[n 4]} ディスプレーサーは、カラムの先頭に鋭いエッジのゾーンを形成し、他の成分を下流に押し出します。各サンプル成分は、親和性の低い溶質のディスプレーサーとして機能し、溶質は一連の連続したバンド (「置換列」) に選別され、すべてディスプレーサーによって設定された速度で下流に移動します。カラムのサイズとロードは、成分がカラムの底に到達する前にこの選別プロセスが完了するように選択されます。溶質は、カラムの底に、それぞれが 1 つの精製された成分で構成される一連の連続したゾーンとして現れ、各ゾーン内の濃度は実質的に均一です。

最後の溶質が溶出された後、カラムから置換剤を除去する必要があります。置換剤は高い親和性のために選択されたため、これは課題となる可能性があります。逆相材料では、高濃度の有機溶媒で洗浄するだけで十分です。大きな pH シフトもしばしば使用されます。1 つの効果的な戦略は、化学反応によって置換剤を除去することです。たとえば、置換剤として水素イオンを使用した場合は、水酸化物との反応によって除去できます。また、多価金属イオンはキレート剤との反応によって除去できます。一部のマトリックスでは、固定相上の反応基を滴定して結合部位を一時的に除去できます。たとえば、弱酸性イオン交換体またはキレート樹脂をプロトン化形態に変換できます。ゲル型イオン交換体の場合、非常に高いイオン強度での選択性の逆転によっても解決策が得られます。置換剤は、その親和性をシフトするために滴定可能な官能基を使用して特別に設計されることがあります。ディスプレーサーを洗い流した後、カラムは必要に応じて洗浄され、次回の実行に備えて初期状態に戻ります。^{[6] [7] [8]}

クロマトグラフィーのどの形式でも、溶質がカラムを下る速度は、溶質が移動相で過ごす時間の割合を直接反映します。溶出クロマトグラフィーまたは置換クロマトグラフィーのいずれかで分離を達成するには、それぞれの溶質の固定相に対する親和性にかなりの差がなければなりません。どちらの方法も、カラムを下る移動を利用して、2 つの相間の分布の小さな差の影響を増幅します。移動相と固定相間の分布は、移動相の濃度の関数として固定相に結合（または分配）された溶質をプロットした結合等温線によって説明されます。等温線は、低濃度では直線またはほぼ直線であることが多いですが、固定相が飽和するにつれて、高濃度では曲線（下向きに凹状）になるのが一般的です。

溶出モードでは、溶質は狭いバンドとしてカラムに適用され、低濃度ではほぼガウス分布のピークとしてカラムを下って移動します。これらのピークは、移動距離の平方根に比例して、移動するにつれて広がり続けます。2 つの物質を分離するには、バンドの広がりの影響を克服するために、十分に異なる速度でカラムを下って移動する必要があります。等温線が曲がる高濃度で操作すると、移動速度が濃度に依存するため、ピークが広がったり歪んだりするため、溶出クロマトグラフィーでは不利になります。

溶出クロマトグラフィーにおける保持は通常、使用する固定相の種類と分離する特定の溶質に応じて移動相の組成（溶媒組成、pH、イオン強度など）を調整することによって制御されます。移動相成分は、分離する溶質よりも固定相に対する親和性が低いのが一般的ですが、高濃度で存在し、質量作用によって効果を発揮します。溶出クロマトグラフィーにおける分解能は、ピークが強く保持されている場合に一般的に向上しますが、初期のピークの分解能が良好になる条件では、グラジエント溶出を使用しない限り、実行時間が長くなり、後のピークが過度に広がります。グラジエント装置は、特に大規模の場合、複雑さと費用を増大させます。

溶出クロマトグラフィーとは対照的に、置換モードで分離された溶質は、広がるピークではなく、鋭いエッジのゾーンを形成します。置換クロマトグラフィーのゾーン境界は自己鋭化します。つまり、何らかの理由で分子がバンドの先を行くと、より強く保持されるゾーンに入り、そのゾーンが追いつくまでよりゆっくりと流れます。さらに、置換クロマトグラフィーは等温線の非線形性を利用するため、負荷は意図的に高く設定されています。特定のカラムで特定の時間内により多くの物質を分離でき、精製された成分は大幅に高い濃度で回収されます。保持条件は調整可能ですが、置換剤が溶質の移動速度を制御します。置換剤は、分離される溶質のいずれよりも固定相に対する親和性が高くなるように選択され、その濃度は固定相の飽和に近づき、濃度波の望ましい移動速度が得られるように設定されます。置換剤により、設計された実行時間内にすべての対象溶質が確実に除去されるため、グラジエント操作なしで高保持条件を使用できます。^{[6] [7] [8]}

カラムに高保持条件下で負荷をかけることによる濃縮効果のため、置換クロマトグラフィーは希薄な供給ストリームから成分を精製するのに適しています。ただし、クロマトグラフィーカラムの先頭で希薄ストリームから物質を濃縮し、その後条件を切り替えて従来のアイソクラティックモードまたはグラジエントモードで吸着物質を溶出することも可能です。したがって、このアプローチは置換クロマトグラフィーに固有のものではありませんが、負荷容量が高く希釈が少ないため置換モードではより高い濃度を実現できます。

置換クロマトグラフィーの欠点は、非理想性により、各成分のペアの間に常に重複領域が生じることです。この混合領域は、分離された材料の純度を維持するために、別々に収集してリサイクルまたは廃棄する必要があります。スペーサー分子を追加して成分間に領域を形成する戦略 (「キャリア置換クロマトグラフィー」と呼ばれることもあります) が研究されており^[9]、適切で簡単に除去できるスペーサーが見つかった場合に有効です。もう 1 つの欠点は、生のクロマトグラム (たとえば、吸光度または屈折率 と溶出量のプロット) が、特に置換トレインが完全に開発されていない場合、連続した領域について解釈するのが難しいことです。ドキュメント作成とトラブルシューティングでは、特定の成分の分布を確立するために追加の化学分析が必要になる場合があります。もう 1 つの欠点は、再生に必要な時間によってスループットが制限されることです。

ジョン・C・フォードの『クロマトグラフィー百科事典』の記事によると、理論的研究は、少なくともいくつかのシステムでは、最適化された過負荷溶出クロマトグラフィーは置換クロマトグラフィーよりも高いスループットを提供することを示しているが、限られた実験テストでは置換クロマトグラフィーの方が優れていることを示唆している（少なくとも再生時間を考慮する前）。^[7]

歴史的に、置換クロマトグラフィーはアミノ酸や希土類元素の分取分離に応用され、同位体分離についても研究されてきた。^{[9] [10] [11] [12]}

複雑な混合物からタンパク質をクロマトグラフィーで精製することは、混合物に同様に保持されたタンパク質が含まれている場合や、フィード内の微量成分を濃縮する必要がある場合など、非常に困難な場合があります。さらに、従来のクロマトグラフィー モード (線形勾配、アイソクラティッククロマトグラフィーなど) を使用して高分解能が必要な場合は、カラムの負荷が制限されることがよくあります。このような場合、置換クロマトグラフィーは、さまざまなアプリケーションで高カラム負荷で複雑な混合物からタンパク質を精製するための効率的な手法です。

置換クロマトグラフィーの最先端技術における重要な進歩は、イオン交換システムにおけるタンパク質精製用の低分子量置換剤の開発であった。 ^{[13] [14] [15]この研究は、イオン交換システムでタンパク質を置換するには大きな}高分子電解質ポリマーが必要であるという従来の認識から大きく逸脱したという点で重要であった。

低分子量置換剤は、高分子電解質置換剤に比べて操作上の大きな利点があります。たとえば、置換剤と目的のタンパク質の間に重複がある場合、これらの低分子量物質は、標準的なサイズベースの精製方法（サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過など）を使用した置換後処理中に、精製されたタンパク質から容易に分離できます。さらに、これらの低分子量置換剤の塩依存性吸着挙動により、カラムの再生が大幅に容易になります。これらの置換剤は、イオン交換システムにおけるさまざまな高分解能分離に使用されています。^{[16] [17] [18] [19] [20] [21] [22]}さらに、置換クロマトグラフィーの、組み換え 成長因子^[23] 、抗原 ワクチンタンパク質^[24]、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド^{[25]の精製への有用性も実証されています。}イオン交換、疎水性相互作用、および逆相クロマトグラフィーを使用したタンパク質の精製に置換クロマトグラフィーを適用した例がいくつかあります。^[26]

置換クロマトグラフィーは、ベンチスケールの標準的な分析クロマトグラフィーカラムを使用して、複雑な混合物からmg単位の精製タンパク質を得るのに適しています。また、飼料中の微量成分を濃縮するのに特に適しています。置換クロマトグラフィーは、イオン交換、HIC、RPLCなどのさまざまな樹脂システムを使用して簡単に実行できます。^[27]

2次元クロマトグラフィーは、プロテオームを評価するための最も徹底的かつ厳密なアプローチです。これまでに受け入れられてきたアプローチでは、陽イオン交換から逆相HPLCなどの溶出モードクロマトグラフィーアプローチが利用されていましたが、収量は通常非常に低く、ピコモルからフェムトモルの範囲の分析感度が必要です。^[28]置換クロマトグラフィーは微量成分を濃縮できるという利点があるため、上流のクロマトグラフィーステップで溶出モードではなく置換モードを利用する2次元クロマトグラフィーは、プロテオームの微量成分、修飾、および発現した微量成分の同定の潜在的に強力なツールとなります。