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脱アミド化は、アミノ酸アスパラギンまたはグルタミンの側鎖にあるアミド 官能基が除去されるか、別の官能基に変換される化学反応です。通常、アスパラギンはアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に変換されます。グルタミンはグルタミン酸またはピログルタミン酸（5-オキソプロリン）に変換されます。タンパク質またはペプチドでは、これらの反応は構造、安定性、または機能を変化させ、タンパク質の分解につながる可能性があるため重要です。純粋な化学変化は、水基の追加とアンモニア基の除去であり、これは +1（0.98402）Da の質量増加に相当します。脱アミド化はグルタミン、グリコシル化アスパラギン、およびその他のアミドで発生しますが、これらは一般的なタンパク質分解条件下では無視できます。[1]
生理的条件下でのアスパラギン残基の脱アミド化では、側鎖が次のペプチド基の窒素原子（図の右上の黒色）によって攻撃され、非対称のスクシンイミド中間体（赤色）が形成される。中間体の非対称性により、その加水分解生成物はアスパラギン酸（左の黒色）またはβアミノ酸であるイソアスパラギン酸（右下の緑色）の2つとなる。しかし、アスパラギン酸は脱アミド化後に異性化される可能性がある。[2]グルタミン残基の脱アミド化は、同じメカニズムで進行する可能性があるが、アスパラギンの場合、6員環グルタルイミド中間体の形成はスクシンイミド中間体の形成よりも好ましくないため、はるかに遅い速度で進行する可能性がある。一般に、脱アミド化は、エンドプロテアーゼGlu-Cを使用して、酸性pHまたはわずかに塩基性のpH（それぞれ4.5および8.0）でのタンパク質分解によって除去できる。[2]
脱アミド化の速度は、タンパク質の一次配列と高次構造、pH、温度、溶液中の成分など、複数の要因に依存します。脱アミド化の可能性のある部位のほとんどは、高次構造によって安定化されています。Asn-Gly (NG) は最も柔軟性が高く、酸性であるため、生理的条件 (pH 7.4、37 °C) 下で半減期が約 24 時間で、脱アミド化が最も起こりやすいです。[3]
遊離アミノ酸として、またはペプチドやタンパク質の N 末端残基として、グルタミンは容易に脱アミド化されてピログルタミン酸(5-オキソプロリン) を形成します。反応は、側鎖アミドの α-アミノ基の求核攻撃によって進行し、側鎖からアンモニアが脱離して γ-ラクタムを形成します。
分析方法
タンパク質の脱アミド化は、一般的に逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）によるペプチドマッピングで分析されてきました。最近報告された新しいERLIC-MS/MS法は、脱アミド化ペプチドと非脱アミド化ペプチドの分離を強化し、同定と定量化を向上させます。[4]
質量分析法は、治療用モノクローナル抗体を含むタンパク質の脱アミド化状態を特徴付けるために一般的に使用されています。[5]この技術は、その高い感度、速度、特異性により、脱アミド化分析に特に有用です。これにより、部位特異的な脱アミド化分析が可能になります。[6]
質量分析法を使用する際の大きな課題は、サンプル調製中に脱アミド化アーティファクトが形成されることです。これらのアーティファクトは、実際に観察されるよりも自発的な脱アミド化の速度が高いことを示唆するため、結果を大幅に歪めます。これは、検出された脱アミド化の大部分がアーティファクトによるものである場合、QCプロトコルで誤って特徴付けられる可能性がある治療用タンパク質の場合に問題となる可能性があります。最近の研究では、pH を低くすると脱アミド化アーティファクトの速度が低減できることが示されています。[2]
脱アミド化の速度論
脱アミド反応はタンパク質の有効寿命を制限する要因の一つであると推測されている。[1]
影響を受けやすいアミノ酸の後に、立体障害が低いためにペプチドグループが攻撃を受けやすいグリシンなどの小さく柔軟な残基が続く場合、脱アミド化ははるかに速く進行します。脱アミド化反応は、 pH (> 10) と温度が高い場合もはるかに速く進行します。
エンドプロテアーゼ Glu-C は、特定の pH 条件 (4.5 および 8.0) ではグルタミン酸のみに特異性を示し、Tris-HCl、重炭酸塩、または酢酸塩を含む溶液では C 末端側を切断します。
参照
参考文献
- ^ ab Clarke, S (2003). 「化学的プロセスと生化学的プロセスの戦いとしての老化：タンパク質のメチル化と、加齢により損傷したタンパク質の修復のための認識」Ageing Res Rev . 2 (3): 263–285. doi :10.1016/S1568-1637(03)00011-4. PMID 12726775. S2CID 18135051.
- ^ abc Liu, Shanshan; Moulton, Kevin Ryan; Auclair, Jared Robert; Zhou, Zhaohui Sunny (2016-04-01). 「弱酸性条件でタンパク質分解時の脱アミド化アーティファクトを排除：pH 4.5 でのエンドプロテアーゼ Glu-C による消化」.アミノ酸. 48 (4): 1059–1067. doi :10.1007/s00726-015-2166-z. ISSN 1438-2199. PMC 4795971. PMID 26748652 .
- ^ Tyler-Cross R, Schirch V (1991) アミノ酸配列、緩衝液、イオン強度が小ペプチド中のアスパラギン残基の脱アミド化速度とメカニズムに与える影響 J Biol Chem 266:22549–22556
- ^ Zhen, Jing (2018). 「ERLIC-MS/MSベースのペプチドマッピングによる抗体の特性評価」. mAbs . 10 ( 7): 1–9. doi :10.1080/19420862.2018.1505179. PMC 6204790. PMID 30130443.
- ^ Wang, Weijie; Meeler, Andrea R.; Bergerud, Luke T.; Hesselberg, Mark; Byrne, Michael; Wu, Zhuchun (2012). 「質量分析法によるペプチドマッピングによる抗体脱アミド化の定量化と特性評価」International Journal of Mass Spectrometry . 312 : 107–113. Bibcode :2012IJMSp.312..107W. doi :10.1016/j.ijms.2011.06.006.
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- Clarke, S (1987). 「細胞タンパク質中のアスパルチルおよびアスパラギン残基からの自発的なスクシンイミド形成の傾向」。国際ペプチドおよびタンパク質研究誌。30 (6): 808–821。doi : 10.1111 /j.1399-3011.1987.tb03390.x。PMID 3440704 。
- Stephenson , RC; Clarke, S ( 1989). 「タンパク質の自発的分解のモデルとしてのアスパルチルおよびアスパラギンペプチドからのスクシンイミド形成」。The Journal of Biological Chemistry。264 ( 11): 6164–6170。doi : 10.1016/S0021-9258(18)83327-0。PMID 2703484。
- Robinson NE、Robinson AB。(2004) 分子時計：ペプチドおよびタンパク質中のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基の脱アミド化。Althouse Press：Cave Junction、オレゴン州。OCLC 56978028