顕微鏡検査

顕微鏡検査は、顕微鏡を使用して肉眼では見えない物体や物体の領域（通常の目の解像度範囲内にない物体）を観察する技術分野です。 ^{[1]顕微鏡検査には、}光学顕微鏡、電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡の3つのよく知られた分野と、X線顕微鏡という新興分​​野があります。^[要出典]

光学顕微鏡と電子顕微鏡では、試料と相互作用する電磁放射線/電子ビームの回折、反射、または屈折、および散乱した放射線または別の信号の収集により画像が作成されます。このプロセスは、サンプルの広視野照射によって (たとえば、標準的な光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡)、またはサンプル上で細いビームを走査することによって (たとえば、共焦点レーザー走査顕微鏡と走査型電子顕微鏡) 実行されます。走査型プローブ顕微鏡では、走査型プローブと対象物体の表面との相互作用が行われます。顕微鏡の発達は生物学に革命をもたらし、組織学の分野を生み出したため、生命科学と物理科学において不可欠な技術であり続けています。X 線顕微鏡は 3 次元で非破壊的であるため、in situまたは 4D 研究のために同じサンプルを繰り返し画像化することができ、高解像度技術に犠牲にする前に研究対象のサンプルを「見る」ことができます。 3D X 線顕微鏡は、コンピューター断層撮影 (マイクロ CT )の技術を使用して、サンプルを 360 度回転させて画像を再構成します。CT は通常、フラット パネル ディスプレイを使用して実行されます。3D X 線顕微鏡は、たとえば 4 倍から 40 倍までのさまざまな対物レンズを使用し、フラット パネルも使用できます。

顕微鏡学（光学顕微鏡学）の分野は、少なくとも17世紀にまで遡ります。それ以前の顕微鏡、つまり倍率が限られた単レンズの 拡大鏡は、少なくとも13世紀に眼鏡のレンズが広く使われ始めた頃にまで遡りますが^[2]、より高度な複合顕微鏡がヨーロッパで初めて登場したのは1620年頃です^{[3] [4]}顕微鏡学の最古の実践者には、ガリレオ・ガリレイがいます。ガリレイは1610年に望遠鏡を近づけると小さな物体を間近で見ることができることを発見しました^{[5] [6] 。}また、コルネリス・ドレベルは1620年頃に複合顕微鏡を発明したと考えられています^{[7] [8]} アントニー・ファン・レーウェンフックは1670年代に非常に高倍率の単純な顕微鏡を開発し、最初の顕微鏡学者および微生物学者としてよく知られています^{[9] [10]}

光学顕微鏡法または光顕微鏡法では、サンプルを透過または反射した可視光を単一または複数のレンズに通して、サンプルを拡大して見ることができます。^[11]得られた画像は、肉眼で直接検出することも、写真乾板に画像化することも、デジタルでキャプチャすることもできます。単一のレンズとその付属品、またはレンズと画像装置のシステム、適切な照明装置、サンプルステージ、およびサポートが、基本的な光学顕微鏡を構成します。最も最近開発されたのはデジタル顕微鏡で、これはCCDカメラを使用して興味のある展示物に焦点を合わせます。画像はコンピュータ画面に表示されるため、接眼レンズは不要です。^[12]

標準的な光学顕微鏡 (明視野顕微鏡) の限界は 3 つの領域にあります。

• この技術では、暗い物体や屈折の強い物体のみを効果的に画像化できます。
• 入射波長に応じて回折限界解像度があり、可視領域では光学顕微鏡の解像度は約0.2  マイクロメートル（顕微鏡を参照）に制限され、実用的な倍率限界は約1500倍です。^[13]
• 焦点面の外側からの焦点外の光は画像の鮮明さを低下させる。^[14]

特に生細胞は、細胞の内部構造が無色透明であるため、一般的にコントラストが不十分で、研究をうまく行うことができません。コントラストを高める最も一般的な方法は、選択的染料で構造を染色することですが、これにはサンプルを殺して固定することが必要になることがよくあります。 ^[15]染色によって、標本の加工によって生じた構造の詳細が明らかになり、標本の特徴ではないアーティファクトが生じることもあります。一般に、これらの技術では、細胞構造の屈折率の違いを利用します。明視野顕微鏡は、ガラス窓を通して見るのに似ています。ガラスではなく、ガラスの汚れだけが見えます。違いは、ガラスは密度の高い材料であるため、通過する光の位相に違いが生じることです。人間の目はこの位相の違いに敏感ではありませんが、この位相の違いを振幅 (光強度) の違いに変換する巧妙な光学的解決策が考案されています。^[要出典]

標本のコントラストを改善したり、サンプル内の構造を強調したりするには、特別な技術を使用する必要があります。コントラストを高めたり、サンプルにラベルを付けたりするための顕微鏡技術は、数多くあります。

• ティッシュペーパーのサンプルにコントラストを生成するために使用される透過照明技術の 4 つの例。1.559 μm/ピクセル。
• 
  明視野照明、サンプルのコントラストはサンプル内の光の吸収から生まれます
• 
  交差偏光照明、サンプルのコントラストはサンプルを通過する偏光の回転から生まれます
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  暗視野照明、サンプルのコントラストはサンプルによって散乱された光から生じます
• 
  位相差照明、サンプルのコントラストはサンプルを通過する光の異なる経路長の干渉から生じます

明視野顕微鏡法は、光学顕微鏡法の中で最も単純な方法です。サンプルの照明は透過白色光で行われます。つまり、下から照明し、上から観察します。制限事項としては、ほとんどの生物サンプルのコントラストが低いこと、焦点が合っていない材料がぼやけるため解像度が低いことが挙げられます。この技術の単純さと、サンプルの準備が最小限で済むことは、大きな利点です。^[要出典]

斜照明（横から）を使用すると、画像が立体的に見え、通常は見えない特徴を強調できます。この方法に基づく最近の技術は、細胞培養に使用する倒立顕微鏡に搭載されているシステムであるホフマンの変調コントラストです。斜照明は透明な標本でもコントラストを高めますが、光が軸外から入射するため、焦点が変わると物体の位置がずれて見えます。この制限により、光学セクショニングや Z 軸の正確な測定などの技術は不可能になります。

暗視野顕微鏡法は、染色されていない透明な標本のコントラストを改善するための技術です。^[16]暗視野照明では、注意深く調整された光源を使用して、画像面に入る直接透過（散乱しない）光の量を最小限に抑え、サンプルによって散乱された光のみを収集します。暗視野は、機器のセットアップやサンプルの準備がほとんど必要なく、特に透明な物体の画像コントラストを劇的に改善できます。ただし、この技術では、多くの生物学的サンプルの最終画像で光強度が低く、見かけの解像度が低いという問題が残っています。

ラインベルグ照明は暗視野照明の一種で、透明な色付きフィルターをコンデンサーの直前に挿入することで、高絞り時の光線が低絞り時の光線とは異なる色に見えるようにする（つまり、標本の背景は青く見えるが、対象物は赤く発光する）。他の色の組み合わせも可能であるが、その効果は非常に多様である。^[17]

分散染色は、無色の物体に色をつけた画像を生成する光学技術です。これは光学染色技術であり、色彩効果を生み出すために染料や色素を必要としません。分散染色のより広範な技術では、5 つの異なる顕微鏡構成が使用されます。これには、明視野ベッケ線、斜視、暗視野、位相差、対物レンズストップ分散染色が含まれます。

電子顕微鏡における位相差画像

より洗練された技術では、光学密度の比例的な差が表示されます。位相コントラストは、屈折率の差をコントラストの差として表示する、広く使用されている技術です。これは、1930 年代にオランダの物理学者フリッツ ゼルニケによって開発されました(この功績により、彼は 1953 年にノーベル賞を受賞しました)。たとえば、細胞内の核は、周囲の細胞質に対して暗く表示されます。コントラストは優れていますが、厚い物体には適していません。小さな物体の周囲でもハローが形成されることが多く、詳細が不明瞭になります。このシステムは、コンデンサー内の円形の環状部で構成されており、光の円錐を生成します。この円錐は、位相対物レンズ内の同様のサイズのリングに重ね合わされます。すべての対物レンズには異なるサイズのリングがあるため、すべての対物レンズに対して別のコンデンサー設定を選択する必要があります。対物レンズのリングには特別な光学特性があります。まず、直接光の強度が低減されますが、さらに重要なことに、約 4 分の 1 波長の人工的な位相差が作成されます。この直接光の物理的特性が変化すると、回折光との干渉が発生し、位相差画像が生成されます。位相差顕微鏡の欠点の 1 つは、ハロー形成 (ハロー光リング) です。

より優れており、はるかに高価なのは、干渉コントラストの使用です。光学密度の違いは、レリーフの違いとして現れます。ジョルジュ・ノマルスキーによると、最もよく使用される微分干渉コントラストシステムでは、細胞内の核は実際には球体として現れます。ただし、これは光学効果であり、レリーフは必ずしも実際の形状に似ているわけではないことを念頭に置く必要があります。コントラストは非常に良好で、コンデンサーの絞りを完全に開いた状態で使用できるため、被写界深度が低減され、解像度が最大化されます。

このシステムは、光を常光線と異常光線に分割するコンデンサー内の特殊なプリズム (ノマルスキープリズム、ウォラストンプリズム) で構成されています。2 つの光線間の空間差は最小限です (対物レンズの最大解像度未満)。試料を通過した後、光線は対物レンズ内の同様のプリズムによって再び結合されます。

均質な標本では、2 つのビームに違いはなく、コントラストは生成されません。ただし、屈折境界 (細胞質内の核など) の近くでは、常光線と異常光線の差によって画像に凹凸が生じます。微分干渉コントラストを機能させるには、偏光光源が必要です。光路に 2 つの偏光フィルターを取り付ける必要があります。1 つはコンデンサーの下 (偏光子)、もう 1 つは対物レンズの上 (検光子) です。

注: 顕微鏡の光学設計によって 2 つのビームの横方向の分離が顕著になる場合は、古典的な干渉顕微鏡法が該当します。この方法では、レリーフ画像は生成されませんが、それでも顕微鏡的物体の質量厚さの定量的な測定に使用できます。

干渉を利用するもう 1 つの手法は、干渉反射顕微鏡法(反射干渉コントラスト法、または RIC とも呼ばれます) です。この手法では、スライドへの細胞の接着を利用して干渉信号を生成します。ガラスに細胞が付着していない場合は、干渉は発生しません。

干渉反射顕微鏡は、DIC で使用されるのと同じ要素を使用して、プリズムなしで実現できます。また、検出される光は反射され、DIC が使用される場合のように透過されません。

特定の化合物に高エネルギー光を照射すると、低周波の光を発します。この効果は蛍光として知られています。多くの場合、標本は化学組成に基づいて特徴的な自己蛍光画像を示します。

この方法は、非常に感度が高く、単一分子の検出が可能であるため、現代の生命科学において極めて重要です。多くの蛍光染料を使用して、構造や化合物を染色できます。強力な方法の 1 つは、免疫染色のように蛍光体と結合した抗体の組み合わせです。一般的に使用される蛍光体の例としては、フルオレセインやローダミンがあります。

抗体は、化合物に合わせてカスタマイズできます。たとえば、よく使用される戦略の 1 つは、遺伝コード (DNA) に基づいてタンパク質を人工的に生成することです。これらのタンパク質を使用してウサギを免疫化し、タンパク質に結合する抗体を形成します。その後、抗体は蛍光体と化学的に結合され、研究対象の細胞内のタンパク質を追跡するために使用されます。

緑色蛍光タンパク質(GFP)などの高効率蛍光タンパク質は、蛍光化合物の発現を標的タンパク質の発現にリンクさせるプロセスである遺伝子融合という分子生物学技術を使用して開発されています。この結合した蛍光タンパク質は、一般に生物に対して無毒であり、研究中のタンパク質の機能を妨げることはほとんどありません。遺伝子組み換え細胞または生物は、蛍光タグ付きタンパク質を直接発現するため、元のタンパク質の機能を生体内で研究することができます。

タンパク質結晶の成長により、タンパク質結晶と塩結晶の両方が生成されます。どちらも無色で顕微鏡でしか見ることができません。タンパク質結晶の回収には、タンパク質の固有蛍光または透過型顕微鏡を使用して画像化する必要があります。タンパク質は280 nmの光を吸収するため、どちらの方法も紫外線顕微鏡が必要です。タンパク質は280 nmの光で励起されると、約353 nmで蛍光を発します。^[18]

蛍光発光は励起光とは波長（色）が異なるため、理想的な蛍光画像では、蛍光染料で標識された対象構造のみが表示されます。この高い特異性により、バイオメディカル研究で蛍光光学顕微鏡が広く使用されるようになりました。異なる蛍光染料を使用して異なる生物学的構造を染色すると、染料の個々の色による特異性を保ちながら、同時に検出することができます。

励起光が観察者や検出器に到達するのを防ぐには、高品質のフィルター セットが必要です。これらは通常、励起波長の範囲を選択する励起フィルター、ダイクロイックミラー、および励起光を遮断する発光フィルターで構成されます。ほとんどの蛍光顕微鏡は、検出器に入る励起光の量をさらに減らすために、落射照明モード (サンプルの片側からの照明と検出) で操作されます。

参照: 全反射蛍光顕微鏡 神経科学

共焦点レーザー走査顕微鏡法では、集束したレーザー光線（例：488 nm）をサンプル全体に走査して、点ごとに蛍光を励起します。放出された光はピンホールに通され、焦点外の光が検出器（通常は光電子増倍管）に到達しないようにします。画像はコンピューターで構築され、励起レーザーの位置に応じて測定された蛍光強度がプロットされます。サンプル全体を照明する場合と比較して、共焦点顕微鏡法では横方向の解像度がわずかに高くなり、光学セクショニング（軸方向の解像度）が大幅に向上します。そのため、共焦点顕微鏡法は、3D 構造が重要な場合によく使用されます。

共焦点顕微鏡のサブクラスは、サンプル全体の複数の点を同時にスキャンできる回転ディスク顕微鏡です。対応するピンホール付きディスクは、焦点外の光を排除します。回転ディスク顕微鏡の光検出器は、通常、 EM-CCDまたはsCMOSのデジタル カメラです。

2光子顕微鏡もレーザー走査型顕微鏡ですが、励起には紫外線、青色、緑色レーザー光の代わりにパルス赤外線レーザーが使用されます。レーザーの小さな焦点においてのみ、 2光子励起による蛍光を生成するのに十分な強度があり、つまり焦点外の蛍光は生成されず、画像をクリーンアップするためのピンホールは必要ありません。^[19]これにより、共焦点顕微鏡では効率的に光子を収集できない散乱組織の深部での画像化が可能になります。^[20]広視野検出機能を備えた2光子顕微鏡は、脳組織のカルシウムイメージングなどの機能イメージングによく使用されます。^{[21]これらはいくつかの企業によって}多光子顕微鏡として販売されていますが、2光子励起の代わりに3光子を使用することによる利点はわずかです。

光を狭い角度で円筒レンズに当てて集光したり、対物レンズの軸に垂直な平面で光線を走査したりして形成される光面を使用すると、高解像度の光学断面を撮影できます。^{[22] [23] [24]}単一平面照明、または光シート照明は、複数のプリズムビームエキスパンダーを組み込んだビーム成形技術を使用して実現することもできます。^{[25] [26]}画像はCCDによってキャプチャされます。これらのバリエーションにより、非常に高速で高い信号対雑音比の画像キャプチャが可能になります。

広視野多光子顕微鏡法^{[27] [28] [29] [30]}は、スキャンを必要とせずに物体の広い領域を照らし、画像化する光学非線形画像化技術を指します。2光子蛍光や第二高調波発生などの非線形光学プロセスを誘発するには、高い強度が必要です。走査型多光子顕微鏡では、光をしっかりと焦点を合わせることで高い強度が達成され、ビームスキャンによって画像が得られます。広視野多光子顕微鏡法では、光学的に増幅されたパルスレーザー光源を使用して広い視野（約100μm）を達成することで、高い強度が最もよく達成されます。 ^{[27] [28] [29]}この場合の画像は、スキャンを必要とせずにCCDカメラで単一フレームとして取得されるため、この技術は対象物体全体の動的プロセスを同時に視覚化するのに特に役立ちます。広視野多光子顕微鏡では、多光子走査顕微鏡に比べてフレームレートを最大1000倍まで上げることができます。^[28]しかし、散乱組織では、深さが増すにつれて画質が急速に低下します。

蛍光顕微鏡は、複雑な環境内で特定の標識構造を表示し、生物学的構造の 3 次元情報を提供する強力な技術です。ただし、照明を当てると、焦点が合っているかどうかに関係なく、蛍光標識構造はすべて発光するため、この情報はぼやけます。そのため、特定の構造の画像は、焦点が合っていない構造からの光の影響で常にぼやけます。この現象により、特に高分解能の対物レンズ (通常は高開口数の油浸対物レンズ) を使用する場合にコントラストが失われます。

ただし、ぼやけは光散乱などのランダムなプロセスによって発生するのではなく、顕微鏡画像システムにおける画像形成の光学特性によって明確に定義できます。小さな蛍光光源 (基本的には明るい点) を考えてみると、この点から発せられる光は、焦点がぼけるにつれて、私たちの視点からさらに広がります。理想的な状況では、この点光源は3 次元 (軸方向) で「砂時計」の形になります。この形状は、顕微鏡画像システムの点像分布関数(PSF) と呼ばれます。蛍光画像はいずれも、このような小さな蛍光光源が多数集まってできているため、画像は「点像分布関数によって畳み込まれている」と言われています。テラヘルツ レーザー パルス画像システムの数学的にモデル化された PSF を右側に示します。

イメージング システムの出力は次の式で表すことができます。

${\displaystyle s(x,y)=PSF(x,y)*o(x,y)+n}$

ここで、n は加法性ノイズです。^[32]この点像分布関数^{[33]がわかっているということは、一般に}デコンボリューション顕微鏡法として知られるコンピューターベースの方法によって、このプロセスをある程度逆転させることができることを意味します。 ^[34] 2D または 3D デコンボリューションにはさまざまなアルゴリズムがあります。それらは、非修復法と修復法に大まかに分類できます。非修復法では焦点面から焦点外の光を除去することでコントラストを改善できますが、実際に光を適切な発生場所に再割り当てできるのは修復法だけです。この方法で蛍光画像を処理すると、共焦点顕微鏡の画像など、焦点外の光のない画像を直接取得するよりも有利です。これは、そうでなければ除去される光信号が有用な情報になるためです。3D デコンボリューションの場合、通常、異なる焦点面から撮影した一連の画像 (Z スタックと呼ばれる) と PSF の知識が提供されます。PSF は、顕微鏡のすべての寄与パラメータを知ることで実験的または理論的に導き出すことができます。

近年、回折限界を回避する超解像顕微鏡技術が数多く開発されています。

これは主に、十分に静的なサンプルを複数回画像化し、励起光を変更するか、画像内の確率的変化を観察することによって実現されます。前のセクションで説明した、PSF によって誘発されるぼかしを除去し、数学的に「正しい」光源を割り当てるデコンボリューション法が使用されますが、ピクセル値の意味についての理解は若干異なります。ほとんどの場合、1 つの蛍光体が 1 つの撮影画像上の 1 つのブロブに寄与すると仮定すると、画像内のブロブは計算された位置に置き換えることができ、解像度が回折限界をはるかに下回るまで大幅に向上します。

このような仮定を実現するために、蛍光体の光物理学に関する知識と化学的制御がこれらの技術の中核となり、それによって約20ナノメートルの解像度が得られる。^{[35] [36]}

シリアルタイムエンコード増幅顕微鏡法（STEAM）は、光学画像増幅を使用して感度と速度の基本的なトレードオフを回避し、単一ピクセル光検出器を使用して検出器アレイと読み出し時間の制限を排除することで、超高速シャッター速度とフレームレートを提供する画像化方法です。 ^[37]この方法は、最先端のCCDカメラやCMOSカメラよりも少なくとも1000倍高速です。その結果、衝撃波、マイクロ流体、MEMS、レーザー手術のリアルタイム診断と評価など、高い画像取得速度を必要とする科学、産業、生物医学のアプリケーションに役立つ可能性があります。^[38]

現代の機器のほとんどは、顕微鏡写真や電子画像記録のためのシンプルなソリューションを提供しています。しかし、そのような機能が常に備わっているとは限らず、経験豊富な顕微鏡学者は写真よりも手描きの画像を好む場合があります。これは、対象に関する知識のある顕微鏡学者が、3 次元画像を精密な 2 次元の図面に正確に変換できるためです。ただし、写真やその他の画像キャプチャ システムでは、焦点が合うのは 1 つの薄い面だけです。^{[引用が必要]}

正確な顕微鏡写真を作成するには、単眼接眼レンズを使用した顕微鏡技術が必要です。両目を開いて、顕微鏡を見ていない方の目は、顕微鏡の横のベンチにある紙に集中している必要があります。練習すれば、頭や目を動かさずに、顕微鏡画像で鉛筆の先を同時に「見る」ことで、観察した形状を正確にトレースすることができます。^{[引用が必要]}

顕微鏡の焦点を合わせ、像が無限遠に見えるようにし、常に両目を開けて観察すると、疲れが少なくなります。^[要出典]

顕微分光法：顕微鏡による分光法

解像度は光の波長に依存します。電子顕微鏡は、光の代わりに電子ビームを使用するもので、1930 年代から開発されてきました。電子ビームの波長ははるかに短いため、解像度ははるかに高くなります。

あまり一般的ではありませんが、X 線顕微鏡も 1940 年代後半から開発されてきました。X 線顕微鏡の解像度は、光学顕微鏡と電子顕微鏡の解像度の中間に位置します。

サブ回折顕微鏡が発明されるまで、光の波長により従来の顕微鏡の解像度は約 0.2 マイクロメートルに制限されていました。より高い解像度を得るために、電子顕微鏡でははるかに短い波長の電子ビームが使用されています。

• 透過型電子顕微鏡(TEM) は、電子ビームを試料の非常に薄いスライスに通す点で、複合光学顕微鏡と非常によく似ています。2005 年の解像度の限界は約 0.05 ^{[疑わしい–議論]}ナノメートルで、それ以降、目立った向上は見られません。
• 走査型電子顕微鏡(SEM) は、標本の表面の詳細を視覚化し、非常に優れた 3D ビューを提供します。その結果は、実体光学顕微鏡とほぼ同じです。2011 年の SEM の最高解像度は 0.4 ナノメートルでした。

X線分光法を備えた電子顕微鏡は、定性的および定量的な元素分析を提供することができます。このタイプの電子顕微鏡は分析電子顕微鏡とも呼ばれ、ナノ材料の研究に非常に強力なツールになります。^[39]

これはサブ回折技術です。走査型プローブ顕微鏡の例としては、原子間力顕微鏡(AFM)、走査型トンネル顕微鏡、光子力顕微鏡、回帰追跡顕微鏡などがあります。これらの方法はすべて、固体プローブの先端の物理的接触を利用して、ほぼ平坦であるはずの物体の表面を走査します。

超音波力顕微鏡(UFM) は、AFM 画像のコントラストが制限される「平坦な」対象領域の詳細と画像コントラストを改善するために開発されました。AFM と UFM を組み合わせることで、近接場音響顕微鏡画像を生成できます。AFM チップは超音波を検出するために使用され、音響顕微鏡で発生する波長の制限を克服します。AFM チップの下の弾性変化を利用することで、AFM トポグラフィーよりもはるかに詳細な画像を生成できます。

超音波力顕微鏡法では、カンチレバーまたはサンプルに超音波振動を加えることで、原子間力顕微鏡法における弾性の局所マッピングが可能です。超音波力顕微鏡法の結果を定量的に分析するには、カンチレバーのベースに超音波振動を加えて力-距離曲線を測定し、その結果を有限差分法に基づくカンチレバーのダイナミクスと先端-サンプルの相互作用のモデルと比較します。

紫外線顕微鏡には、2 つの主な目的があります。1 つ目は、紫外線電磁エネルギーのより短い波長を使用して、標準的な光学顕微鏡の回折限界を超える画像解像度を向上させることです。この技術は、現代の半導体に見られるような非常に小さな特徴を持つデバイスの非破壊検査に使用されます。紫外線顕微鏡の 2 つ目の用途は、コントラストの強化です。これは、サンプル自体内の分子と光の相互作用により、個々のサンプルの応答が周囲と比較して強化されるものです。1 つの例は、タンパク質結晶の成長です。タンパク質結晶は塩溶液で形成されます。塩とタンパク質の結晶はどちらも成長過程で形成され、どちらも一般に人間の目には透明であるため、標準的な光学顕微鏡では区別できません。タンパク質のトリプトファンは280 nm の光を吸収するため、280 nm バンドパス フィルターを備えた紫外線顕微鏡で画像化すると、2 種類の結晶を簡単に区別できます。タンパク質結晶は暗く見えますが、塩結晶は透明です。

赤外線顕微鏡法という用語は、赤外線波長で行われる顕微鏡法を指します。一般的な機器構成では、フーリエ変換赤外分光計(FTIR) が光学顕微鏡および赤外線検出器と組み合わされています。赤外線検出器は、単一点検出器、線形アレイ、または 2D 焦点面アレイにすることができます。FTIR は、赤外線分光法による化学分析を実行する機能を提供し、顕微鏡と点検出器またはアレイ検出器により、この化学分析を空間的に分解して、つまりサンプルのさまざまな領域で実行することができます。そのため、この技術は赤外線顕微分光法とも呼ばれています^{[40] [41]レーザー}直接赤外線 (LDIR) イメージング と呼ばれる代替アーキテクチャでは、調整可能な赤外線光源と飛行対物レンズ上の単一点検出器が組み合わされています。この技術は、赤外線化学イメージングによく使用されます。この場合、画像のコントラストは、ユーザーが選択した特定の IR 波長 (通常は特定の IR 吸収帯と関連する分子共鳴)に対する個々のサンプル領域の応答によって決まります。従来の赤外線顕微分光法の主な制限は、空間分解能が回折限界であることです。具体的には、空間解像度は光の波長に関連した数値に制限されます。実用的な IR 顕微鏡の場合、空間解像度は、使用される特定の技術と機器に応じて、波長の 1 ～ 3 倍に制限されます。中赤外線波長の場合、実用的な空間解像度の限界は約 3 ～ 30 μm になります。

IRバージョンのサブ回折顕微鏡も存在します。^{[40] [41]}これらには、IR近接場走査光学顕微鏡（NSOM）^[42] 、光熱顕微分光法、原子間力顕微鏡ベースの赤外分光法（AFM-IR）、および散乱型走査近接場光学顕微鏡（s-SNOM）^[43]とIR波長でナノスケールの空間分解能を提供するナノFTIRが含まれます。

デジタル ホログラフィック顕微鏡(DHM)では、コヒーレント(単色) 光源からの干渉波面がセンサー上に記録されます。画像は、記録されたホログラムからコンピューターによってデジタル的に再構成されます。通常の明視野画像のほかに、位相シフト画像も作成されます。

DHM は、反射モードと透過モードの両方で動作できます。反射モードでは、位相シフト画像によって相対距離測定が提供され、反射面のトポグラフィーマップが表されます。透過モードでは、位相シフト画像によって標本の光学的厚さのラベルフリー定量測定が提供されます。生物細胞の位相シフト画像は染色細胞の画像と非常に類似しており、ハイ コンテント分析ソフトウェアによって正常に分析されています。

DHM のユニークな特徴は、すべての焦点面がホログラムによって同時に記録されるため、画像が記録された後に焦点を調整できることです。この機能により、体積内で移動する粒子を画像化したり、表面を高速でスキャンしたりすることが可能になります。もう 1 つの魅力的な特徴は、ソフトウェアによって光学収差を補正することで低コストの光学系を使用できる DHM の機能です。

デジタル病理学は、コンピュータ技術によって実現される画像ベースの情報環境であり、デジタルスライドから生成された情報を管理できます。デジタル病理学は、ガラススライドを表示、管理、分析できるデジタルスライドに変換する仮想顕微鏡検査によって部分的に実現されます。

レーザー顕微鏡法は、様々な形態の顕微鏡法でレーザー照明源を使用する急速に成長している分野です。^[44]例えば、生物学的用途に焦点を当てたレーザー顕微鏡法では、非線形顕微鏡法、飽和顕微鏡法、二光子励起顕微鏡法と呼ばれるいくつかの技術で超短パルスレーザーを使用します。^[45]

高強度、短パルスの実験室用X線レーザーは、数年前から開発が進められている。この技術が実を結ぶと、正確に定義された瞬間に、生きた状態の基本的な生物学的構造の拡大された3次元画像を得ることができるようになる。水とタンパク質のコントラストを最適化し、感度と解像度を最高にするには、レーザーを窒素線付近の約0.3ナノメートルに調整する必要がある。解像度は、必要な数の光子が記録されている間に発生する流体力学的膨張によって主に制限される。^[46]したがって、試料は露光によって破壊されるが、爆発する前にその形状を捉えることができる。^{[47] [48] [49] [50] [51] [52] [引用過剰]}

適切なレーザーの開発が長引いているにもかかわらず、科学者たちはX線ホログラフィック顕微鏡の実用的な設計とプロトタイプの開発に取り組んできました。^{[53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [過剰な引用]}

光音響効果^[61]、すなわち光吸収によって引き起こされる（超）音波の発生を利用した顕微鏡技術。集束され強度変調されたレーザービームがサンプル上でラスタースキャンされる。発生した（超）音波は超音波トランスデューサーによって検出される。一般的には圧電超音波トランスデューサーが使用される。^[62]

画像のコントラストはサンプルの吸収係数と関係があります。これは、画像のコントラストが透過率または散乱による明視野顕微鏡または暗視野顕微鏡とは対照的です。原則として、蛍光顕微鏡のコントラストはサンプルの吸収にも比例します。ただし、蛍光顕微鏡では、信号を検出するために蛍光量子収率がゼロでない必要があります。ただし、光音響顕微鏡では、すべての吸収物質が光音響信号を発し、これは ${\displaystyle \alpha}$${\displaystyle \eta_{fl}}$${\displaystyle PA}$

${\displaystyle PA\propto \alpha *\Gamma *((1-\eta _{fl})*E_{g}+(E_{laser}-E_{g}))}$

ここで、 はグリューナイゼン係数、はレーザーの光子エネルギー、はサンプルのバンドギャップエネルギーです。したがって、蛍光量子収率が高いと蛍光信号が高くなり、蛍光量子収率が低いと光音響信号が高くなるため、光音響顕微鏡は蛍光顕微鏡の補完技術として適していると考えられます。 ${\displaystyle \ガンマ}$${\displaystyle E_{レーザー}}$${\displaystyle E_{g}}$

非線形効果を無視すると、横方向分解能dxはアッベ回折限界によって制限されます。

${\displaystyle dx=\lambda /(2*NA)}$

ここで、は励起レーザーの波長、NAは対物レンズの開口数である。入射波面が平行であればアッベ回折限界が成立する。しかし、実際にはレーザービームのプロファイルはガウス分布である。したがって、達成可能な解像度を計算するには、切断されたガウスビームの公式を使用する必要がある。^[63]${\displaystyle \lambda}$

アマチュア顕微鏡検査は、趣味として生物および非生物の標本を調査および観察することです。鉱物、昆虫、貝殻、植物の収集家は、収集したアイテムを分類するのに役立つ特徴を発見するためのツールとして顕微鏡を使用する場合があります。他のアマチュアは、池の水や他のサンプルに見られる生物の観察に興味があるかもしれません。顕微鏡は、家庭用水槽を飼っている人にとって水質評価にも役立つ場合があります。顕微鏡画像を写真に記録したり描画したりすることは、さらなる楽しみです。顕微鏡写真アートのコンテストもあります。この趣味の参加者は、市販の顕微鏡スライドを使用することも、独自のスライドを用意することもできます。

顕微鏡は生物標本の記録に欠かせないツールですが、顕微鏡による調査だけでは新種の記述を正当化するには不十分な場合が多くあります。新種の発見を確認するには、遺伝子検査や生化学検査が必要になることがよくあります。研究室と学術文献へのアクセスは必須です。しかし、アマチュアにはプロよりも優れた点が 1 つあります。それは、周囲を探索する時間があることです。上級アマチュアは、多くの場合、プロとチームを組んで発見を検証し、場合によっては新種を記述します。

1800 年代後半、アマチュア顕微鏡観察は米国とヨーロッパで人気の趣味となりました。何人かの「プロのアマチュア」は、日曜日の午後の楽しみとして、慈善家からサンプル採取旅行や顕微鏡観察の報酬を受け取っていました (たとえば、珪藻類の専門家 A. Grunow は、ベルギーの実業家 (など) から報酬を受け取っていました)。ジョン フィン教授は「顕微鏡の選択と使用に関する実用的なヒント (第 2 版、1878 年)」を出版し、「American Journal of Microscopy」の編集者でもありました。

アマチュア顕微鏡画像の例:

• 
  「ハウスビー」マウス100X
• 
  ライスステム cs 400X
• 
  ウサギ精巣100倍
• 
  シダプロタリウム400X

顕微鏡は法医学の分野で応用されています。^[64]顕微鏡は、多くの場合、改変や破壊を伴わずに、最小の証拠品を検出、分解、画像化することができます。顕微鏡は、繊維、毛髪、土、ほこりなどを識別し、比較するために使用されます。

インクの跡、血痕、弾丸の場合は、標本処理は必要なく、顕微鏡検査で直接証拠が示されます。特定の物質の痕跡の場合は、顕微鏡検査を行う前にサンプルの準備を行う必要があります。^{[説明が必要]}

光学顕微鏡は法医学で最もよく使用され、光子を使用して画像を形成します。法医学標本の検査に最も適した顕微鏡は次のとおりです。^[65]

1. 複合顕微鏡

2. 比較顕微鏡

3. 実体顕微鏡

4. 偏光顕微鏡

5. マイクロ分光光度計

法医学用途における顕微鏡の種類の多様性は、主にその倍率範囲によるもので、光学顕微鏡では（1-1200倍）、SEMでは（50-30,000倍）、TEMでは（500-250,000倍）となっている。^[65]

• 顕微鏡用語集、アマチュア光学顕微鏡で使用される一般的な用語。
• Nikon MicroscopyU 光学顕微鏡に関する広範な情報
• オリンパス顕微鏡 顕微鏡リソースセンター
• Carl Zeiss の「顕微鏡の基礎」は、顕微鏡の基礎を段階的に解説するチュートリアルです。
• 顕微鏡検査の詳細 - 最も一般的な顕微鏡検査技術を詳しく説明したイラストが多数掲載されたリソース
• Manawatu Microscopy - 顕微鏡検査と画像分析のための最初のコラボレーション環境。
• オーディオ顕微鏡用語集

• 顕微鏡におけるレシオメトリックイメージングの応用 顕微鏡でのレシオメトリックイメージングの作業例
• インタラクティブな蛍光染料とフィルターのデータベース Carl Zeiss のインタラクティブな蛍光染料とフィルターのデータベース。
• 顕微鏡への新たなアプローチ エリック・ベツィグ: ノーベル賞を超えて—顕微鏡への新たなアプローチ。