タンパク質の結晶化

タンパク質の結晶化は、無機結晶の形成を支配するのと同じ物理法則によって支配されます。結晶化が自発的に起こるためには、結晶状態が熱力学的に有利でなければなりません。これは、ギブズ自由エネルギー（∆G）によって表され、∆G = ∆H - T∆S と定義され、プロセスのエンタルピー変化 ∆H が対応するエントロピー変化∆Sとどのようにトレードオフするかを示します。 ^{[ 10 ]}エントロピーは、大まかにシステムの無秩序さを表します。タンパク質結晶のような高度に秩序だった状態は、溶媒中のタンパク質溶液のような無秩序な状態に比べて熱力学的に不利です。これは、より秩序だった状態への遷移によってシステムの全エントロピーが減少する（負の ∆S）ためです。結晶が自発的に形成されるためには、結晶形成の ∆G が負でなければなりません。言い換えれば、エントロピーのペナルティは、システムの全エネルギーの対応する減少 (∆H) によって支払われなければなりません。塩化ナトリウムなどのよく知られた無機結晶は、結晶状態がシステムの全エネルギーを減少させるため、常温常圧下で自然に形成されます。しかし、一部のタンパク質の常温常圧下での結晶化は、システムのエントロピーを減少させ (負の ∆S)、全エネルギーを増加させ (正の ∆H)、したがって自然には起こりません。このようなタンパク質の結晶化を実現するには、結晶形成がエネルギー的に有利になるように条件を変更します。これは多くの場合、試料の過飽和溶液を作成することによって達成されます。 ^{[ 3 ]}

結晶形成には、核形成と成長の2 つのステップが必要です。^{[ 3 ]}核形成は結晶化の開始ステップです。^{[ 3 ]}核形成段階では、溶液中のタンパク質分子が凝集して安定した固体核を形成します。^{[ 3 ]}核が形成されると、この安定した核に分子が付着することで結晶はどんどん大きくなります。^{[ 3 ]}核形成ステップは、試料が自由度の高い状態から秩序だった状態（水溶液から固体）へと移行する一次相転移であるため、結晶形成にとって重要です。 ^{[ 3 ]}核形成ステップを成功させるには、結晶化パラメーターの操作が不可欠です。タンパク質を結晶化させるためのアプローチは、溶液中の対象タンパク質の溶解度を低下させることです。^{[ 3 ]}溶解度限界を超え、結晶が存在すると、結晶化が達成されます。^{[ 3 ]}

蒸気拡散法は、タンパク質結晶化に最も一般的に用いられる方法です。この方法では、精製タンパク質、緩衝液、沈殿剤を含む液滴を、同様の緩衝液と沈殿剤を高濃度で含むより大きなリザーバーと平衡させます。最初は、タンパク質溶液の液滴には比較的低い沈殿剤濃度とタンパク質濃度が含まれていますが、液滴とリザーバーが平衡するにつれて、液滴中の沈殿剤濃度とタンパク質濃度が増加します。特定のタンパク質に適した結晶化溶液を使用すると、液滴内で結晶成長が起こります。^{[ 11 ] [ 12 ]}この方法は、タンパク質濃度と沈殿剤濃度を穏やかかつ段階的に変化させることができ、大きくて整った結晶の成長を促進するため用いられます。

蒸気拡散は、ハンギングドロップまたはシッティングドロップのいずれかの形式で実行できます。ハンギングドロップ装置では、タンパク質溶液の液滴を逆さまにしたカバースリップの上に置き、それをリザーバーの上に吊り下げます。シッティングドロップ結晶化装置では、液滴をリザーバーから分離された台座の上に置きます。これらの方法はいずれも、液滴とリザーバーの間で平衡状態が達成されるように環境を密閉する必要があります。^{[ 11 ] [ 13 ]}

マイクロバッチ法では、通常、ごく少量のタンパク質液滴（1 μL程度）を油に浸します。油が必要な理由は、使用するタンパク質溶液の量が非常に少ないため、実験を水溶液中で行うには蒸発を抑制する必要があるからです。使用できる油は様々ですが、最も一般的な封止剤はパラフィン油（Chayenらが記述）とシリコン油（D'Arcyが記述）です。また、液体封止剤を使用しないマイクロバッチ法もあり、その場合は、ウェルに液滴を置いた後、ウェル付きプレートにフィルムやテープを素早く貼り付ける必要があります。

必要な試料量が非常に少ないことに加えて、この方法は、実験中に試料が空気中にさらされることがないため、空気中の汚染物質から試料が保護されるという利点も持ち合わせています。

マイクロダイアリシスは、半透膜を利用する手法である。この膜は、小さな分子やイオンは通過できるが、タンパク質や大きなポリマーは通過できない。膜を挟んで溶質濃度の勾配を作り出し、系が平衡状態へと向かうようにすることで、系は徐々に過飽和状態へと移行し、その時点でタンパク質結晶が形成される可能性がある。

マイクロダイアリシスでは、高濃度の塩やその他の膜透過性小分子化合物を用いてタンパク質の溶解度を低下させることで、塩析による結晶化が起こり得る。ごくまれに、純水に対して透析を行い溶質を除去することで自己会合と結晶化を促進し、透析塩析によってタンパク質を結晶化させる場合もある。

この技術では、タンパク質溶液と沈殿溶液を事前に混合することなく、チャネルの両側から注入し、拡散によって平衡状態にします。2つの溶液は試薬チャンバー内で接触し、両方とも最大濃度で自発的な核生成が始まります。システムが平衡状態に達すると、過飽和度が低下し、結晶成長が促進されます。^{[ 14 ]}

タンパク質結晶化の基本的な原動力は、分子間相互作用を介して他のタンパク質と形成できる結合の数を最適化することです。^{[ 3 ]}これらの相互作用は、pHに応じて変化する分子とタンパク質側鎖の電子密度に依存します。^{[ 10 ]}タンパク質の三次構造と四次構造は、アミノ酸の側鎖間の分子間相互作用によって決定され、親水性基は通常、溶媒 (水) に対する水和殻を形成するために溶液の外側を向いています。^{[ 10 ]} pH が変化すると、これらの極性側鎖の電荷も溶液の pH とタンパク質のpKaに応じて変化します。したがって、pH の選択は、分子同士の結合が水分子との結合よりも有利な結晶の形成を促進するために不可欠です。^{[ 10 ]} pH は、最適な結晶化条件を設定するために設定できる最も強力な操作の 1 つです。

タンパク質の溶解度は温度の関数であるため、温度も議論すべき興味深いパラメータです。 ^{[ 15 ]タンパク質結晶化では、結晶を成功させるために温度を操作することが一般的な戦略の 1 つです。pH とは異なり、緩衝液の調製温度、 [ 16 ]}実際の結晶化実験の温度など、結晶化実験のさまざまなコンポーネントの温度が最終結果に影響を与える可能性があります。

化学添加剤は、結晶化プロセスに添加され、結晶の収率を高める小さな化学化合物です。^{[ 17 ]}タンパク質結晶化における小分子の役割は、初期の頃はほとんどの場合汚染物質と考えられていたため、あまりよく考えられていませんでした。^{[ 17 ]}小分子は、結晶接触界面に「パッキングブリッジ」として組み込まれる場合に、役立つと考えられています。現在（2017年時点）では、結晶化の可能性を高めるためにどの小分子を使用すべきかを合理的に決定することは不可能です。^{[ 18 ]}

結晶化の古典的な方法の一つは、液滴に少量のプロテアーゼを加えることである。消化によって構造のない領域が除去され、より結晶化しやすい断片が得られる可能性がある。

化学修飾は結晶化を改善するために使用できる。最も一般的に使用されるのは還元メチル化であり、これは表面のリジンを変化させ、通常はエントロピーを減少させる。^{[ 18 ]}

結晶成長を成功させるために必要なさまざまな条件を調査するために必要な多数の実験を効率化するために、ハイスループット法が存在する。市販のキットは多数あり、あらかじめ組み立てられた成分を、結晶化が成功することが保証されたシステムに適用できる。このようなキットを使用することで、科学者はタンパク質を精製したり、適切な結晶化条件を決定したりする手間を省くことができる。^{[ 19 ]}

液体ハンドリングロボットを使用すると、多数の結晶化実験を同時にセットアップして自動化できます。人間が行うと時間がかかり、エラーが発生しやすいプロセスも、自動化システムを使用すれば効率的かつ正確に実行できます。ロボット結晶化システムは、上記と同じコンポーネントを使用しますが、手順の各ステップを迅速に、かつ多数の繰り返しで実行します。各実験ではごく少量の溶液を使用し、少量であることの利点は2つあります。サンプルサイズが小さいと精製タンパク質の消費量が削減されるだけでなく、溶液の量が少ないため結晶化が速くなります。各実験は、結晶の成長を検出するカメラによって監視されます。^{[ 12 ]}

タンパク質は、タンパク質結晶化の成功率を高めるように設計することができる。一般的な方法は、組換え構築物をトリミングして、しばしば無秩序であったり構造が不十分であったりする（「高エントロピー」）N末端およびC末端部分を除去することである。^{[ 18 ]}

表面エントロピーの低減には、コンフォメーションエントロピーの高い表面残基クラスター（通常はリジン、グルタミン酸、グルタミン）をアラニンに置き換えることが含まれる。^{[ 20 ]}同様に、バルクでリジンをアルギニンに置き換えることも有効であることが証明されている。^{[ 21 ]}また、残基を突然変異させることで結晶接触を設計することも可能である。^{[ 22 ]}

さらに高度な方法としては、結晶化しやすいことが知られている「シャペロン」タンパク質を用いる方法がある。これは、構造が不明なタンパク質と結晶化しやすいことが知られているタンパク質ドメインからなる融合タンパク質を設計することで実現できる。問題となる相互作用は分子間相互作用である場合もある。例えば、候補タンパク質と、そのタンパク質に強く結合するように選択された抗体Fabフラグメントとの間^{[ 18 ]}、あるいは候補タンパク質とマルトース結合タンパク質（MBP）の融合タンパク質と、MBPに結合するように特別に設計されたタンパク質との間^{[ 23 ]などである。}

タンパク質工学の多くの手法では、タンパク質の構造に関するある程度の事前知識が必要であり、どの残基が表面にあるか、あるいは内部にあるかを知るか、あるいは完全な三次構造を知るかのいずれかである。現代のタンパク質構造予測ツールは、ほとんどの場合十分である。これらの方法を使用して結晶化の結果を予測することも可能である。^{[ 24 ]}

表面のシスチン残基は凝集を引き起こし、組換えタンパク質の生産に問題をもたらす傾向がある。これらはアラニンに置換することができる。これは結晶化そのものの問題ではないが、構造決定においてはよく見られる問題である。