全反射蛍光顕微鏡

全反射蛍光顕微鏡( TIRFM ) は、通常 200 ナノメートル未満の標本の薄い領域を観察できるタイプの顕微鏡です。

TIRFM は、ガラススライド上に支持された薄い光学標本切片内の蛍光細胞の励起を利用する画像化モダリティです。この技術は、励起光が透明な固体カバーガラスと液体媒体との界面で完全に内部反射されると、励起光と同じ周波数の電磁場 (エバネッセント波とも呼ばれる) が固体と液体の界面で生成されるという原理に基づいています。^[1]エバネッセント波の強度は固体の表面からの距離とともに指数関数的に減衰するため、固体から数百ナノメートル以内の蛍光分子のみが効率的に励起されます。これにより、蛍光の 2 次元画像が得られますが、細胞内の小胞や構造の位置に関する 3 次元情報を取得できるメカニズムもあります。^[2]

1910年に広視野蛍光法が導入されました。これはサンプル全体を照らす光学技術でした。^[3]その後、1960年に共焦点顕微鏡が導入され、光をピンポイントに向け、サンプルに光の円錐を照射することで、サンプルの背景と露出時間を削減しました。 1980年代には、TIRFMが導入され、検査対象のサンプルの薄い部分のみを照らすことで、背景と露出時間がさらに削減されました。^[3]

TIRFM 用のエバネッセント波を生成する一般的な方法が 2 つあります。^[1] 1 つ目はプリズム法で、プリズムを使用して、カバーガラスと培地/細胞の間の界面に、全反射を引き起こすのに十分な入射角でレーザーを向けます。この構成は 30 年以上にわたって細胞顕微鏡に適用されてきましたが、いくつかの制限があるため、主流のツールにはなりませんでした。プリズム構成には多くのバリエーションがありますが、そのほとんどは標本へのアクセスを制限し、操作の実行、標本スペースへの培地の注入、または生理学的測定の実行を困難にします。^[2]もう 1 つの欠点は、倒立顕微鏡設計に基づくほとんどの構成では、照明が対物光学系の反対側の標本側から導入されるため、標本の大部分を通過するエバネッセント場領域の画像化が必要になることです。このシステムの画像化には非常に複雑で精度が求められるため、プリズム法は多くの生物学者には使用されず、物理学者による使用に限定されていました。

もう一つの方法は対物レンズ法として知られており、細胞顕微鏡でのTIRFMの使用が増加しており、市販のソリューションが利用可能になってからさらに増加し​​ています。^[2]このメカニズムでは、対物レンズの後焦点面でビーム焦点の軸外位置を変更することで、標準的な広視野蛍光とTIRFを簡単に切り替えることができます。顕微鏡に取り付けられた蛍光照明装置に対する位置を変更できるアクチュエータを使用するなど、ビームの位置を変更するために開発されたいくつかの方法があります。

細胞生物学および分子生物学では、細胞接着、ホルモンによる細胞の結合、神経伝達物質の分泌、膜ダイナミクスなど、細胞表面での多数の分子イベントが従来の蛍光顕微鏡で研究されてきました。しかし、標本表面に結合した蛍光体と周囲の媒体内の蛍光体は平衡状態で存在します。これらの分子を従来の蛍光顕微鏡で励起して検出すると、表面に結合した蛍光体からの蛍光は、結合していない分子の数がはるかに多いため、背景の蛍光に圧倒されることがよくあります。TIRFM を使用すると、表面に結合した蛍光体を選択的に励起することができ、結合していない分子は励起されず、蛍光を発しません。サブミクロンの表面選択性のため、TIRFM は単一分子検出の選択肢となっています。

細胞顕微鏡検査における TIRFM の用途は多数あります。これらの用途には次のようなものがあります。

• リガンド結合と受容体の移動に応じた受容体エンドサイトーシスの速度論の測定
• エキソサイトーシス中の小胞に蛍光色素を充填してエキソサイトーシスイベントを観察する
• エンドサイトーシス/エキソサイトーシスにおけるさまざまなタンパク質の役割を定性的および定量的に記述する
• 細胞と固体基質の接触領域の大きさ、動き、距離を観察する

TIRFMは個々の小胞を光学的に分解し、それらの相互作用のダイナミクスを直接追跡する能力を備えており、これまでは不可能だった方法で神経生物学的プロセスに関与する膨大な数のタンパク質を研究する能力を提供します。^[2]

TIRFM は、標準的な広視野および共焦点蛍光顕微鏡に比べて次のようないくつかの利点があります。

• 背景が大幅に減少し、構造がはっきりと見えるようになりました
• 焦点外の蛍光はほとんど収集されないため、ぼやけた効果は減少します。
• 細胞が受ける光の量が大幅に減少し、細胞への光毒性が制限される。

全反射を利用してガラスの表面に接触している細胞を照らすというアイデアは、1956 年に EJ Ambrose によって初めて説明されました。^[4]このアイデアは、1980 年代初頭にミシガン大学アナーバー校のDaniel Axelrod ^{[5]によって TIRFM として拡張されました。TIRFM は、}エバネッセント波を使用して、ガラスと水の界面に隣接する標本の限られた領域にある蛍光体を選択的に照射して励起します。エバネッセント電磁場は界面から 指数関数的に減衰するため、サンプル媒体に浸透するのは約 100 nm の深さだけです。したがって、TIRFM を使用すると、細胞の基底細胞膜(厚さ約 7.5 nm) などの表面領域を選択的に視覚化できます。ただし、視覚化される領域の幅は少なくとも数百ナノメートルであるため、TIRF 顕微鏡検査では、細胞膜に加えて細胞膜のすぐ下の細胞質領域も必然的に視覚化されることに注意してください。細胞膜を選択的に可視化することで、生きた細胞内の細胞膜上の特徴や事象を高い軸方向解像度で表現します。

TIRFは単一分子の蛍光を観察するためにも使用できるため^{[6] [7]、}生物物理学や定量生物学の重要なツールとなっています。TIRF顕微鏡は、DNAバイオマーカーの単一分子検出やSNP識別にも応用されています。^[8]

シスジオメトリ（対物レンズを通した TIRFM）とトランスジオメトリ（プリズムと導光板をベースとした TIRFM）は、全反射効果の質が異なることが示されています。トランスジオメトリの場合、励起光路と発光チャネルは分離されていますが、対物レンズ型 TIRFM の場合は、顕微鏡の対物レンズと他の光学要素を共有します。プリズムベースのジオメトリは、きれいなエバネッセント波を生成することが示されており、その指数関数的減衰は理論的に予測された関数に近いです。^[9] ただし、対物レンズベースの TIRFM の場合、エバネッセント波は強い迷光で汚染されています。迷光の強度はエバネッセント波の 10～15% に達することが示されており、対物レンズ型 TIRFM で取得したデータの解釈が困難になっています^{[10] [11]}

TIRFM デバイスの基本コンポーネントは次のとおりです。

1. 励起ビーム光源
2. カバーガラスと浸漬油
3. 対物レンズ
4. サンプル標本
5. 検出器

対物レンズベース (cis) とプリズムベース (trans) の TIRFM の主な違いは、プリズムベース TIRFM ではエバネッセント場を生成するためにプリズム/ソリューション インターフェイスを使用する必要があるのに対し、対物レンズベース TIRFM ではプリズムを必要とせず、カバー スリップ/ソリューション インターフェイスを使用してエバネッセント場を生成することです。通常、対物レンズベース TIRFM の方が広く使用されていますが、エバネッセント波内の迷光ノイズにより画像品質が低下します。

• 余分な散乱が少ない
• はるかに安価（数千ドルではなく数百ドル）
• 低中倍率および水中浸漬対物レンズに最適
• 無料のコリメートレーザー光源を使用すると最も簡単
• 入射角の広い範囲
  • 最小のエバネッセント場深度を達成することが望ましい

• 高倍率と高絞り
• 安定しており、セットアップと調整が簡単
• 自由平行レーザー、光ファイバー、または従来のアーク光源で動作

TIRFM は全反射という光学現象に基づいています。全反射では、媒体の界面に到達した波は媒体 2 には伝わらず、完全に反射されて媒体 1 に戻ります。全反射には、媒体 2 の屈折率が媒体 1 よりも低く、波が界面に十分に斜めの角度で入射する必要があることが必要です。全反射に伴って観測される現象はエバネッセント波です。エバネッセント波は、空間的に界面から媒体 2 に垂直に広がり、波長、屈折率、入射角に応じて指数関数的に減衰します。エバネッセント波は、サンプルの表面近くの蛍光体の励起を高め、溶液内の余分な蛍光体の励起を減少させるために使用されます。

実用上、対物レンズベースの TIRF では、媒体 1 は通常、屈折率の高いガラス カバースリップであり、媒体 2 は屈折率の低い溶液中のサンプルです。空気による著しい屈折を防ぐために、レンズとガラス カバースリップの間に浸漬油が使用される場合があります。

励起光入射の臨界角はスネルの法則から導かれる。

${\displaystyle \theta _{c}=\sin ^{-1}\left({\frac {n_{1}}{n_{2}}}\right)}$

サンプルの屈折率については、カバーガラスの屈折率。 ${\displaystyle n_{1}}$${\displaystyle n_{2}}$

したがって、入射角が に達すると、全反射とエバネッセント波の効果が観察され始め、 を超えるとこれらの効果がより顕著になります。 ${\displaystyle \theta _{c}}$${\displaystyle \theta _{c}}$

エバネッセント波の強度は次のように表されます。

${\displaystyle I(Z)=I_{0}e^{-z/d}}$

浸透深度は次の式で与えられます。 ${\displaystyle d}$

${\displaystyle d={\frac {\lambda _{0}}{4\pi }}\left(n_{2}^{2}\sin ^{2}\theta -n_{1}^{2}\right)^{-1/2}}$

典型的には≤100ナノメートルであり、これは典型的には光の波長よりもはるかに小さく、共焦点顕微鏡のスライスよりもはるかに薄い。^{[1] [12]}${\displaystyle d}$

TIRFM イメージングでは、サンプル内の励起ビームの波長をフィルタリングによって選択できます。また、入射角の範囲は対物レンズの開口数(NA)によって決まり、NA > である必要があります。このパラメータは、励起ビームが対物レンズに入る角度を変更することで調整できます。最後に、溶液とカバー スリップの反射率 ( ) は、実験的に見つけるか、メーカーから報告されます。 ${\displaystyle \lambda_{0}}$${\displaystyle \theta}$${\displaystyle n}$${\displaystyle n}$

複雑な蛍光顕微鏡技術では、レーザーは均一性が高く、強度が高く、ほぼ単色であるため、好ましい光源です。ただし、ARC LAMP 光源やその他のタイプの光源も使用できることに注意してください。通常、励起ビームの波長はサンプル内の蛍光体の要件によって指定され、最も一般的な励起波長は生物学的サンプルの場合 400～700 nm の範囲です。

実際には、ライトボックスは高強度の多色レーザーを生成し、その後、サンプルを励起するために目的の波長が通過できるようにフィルタリングされます。対物レンズベースの TIRFM の場合、励起ビームと蛍光放出ビームは同じ対物レンズで捕捉されます。したがって、ビームを分割するには、二色ミラーを使用して入射励起ビームを対物レンズに向けて反射し、放出ビームが検出器に通過できるようにします。放出波長と励起波長をさらに分離するには、追加のフィルタリングが必要になる場合があります。

特定の波長の光で励起されると、蛍光色素はより長い波長（エネルギーの少ない波長）の光を再放射します。TIRFM のコンテキストでは、界面に近い蛍光色素のみがエバネッセント場によって容易に励起され、約 100 nm を超える蛍光色素は大幅に減衰します。蛍光色素から放射される光は方向が定まらず、さまざまな場所でさまざまな強度で対物レンズを通過します。この信号は、次に二色性ミラーを通過して検出器に進みます。

ガラスカバースリップの屈折率は通常 程度ですが、浸漬油の屈折率は同等の です。空気の屈折率は であり、対物レンズとカバースリップの間で励起ビームの屈折を引き起こすため、オイルを使用してその領域を緩衝し、ビームがカバースリップとサンプルの界面に到達する前に余分な界面相互作用を防ぎます。 ${\displaystyle n=1.52}$${\displaystyle n=1.51}$${\displaystyle n=1.00}$

対物レンズの 開口数 (NA) は、システムが光を受け取ったり放出したりできる角度の範囲を指定します。

最大の入射角を達成するには、レンズの周辺部を軸外の角度で光を通過させることが望ましいです。

後焦点面（「開口面」とも呼ばれる）は、励起ビームが対物レンズを通過する前に焦点を合わせる面である。対物レンズとBPF間の距離を調整すると、入射角が小さくなったり大きくなったりするため、異なる画像倍率が得られる。ビームは、対物レンズの両端を通過するために、BPFを軸外にして通過する必要があり、角度が臨界角よりも十分に大きくなるようにする必要がある。ビームはBPFに焦点を合わせる必要がある。これにより、対物レンズを通過する光が平行になり、カバーガラスと同じ角度で相互作用し、すべてが完全に内部反射されるようになるためである。^[12]

サンプルはガラスカバースライドの表面に吸着され、適切な蛍光体で染色されて、サンプル内の目的の特徴を解明する必要があります。これは、他の蛍光顕微鏡技術と同じプロトコルです。

ダイクロイック フィルターは、斜めの入射角 (通常 45°) で使用されるエッジ フィルターで、励起帯域の光を効率的に反射し、発光帯域の光を透過します。フィルターの 45° の角度により、励起ビームと発光ビームの経路が分離されます。フィルターは、薄いガラスに真空蒸着された金属、金属塩、誘電体の複数の層の複雑なシステムで構成されています。^[13]このコーティングは、短波長では高い反射率、長波長では高い透過率を持つように設計されています。^[14]フィルターは、選択された励起光 (短波長) を対物レンズを通して試料の平面に透過させると同時に、発光蛍光 (長波長) をバリア フィルターに通過させ、散乱した励起光をレーザー光源の方向に反射します。^[15]これにより、フィルターを通過する励起放射線と検出器で検出される発光蛍光ビームの量が最大化されます。^[16]

バリアフィルターは主に不要な波長、特に短い励起光の波長を遮断します。これは通常、蛍光体から放出される波長のみを通過させ、この帯域外の不要な光をすべて遮断するバンドパスフィルターです。最新の顕微鏡では、蛍光体の特定の放出波長に応じてバリアフィルターを変更できるようになりました。^[13]

画像は電荷結合素子（CCD）デジタルカメラによって検出されます。CCDカメラには、光子検出器（薄いシリコンウェーハ）があり、光に敏感な領域の2Dアレイに組み立てられています。検出器アレイは、入射光の強度に応じて変化する局所的な電荷の形で画像情報をキャプチャして保存します。^[2]図に示すように、光子は検出器によって電子に変換され、電子は回路基板で読み取り可能な電気信号に変換されます。^[17]次に、電気信号はポイントスプレッド関数（PSF）で畳み込まれ、元の信号をサンプリングします。そのため、画像解像度は検出器の数に大きく依存し、ポイントスプレッド関数によって画像解像度が決まります。^[18]

ほとんどの蛍光イメージング技術では、サンプルの大きなスライス (Z 方向) を照射して再構成するため、バックグラウンド ノイズが発生します。TIRFM では、エバネッセント波を使用してサンプルの薄いスライスを蛍光発光させるため、バックグラウンド ノイズとアーティファクトは本質的に少なくなります。ただし、ポアソン ノイズ、光学的収差、光退色、その他の蛍光分子など、その他のノイズとアーティファクトは依然として存在します。

ポアソンノイズは光の測定における基本的な不確実性です。これにより、蛍光光子の検出中に不確実性が生じます。^[18]特定の測定でN個の光子が測定された場合、真の平均値がN +√NとN −√Nの範囲にある確率は63％です。^[19]このノイズにより、誤ったピクセル位置でオブジェクトが誤って表示される可能性があります。

光学収差は、蛍光の回折や顕微鏡と対物レンズのずれによって発生することがあります。サンプルスライド上の光の回折により蛍光信号が拡散し、複雑な画像がぼやけてしまうことがあります。同様に、対物レンズ、フィルター、検出器の間にずれがあると、励起ビームや発光ビームが焦点に合わず、画像がぼやけることがあります。^[14]

光退色は、蛍光体の共有結合または非共有結合が励起光によって破壊され、蛍光を発せなくなる場合に発生します。 ^[20]蛍光物質は励起光のエネルギーによって常にある程度劣化し、蛍光が薄れて暗くぼやけた画像になります。^[21]光退色は避けられませんが、不要な光への露出を避け、光の散乱を最小限に抑えるために浸漬油を使用することで最小限に抑えることができます。^[13]

自己蛍光は、特定の細胞構造で発生することがあり、その場合、その構造内の天然化合物は、比較的短い波長（励起波長に類似）で励起された後に蛍光を発します。^[18]誘導蛍光は、特定の非自己蛍光化合物が特定の化学物質（ホルムアルデヒドなど）と結合した後に蛍光を発するときにも発生します。^[13]これらの蛍光は、画像にアーティファクトやバックグラウンドノイズをもたらす可能性があります。他の蛍光化合物からのノイズは、フィルターを使用して目的の蛍光波長を捕捉するか、サンプル内に自己蛍光化合物が存在しないことを確認することで効果的に除去できます。

現代の蛍光技術では、ぼやけやノイズを除去する方法を取り入れようとしています。光学収差は一般的に決定論的です（画像処理全体と異なるサンプル間で一定です）。^{[18]決定論的なぼやけは、信号}を逆畳み込みし、既知のアーティファクトを減算することで除去できます。逆畳み込み技術は、逆フーリエ変換を使用して元の蛍光信号を取得し、アーティファクトを除去するだけです。^[19]

しかしながら、デコンボリューションは、強い蛍光信号がある場合、またはノイズが明確に識別されている場合にのみ機能することが示されています。さらに、デコンボリューションは統計情報を含まないため、ポアソンノイズなどの非決定論的ノイズを低減できないため、パフォーマンスが低下します。より良い画像解像度と品質を得るために、研究者は統計的手法を使用して、光子が検出器上のどこに分布する可能性があるかをモデル化しました。^{[18] [22]この手法は}最大尤度法と呼ばれ、パフォーマンス速度を向上させるアルゴリズムによってさらに改良されています。^[22]

• Axelrod, Daniel (2001 年 11 月 1 日). 「細胞生物学における全反射蛍光顕微鏡法」(PDF) . Traffic . 2 (11): 764–774. doi :10.1034/j.1600-0854.2001.21104.x. hdl : 2027.42/72779 . PMID  11733042. S2CID  15202097.

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