カルシウムイメージング

カルシウムイメージングは​​、単離した細胞、組織、または培地のカルシウム（Ca ²⁺）状態を光学的に測定する顕微鏡技術です。カルシウムイメージングでは、Ca ²⁺イオンの結合に蛍光特性で反応する蛍光分子であるカルシウム指示薬を利用します。カルシウム指示薬には、化学指示薬と遺伝子組み換えカルシウム指示薬（GECI）の2つの主要なクラスがあります。^[1]この技術により、さまざまな細胞タイプにおけるカルシウムシグナル伝達の研究が可能になりました。ニューロンでは、活動電位の生成には常にCa ²⁺イオンの急速な流入が伴います。したがって、カルシウムイメージングを使用して、細胞培養または生きた動物の何百ものニューロンの電気的活動を監視でき、進行中の行動中のニューロン回路の活動を観察できるようになりました。^[2]

化学指示薬は、カルシウムイオンをキレートできる小さな分子です。これらの分子はすべて、カルシウム (Ca ²⁺ ) イオンとマグネシウム(Mg ²⁺ ) イオンに対する高い選択性を持つ、BAPTAと呼ばれるEGTA同族体に基づいています。

この指標グループには、fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1 が含まれます。

これらの染料は、分子を親油性にして細胞内に容易に進入できるようにするために、アセトキシメチルエステルとしてマスクされたキレート剤カルボキシル基と共に使用されることが多い。この形態の指示薬が細胞内に入ると、細胞エステラーゼがカルボキシル基を解放し、指示薬はカルシウムと結合できるようになる。染料の遊離酸形態（すなわちアセトキシメチルエステル修飾なし）は、微小電極またはマイクロピペットを介して細胞内に直接注入することもできる。これにより、染料を保持する細胞区画に関する不確実性が排除される（アセトキシメチルエステルは小胞体およびミトコンドリア内に進入することもできる）。Ca ²⁺イオンが蛍光指示薬分子に結合すると、蛍光の量子収率の増加または発光/励起波長のシフトのいずれかが生じる。個々の化学的 Ca ²⁺蛍光指示薬は、さまざまな細胞調製物の細胞質カルシウム測定に利用されている。最初のリアルタイム（ビデオレート）Ca ²⁺イメージングは​​、1986年に高感度ビデオカメラを使用して心臓細胞で実施されました。^[3]その後、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用した技術の開発により、細胞内Ca ^{2+シグナルが}Ca ²⁺スパークとCa ²⁺ブリップの形で明らかになりました。化学Ca ²⁺蛍光指示薬の組み合わせからの相対応答は、ミトコンドリアなどの細胞内小器官のカルシウムトランジェントを定量化するためにも使用されました。^[4]

カルシウムイメージングは​​カルシウムマッピングとも呼ばれ、心筋組織の研究にも使用されます。^[5]カルシウムマッピングは、マウス、ラット、ウサギなどの単離された心臓全体に使用される普遍的な技術です。

遺伝子コード化カルシウム指示薬（GECI）は、細胞、発生、生理学的プロセスの生体内イメージングに有用な強力なツールである。^{[6] [7] [8] [9]} GECIは細胞に急激に導入する必要はなく、代わりにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を、さまざまなトランスフェクション法によって個々の細胞または細胞株に導入することができる。また、すべての細胞で指示薬を発現する、または特定の細胞サブタイプで選択的に発現するトランスジェニック動物を作成することも可能です。GECIは、ニューロン、^{[10] [11]} T細胞、^[12] 心筋細胞、^[13]およびその他の細胞タイプの研究に使用されます。一部のGECIは光子の直接放出（発光）によってカルシウムを報告しますが、ほとんどは緑色蛍光タンパク質GFPとその変異体（eGFP、YFP、CFP）を含む蛍光タンパク質をレポーターとして利用しています。

蛍光レポーターのうち、カルシウム指示薬システムは、単一蛍光タンパク質 (FP) システムとペア蛍光タンパク質システムに分類できます。Camgaroo は、単一タンパク質システムを含む最初に開発された変種の 1 つです。Camgaroo は、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン(CaM) を利用します。これらの構造では、CaM は黄色蛍光タンパク質 (YFP) の中央の Y145 に挿入されています。以前の突然変異誘発研究では、この位置での突然変異により蛍光特性を維持しながら pH 安定性が付与され、Y145 が挿入ポイントとして注目されることが明らかになっています。さらに、YFP の N 末端と C 末端はペプチドリンカー (GGTGGS) によって連結されています。CaM が Ca2+ に結合すると、有効 pKa が低下し、発色団の脱プロトン化が可能になります。^[14]これにより、強度測定法でカルシウム結合時に蛍光が増加します。このような検出は、Ca2+ 結合の結果として吸光度/発光スペクトルが変化する比率測定システムとは対照的です。^{[15]後に開発された}G-CaMPと呼ばれる単一FPシステムも、循環置換GFPを呼び出します。末端の1つはCaMと融合され、もう1つの末端はM13（ミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合ドメイン）と融合されています。^[16]このタンパク質は、末端が空間的に近くなるように設計されており、Ca2+結合により構造変化と発色団変調が起こり、蛍光が増強されます。G-CaMPとその改良型は、ナノモル結合親和性を持っています。^[17]最後の単一タンパク質バリアントはCatchERで、これは一般に親和性が低い指標であると考えられています。そのカルシウム結合ポケットは非常に負であり、陽イオンの結合は、大きな負電荷の濃度を遮蔽するのに役立ち、蛍光の回復を可能にします。^[18]

これらのシステムとは対照的に、対になった蛍光タンパク質システムがあり、これにはプロトタイプのカメレオンが含まれます。カメレオンは、2つの異なる蛍光タンパク質、CaM、M13、およびグリシルグリシンリンカーで構成されています。^[15] Ca2+が存在しない場合は、ドナーの青方偏移蛍光タンパク質のみが蛍光を発します。しかし、カルシウム結合によって引き起こされる構造変化により、赤方偏移蛍光タンパク質の位置が変わり、FRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）が起こるようになります。カメレオンインジケーターは、比率測定信号を生成します（つまり、測定されたFRET効率はカルシウム濃度に依存します）。カメレオンの元のバリアントは、もともとCa2+に対してより敏感で、酸で消光されました。^[19]このような欠点は、Q69KおよびV68L変異によって解消されました。これらの残基は両方とも、埋め込まれたアニオン性発色団に近く、これらの変異はおそらくプロトン化を妨げ、より大きなpH耐性を付与します。

カルシウム検出において重要性が高まっているのが近赤外（NIR）GECIであり、これによりさまざまな指標システムを多重化し、より深い組織への浸透を可能にする道が開かれる可能性がある。NIRはビリベルジン結合蛍光タンパク質に依存しており、これは主に細菌のフィトクロムに由来する。NIRシステムは、Ca2+結合時に蛍光が減少するという点で逆ペリカムに似ている。RCaMPとRGECOは700+ nmで機能するが、非常に暗い。^[20] NIR FRETを含むCameleon類似体もうまく構築されている。^[21]

GECIの特別なクラスは、活性ニューロンに永久的な蛍光タグを形成するように設計されています。これらは、光触媒（紫色光）バックボーン切断により緑から赤に変化する光スイッチ可能なタンパク質Eosに基づいています。 ^[22] CaMと組み合わせると、紫色光はカルシウムレベルが上昇したニューロンのみを光変換します。SynTagMAは、CaMPARI2のシナプス標的バージョンです。^[23]

蛍光システムが広く使用されている一方で、生物発光Ca2+レポーターも、自己蛍光、光退色（励起波長は不要）、生物学的分解および毒性を抑制する能力、ならびに高い信号対雑音比のために潜在能力を秘めている可能性がある。^[24]このようなシステムは、エクオリンおよびルシフェリンのセレンテラジンに依存する可能性がある。Ca2+結合は、セレンテラジンの酸化を促進する構造変化を引き起こす。結果として生じる光生成物は、基底状態に戻る際に青色光を発する。エクオリンとGFPの共存はBRET/CRET（生物発光または化学発光共鳴エネルギー移動）を促進し、^[18] 19 - 65の明るさの増加をもたらす。このような構造は、ミリモルからナノモルのカルシウム濃度を調べるために使用できる。同様のシステムでは、オベリンとそのルシフェリンセレンテラミドが利用されており、アクエオリンよりもカルシウム応答時間が速く、Mg2+非感受性である可能性がある。^[25]このようなシステムは、ルシフェラーゼ成分の自己組織化も活用できる。「ナノランタン」と呼ばれるシステムでは、ルシフェラーゼRLuc8が分割され、CaMの異なる端に配置されます。カルシウム結合により、RLuc8成分が近接し、ルシフェラーゼが再形成され、受容体蛍光タンパク質への転移が可能になります。

可視化された細胞へのダメージを最小限に抑えるために、レポーターからの蛍光を検出するために2光子顕微鏡がよく使用されます。^[26]近赤外波長の使用と点関数の軸方向の広がりの最小化^[27]により、ナノメートルの解像度と組織への深い浸透が可能になります。ダイナミックレンジは、多くの場合、このような測定から決定されます。非比率指標（通常は単一タンパク質指標）の場合、ダイナミックレンジは、それぞれCa2+飽和および枯渇条件下で得られた蛍光強度の比です。ただし、比率指標の場合、ダイナミックレンジは、最大FRET効率比（カルシウム飽和）と最小FRET効率比（カルシウム枯渇）の比です。カルシウム濃度フラックスによって生成されるシグナルを測定するために使用されるもう1つの一般的な量は、シグナル対ベースライン比（SBR）です。これは、ベースライン蛍光に対する蛍光の変化（F - F0）の比です。これは、SBRにカウントされた光子の数の平方根を掛けることによってSNR（信号対雑音比）と関連付けることができます。^[18]

遺伝子コード化カルシウム指示薬の特別なクラスは、活動中のニューロンに永久的な蛍光タグを形成するように設計されています。これらは、紫色の光で照らされると緑から赤に変わる光スイッチ可能なタンパク質mEosに基づいています。カルシウムセンサーのカルモジュリンと組み合わせると、紫色の光はカルシウムレベルが上昇したニューロンのみを光変換します。SynTagMA は、CaMPARI2 のシナプスをターゲットにしたバージョンです。

使用する指標の種類にかかわらず、イメージング手順は一般的に非常に似ています。指標をロードした細胞、またはGECIの場合は指標を発現している細胞^[42]は、蛍光顕微鏡を使用して観察し、Scientific CMOS（sCMOS）^[43]カメラまたはCCDカメラで撮影できます。共焦点顕微鏡と2光子顕微鏡は光学セクショニング機能を備えているため、哺乳類の脳などの厚いサンプルでも、樹状突起スパインやシナプスボタンなどのミクロドメインでカルシウム信号を分解できます。画像は、比率として表される単一波長または2つの波長（比率指標）の蛍光強度変化を測定することによって分析されます。必要に応じて、得られた蛍光強度と比率を既知のCa ²⁺レベルの較正値に対してプロットして、絶対Ca ²⁺濃度を測定することができます。ライトフィールド顕微鏡法^[44]は、3Dボリュームでの神経活動機能の機能的読み出しを拡張します。

ファイバー測光法^[45]、^[46]、ミニスコープ^[47]、二光子顕微鏡^[48]、[49]などの方法は、自由に行動する動物モデルや頭部を固定した動物モデルでカルシウムイメージングを提供します。