暗視野顕微鏡

暗視野顕微鏡法（暗視野顕微鏡法とも呼ばれる）は、光学顕微鏡法と電子顕微鏡法の両方において、画像から散乱していないビームを除外する顕微鏡法を指します。その結果、試料の周囲の視野（ビームを 散乱させる試料がない部分）は、通常暗くなります。

光学顕微鏡では、対物レンズから光の円錐を遠ざける暗視野コンデンサーレンズを使用する必要があります。対物レンズの散乱光収集力を最大化するには、油浸を使用し、対物レンズの開口数(NA) は 1.0 未満にする必要があります。NA の高い対物レンズを使用できますが、NA を減らす調整可能な絞りがある場合に限ります。これらの対物レンズの NA は、多くの場合、0.7 から 1.25 まで可変です。^[1]

光学顕微鏡において、暗視野とは、染色されていないサンプルのコントラストを強調するために使用される照明技術を指します。これは、対物レンズによって収集されず、したがって画像の一部を形成しない光でサンプルを照らすことによって機能します。これにより、明るい物体が写っている暗い、ほぼ黒い背景という典型的な外観が生成されます。光学暗視野は通常、焦点面の直接照明を防ぐために光源の前に中央の光ストップを備えたコンデンサーを使用して行われます。また、開口数が高い場合は、最適な屈折率を提供するためにコンデンサーと標本スライドの間に油または水が必要になる場合があります。^{[2] [3]}

倒立顕微鏡を使用した手順を図に示します。

1. 光は顕微鏡に入り、サンプルを照らします。
2. 特殊なサイズのディスクであるパッチ ストップ(図を参照) は、光源からの光をある程度遮断し、外側に照明のリングを残します。低倍率では、広い位相環状部を代わりに使用することもできます。
3. コンデンサーレンズは光をサンプルに向けて集光します。
4. 光はサンプルに入ります。大部分は直接透過しますが、一部はサンプルから散乱します。
5. 散乱光は対物レンズに入りますが、直接透過した光はレンズを通り抜け、直接照明ブロックにより収集されません(図を参照)。
6. 直接透過した光は省略され、散乱した光のみが画像を生成します。

暗視野顕微鏡法は非常にシンプルですが効果的な技術で、組織培養からの塗抹標本や個々の水系単細胞生物など、生きた未染色の生物サンプルを扱う用途に適しています。セットアップのシンプルさを考慮すると、この技術で得られる画像の品質は印象的です。

暗視野顕微鏡の限界の 1 つは、最終画像に映る光のレベルが低いことです。つまり、サンプルを非常に強く照らす必要があるため、サンプルが損傷する可能性があります。

暗視野顕微鏡法では、微分干渉顕微鏡法に典型的なハローやレリーフ状のアーティファクトがほとんど発生しません。ただし、位相情報に対する感度は低下します。

暗視野画像の解釈は、明視野顕微鏡画像の一般的な暗い特徴が見えない可能性があり、その逆もあるため、細心の注意を払って行う必要があります。一般に、暗視野画像には明視野画像に関連する低空間周波数がないため、画像は基礎構造の 高域通過バージョンになります。

暗視野画像は一見明視野画像のネガのように見えますが、それぞれに異なる効果が見られます。明視野顕微鏡では、入射光によって表面に影が落とされている場所、または表面の一部が穴や傷の存在によって反射率が低い場所のいずれかに特徴が見られます。影を落とすには滑らかすぎる隆起した特徴は明視野画像には表示されませんが、特徴の側面で反射する光は暗視野画像に表示されます。

• ティッシュペーパーのサンプルでコントラストを生成するために使用される透過照明技術の比較（フル解像度で表示すると 1.559 μm/ピクセル）
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  暗視野照明、サンプルのコントラストはサンプルによって散乱された光から生じます
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  明視野照明、サンプルのコントラストはサンプル内の光の減衰から生じる
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  交差偏光照明、サンプルのコントラストはサンプルを通過する偏光の回転から生まれます
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  位相差照明、サンプルのコントラストはサンプルを通過する光の異なる経路長の干渉から生じます

暗視野顕微鏡法は最近、コンピューターのマウス ポインティング デバイスに応用され、ガラス表面の微細な傷やほこりを画像化することで、透明なガラス上でマウスを操作できるようになりました。

ハイパースペクトルイメージングと組み合わせると、暗視野顕微鏡は細胞に埋め込まれたナノ材料の特性評価のための強力なツールになります。最近の出版物では、Patskovskyらはこの技術を使用して、 CD44 +癌細胞を標的とする金ナノ粒子（AuNPs）の付着を研究しました。^[4]

透過型電子顕微鏡の暗視野研究は、結晶や結晶欠陥の研究、および個々の原子の画像化において重要な役割を果たします。

簡単に言えば、イメージング^[5]では、入射光ではなく回折光が対物レンズの後焦点面にある小さな対物レンズ開口部を通過するまで、入射光を傾けます。これらの条件下での暗視野画像では、試料上の投影位置の関数および試料の傾きの関数として、回折面の単一の集合から来る回折強度をマッピングできます。

単結晶標本では、ブラッグ条件からわずかに外れた傾斜の標本の単反射暗視野画像により、転位や析出物など、近傍の格子面の 1 セットを曲げる格子欠陥のみを「照らす」ことができます。このような画像の強度分析を使用して、その曲げの量を推定できます。一方、多結晶標本では、暗視野画像は、特定の方向でブラッグ反射する結晶のサブセットのみを照らすのに役立ちます。

弱ビームイメージングには、従来の暗視野と同様の光学系が使われますが、回折ビーム自体ではなく回折ビームの高調波を使用します。この方法では、欠陥の周囲の歪み領域の解像度を大幅に向上できます。

環状暗視野イメージングでは、散乱していないビームを中心にした環状開口部に回折した電子の画像を形成する必要がありますが、散乱していないビームは含まれません。走査透過型電子顕微鏡の大きな散乱角度では、高原子番号の原子からの散乱が強化されるため、これはZコントラストイメージングと 呼ばれることもあります。

これは、電子顕微鏡の格子縞画像のような周期性が明確に定義された画像を調査するための、直接空間と逆数 (フーリエ変換) 空間の中間に位置する数学的手法です。透過型電子顕微鏡のアナログ暗視野画像と同様に、視野内で関心のある周期性が存在するオブジェクトを「照らす」ことができます。アナログ暗視野画像とは異なり、周期性のフーリエ位相、つまり位相勾配をマッピングすることもできます。これにより、ベクトル格子ひずみに関する定量的な情報が得られます。

• 環状暗視野イメージング
• 光場顕微鏡
• ウェーブレット

ウィキメディア・コモンズには、暗視野顕微鏡に関連するメディアがあります。

• ニコン - 実体顕微鏡 > 暗視野照明
• 分子表現
• 暗視野照明入門
• Gage SH . 1920.現代の暗視野顕微鏡法とその発展の歴史。アメリカ顕微鏡学会誌39(2):95–141。
• 暗視野および位相差顕微鏡（パリ南大学）