光学顕微鏡

光学顕微鏡は光学顕微鏡とも呼ばれ、一般に可視光とレンズシステムを使用して小さな物体の拡大画像を生成する顕微鏡の一種です。光学顕微鏡は顕微鏡の最も古い設計であり、現在の複合形式では 17 世紀に発明された可能性があります。基本的な光学顕微鏡は非常に単純なものですが、多くの複雑な設計は解像度とサンプルのコントラストを向上させることを目的としています。^[要出典]

対象物はステージ上に置かれ、顕微鏡の 1 つまたは 2 つの接眼レンズを通して直接観察されます。高倍率顕微鏡では、両方の接眼レンズに同じ画像が表示されるのが一般的ですが、実体顕微鏡では、わずかに異なる画像を使用して 3D 効果を生み出します。画像 (顕微鏡写真) を撮影するには、通常カメラが使用されます。^[要出典]

サンプルはさまざまな方法で照らすことができます。透明な物体は下から照らすことができ、固体の物体は対物レンズを通過する光（明視野）または対物レンズの周囲（暗視野）で照らすことができます。偏光は金属物体の結晶方位を決定するために使用できます。位相コントラストイメージングを使用すると、屈折率の異なる小さな詳細を強調して画像のコントラストを高めることができます。^{[引用が必要]}

通常、さまざまな倍率の対物レンズがタレットに取り付けられており、回転させて所定の位置に配置したり、ズームインしたりできます。光学顕微鏡の最大倍率は、可視光の分解能が限られているため、通常は約 1000 倍に制限されています。これよりも高い倍率も可能ですが、対象物の詳細をさらに詳しく見ることはできません。^[要出典]

可視光を使用しない光学顕微鏡の代替手段としては、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡などがあり、その結果、はるかに高い倍率を実現できます。

光学顕微鏡には、単純顕微鏡と複合顕微鏡の 2 つの基本的なタイプがあります。単純顕微鏡は、拡大のために 1 組のレンズまたはレンズ群の光学パワーを使用します。複合顕微鏡は、レンズ システム (1 組が別の組によって生成された画像を拡大する) を使用して、対象物をはるかに高い倍率で拡大します。現代の研究用顕微鏡の大部分は複合顕微鏡ですが、一部の安価な市販のデジタル顕微鏡は単純な単レンズ顕微鏡です。複合顕微鏡は、光学構成、コスト、および使用目的が異なるさまざまなタイプの顕微鏡にさらに分類できます。^{[引用が必要]}

単純な顕微鏡は、レンズまたはレンズセットを使用して、角度の拡大のみで物体を拡大し、観察者に正立した拡大された虚像を提供します。^{[1] [2]}単一の凸レンズまたはレンズグループの使用は、虫眼鏡、ルーペ、望遠鏡や顕微鏡の接眼レンズなどの単純な拡大装置で見られます。

複合顕微鏡では、観察対象に近いレンズを使用して光を集め（対物レンズと呼ばれる）、顕微鏡内で対象の実像を焦点に合わせます（画像1）。その像は、2つ目のレンズまたはレンズ群（接眼レンズと呼ばれる）によって拡大され、観察者には対象の拡大された倒立虚像が提供されます（画像2）。^[3]複合対物レンズ/接眼レンズの組み合わせを使用すると、はるかに高い倍率が可能になります。一般的な複合顕微鏡では、交換可能な対物レンズが備わっていることが多く、ユーザーは倍率をすばやく調整できます。^{[3]複合顕微鏡では、}位相差などのより高度な照明設定も可能になります。

複合光学顕微鏡の設計には、特殊な目的に応じてさまざまなバリエーションがあります。これらの中には、特定の目的に合わせて特化できる物理的な設計の違いもあります。

• 実体顕微鏡は、サンプルの立体的な画像を提供する低倍率の顕微鏡で、通常は解剖に使用されます。
• 比較顕微鏡には2 つの独立した光路があり、各目で 1 つの画像を介して 2 つのサンプルを直接比較できます。
• 倒立顕微鏡。下からサンプルを観察するためのもので、液体中の細胞培養や金属組織学に役立ちます。
• 光ファイバーコネクタ検査顕微鏡。コネクタ端面検査用に設計されています。
• 高い光学解像度のサンプルを研究するための移動型顕微鏡。

その他の顕微鏡の種類は、異なる照明技術に合わせて設計されています。

• 岩石顕微鏡。その設計には通常、偏光フィルター、回転ステージ、石膏板が含まれており、方向によって光学特性が変化する鉱物やその他の結晶性物質の研究に役立ちます。
• 偏光顕微鏡。岩石顕微鏡に似ています。
• 位相差照明法を応用した位相差顕微鏡。
• 蛍光体を含むサンプルの分析用に設計された落射蛍光顕微鏡。
• 共焦点顕微鏡は、走査レーザーを使用してサンプルを照射し、蛍光を観察する落射蛍光照明の広く使用されている変形です。
• 2光子顕微鏡は、散乱媒体のより深部の蛍光を画像化し、特に生体サンプルにおける光退色を減らすために使用されます。
• 学生用顕微鏡 – 学校での使用や子供向けの入門用として設計された、簡略化された操作部と低品質の光学系を備えた低倍率の顕微鏡であることが多い。^[4]
• 超顕微鏡は、光の散乱を利用して、可視光の波長（約 500 ナノメートル）以下またはそれに近い直径の微粒子を観察できるように改良された光学顕微鏡です。電子顕微鏡の登場以来、ほとんど使われていません。
• 先端増強ラマン顕微鏡は、従来の波長ベースの分解能の制限がなく、先端増強ラマン分光法に基づく光学顕微鏡の変形です。 ^{[5] [6]この顕微鏡は主に、すべての光学ツールを使用する}走査プローブ顕微鏡プラットフォーム上で実現されます。

デジタル顕微鏡は、デジタルカメラを備えた顕微鏡で、コンピューターを介してサンプルを観察できます。顕微鏡は、さまざまなレベルの自動化により、部分的または完全にコンピューター制御することもできます。デジタル顕微鏡を使用すると、距離や面積の測定、蛍光染色や組織学的染色の定量化など、顕微鏡画像のより詳細な分析が可能になります。

低出力のデジタル顕微鏡、USB 顕微鏡も市販されています。これらは基本的に高出力のマクロ レンズを備えたウェブカメラであり、通常は透過照明を使用しません。カメラをコンピューターのUSBポートに直接接続して、画像をモニターに直接表示します。接眼レンズを必要とせず、非常に低コストで適度な倍率 (最大約 200 倍) を提供します。高出力照明は通常、カメラ レンズに隣接するLED光源によって提供されます。

敏感な光子計数デジタルカメラを使用すると、脆弱な生物学的サンプルへの損傷を避けるために非常に低い光レベルでのデジタル顕微鏡検査が可能になります。エンタングルされた光子のペアを提供する光源は、最も光に敏感なサンプルへの損傷のリスクを最小限に抑えることができることが実証されています。このゴーストイメージングを光子スパース顕微鏡に適用すると、サンプルは赤外線光子で照らされ、各光子は可視帯域のエンタングルされたパートナーと空間的に相関し、光子計数カメラによる効率的な画像化が行われます。^[7]

最も古い顕微鏡は、倍率が限られた単レンズの 拡大鏡であり、少なくとも13世紀に眼鏡のレンズが広く使われ始めた頃にまで遡ります。 ^[8]

複合顕微鏡は1620年頃にヨーロッパで初めて登場しました^{[9] [10]。その中にはロンドンで}コルネリス・ドレベルが実演したもの（1621年頃）や、1624年にローマで展示されたものなどがあります^{[11] [10]。}

複合顕微鏡の実際の発明者は不明であるが、長年にわたって多くの主張がなされてきた。その中には、オランダの眼鏡職人ヨハネス・ザカリアッセンが、その登場から35年後に、彼の父である^{ザカリアス}・ヤンセンが1590年にはすでに複合顕微鏡および/または望遠鏡を発明していたという主張が含まれる[12]。ヨハネスの証言は疑わしいと主張する者もいるが^{[13] [14] [15]、}発明の日付が当時ザカリアスが子供だった頃まで遡ることになり、ヨハネスの主張が真実であるためには、複合顕微鏡はヨハネスの祖父であるハンス・マルテンスによって発明されたはずだという憶測につながる。^[14]別の主張では、ヤンセンの競争相手であるハンス・リッペルスハイ（1608年に最初の望遠鏡の特許を申請した）も複合顕微鏡を発明したという。^[16]他の歴史家は、1621年に複合顕微鏡を発明したオランダの発明家コルネリス・ドレベルを指摘している。^{[11] [10]}

ガリレオ・ガリレイは複合顕微鏡の発明者としてしばしば挙げられる。1610年以降、彼は望遠鏡を近づけてハエなどの小さな物体を間近で観察できることを発見した^[17]。また、逆の端から覗いて小さな物体を拡大することもできる。^[18]唯一の欠点は、近くの物体を観察するには、2フィートの望遠鏡を6フィートまで延長しなければならなかったことである。^[19]ガリレオは、1624年にローマで展示されたドレベル製作の複合顕微鏡を見て、独自の改良版を製作した。^{[11] [10]} 1625年、ジョヴァンニ・ファーベルは、ガリレオが1624年にリンチェイ美術学校に提出した複合顕微鏡に顕微鏡という名前をつけた^{[20] (ガリレオはそれを「}オッキオリーノ」または「小さな目」と呼んでいた)。ファーバーはギリシャ語の「小さい」を意味するμικρόν（ミクロン）と「見る」を意味するσκοπεῖν （スコペイン）からこの名前を作った。この名前はリンカーン派によって造られた別の単語「望遠鏡」に類似していることを意味する。^[21]

もう一人のオランダ人、クリスティアーン・ホイヘンスは、17 世紀後半に色消しされたシンプルな 2 レンズ接眼レンズ システムを開発し、顕微鏡開発の大きな前進となりました。ホイヘンスの接眼レンズは今日でも生産されていますが、視野が小さいなどの小さな欠点があります。

アントニー・ファン・レーウェンフック（1632-1724）は、16世紀にすでに単純な拡大レンズが製造されていたにもかかわらず、生物学者の注目を集めた人物として知られています。レーウェンフックの自家製顕微鏡は、非常に小さいながらも強力なレンズが1つ付いた単純な顕微鏡でした。使いにくいものでしたが、レーウェンフックは詳細な画像を見ることができました。複数のレンズを構成するのが難しかったため、複合顕微鏡がレーウェンフックの単純な顕微鏡と同じ品質の画像を提供できるようになるまでには、約150年の光学開発が必要でした。1850年代、チューレーン大学の化学教授ジョン・レナード・リデルは、アメリカで最古かつ最も広範囲なコレラの顕微鏡調査の1つを行っているときに、最初の実用的な双眼顕微鏡を発明しました。^{[23] [24]}

基本的な顕微鏡技術と光学系は 400 年以上前から存在していますが、今日見られるような高品質の画像を生成するためのサンプル照明技術が開発されたのはごく最近のことです。^[要出典]

1893 年 8 月、アウグスト・ケーラーはケーラー照明を開発した。このサンプル照明法は、極めて均一な照明を生み出し、従来のサンプル照明技術の多くの限界を克服した。ケーラー照明が開発される前は、電球のフィラメントなどの光源の画像が常にサンプルの画像に表示されていた。^[要出典]

1953 年、オランダの物理学者フリッツ・ゼルニケは、透明なサンプルを画像化できる位相差照明の開発により、ノーベル物理学賞を受賞しました。光の吸収ではなく干渉を利用することで、生きた哺乳類細胞などの極めて透明なサンプルを染色技術を使わずに画像化できます。そのわずか 2 年後の 1955 年、ジョルジュ・ノマルスキーは、干渉に基づく別の画像化技術である微分干渉コントラスト顕微鏡の理論を発表しました。^{[引用が必要]}

現代の生物顕微鏡は、細胞内の特定の構造を観察するための蛍光 プローブの開発に大きく依存しています。通常の透過光顕微鏡とは異なり、蛍光顕微鏡では、対物レンズを通してサンプルが狭い波長の光で照らされます。この光はサンプル内の蛍光体と相互作用し、より長い波長の光を発します。この発せられた光が画像を構成します。

20 世紀半ば以降、DNAに結合するDAPIなどの化学蛍光染色は、細胞内の特定の構造を標識するために使用されてきました。最近の開発には、蛍光標識抗体を使用してサンプル内の特定のタンパク質を認識する免疫蛍光法や、生きた細胞が蛍光を発する GFP などの蛍光タンパク質があります。

透過光でサンプルを観察するように設計された現代の光学顕微鏡はすべて、光路の基本的な構成要素を共有しています。さらに、ほとんどの顕微鏡は同じ「構造」構成要素を持っています^[25]（右の画像に従って以下に番号が付けられています）：

• 接眼レンズ（1）
• 対物レンズターレット、リボルバー、または回転ノーズピース（複数の対物レンズを保持するため）（2）
• 対物レンズ（3）
• フォーカスノブ（ステージを動かすため）
  • 粗調整（4）
  • 微調整（5）
• ステージ（標本を置くためのもの）（6）
• 光源（光または鏡）（7）
• ダイヤフラムとコンデンサー（8）
• 機械ステージ（9）

接眼レンズは、2 枚以上のレンズが入った円筒形のもので、その機能は、目に像を合わせることです。接眼レンズは、鏡筒の上端に挿入されます。接眼レンズは交換可能で、さまざまな倍率の接眼レンズを装着できます。接眼レンズの一般的な倍率は、5 倍、10 倍 (最も一般的)、15 倍、20 倍です。高性能顕微鏡の中には、対物レンズと接眼レンズの光学構成が一致し、最高の光学性能が得られるものもあります。これは、アポクロマート対物レンズで最も一般的に行われます。

対物ターレット、リボルバー、または回転ノーズピースは、対物レンズのセットを保持する部分です。これにより、ユーザーは対物レンズを切り替えることができます。

一般的な複合光学顕微鏡の下端には、サンプルからの光を集める 1 つ以上の対物レンズがあります。対物レンズは通常、ガラス製の単一または複数の複合レンズを含む円筒形のハウジング内にあります。通常、約 3 つの対物レンズが円形のノーズピースにねじ込まれており、これを回転させて必要な対物レンズを選択できます。これらの配置は、同焦点になるように設計されており、つまり、顕微鏡で 1 つのレンズから別のレンズに変更しても、サンプルの焦点が合ったままになります。顕微鏡の対物レンズは、倍率と開口数という 2 つのパラメータによって特徴付けられます。前者は通常 5 倍から 100 倍の範囲で、後者は 0.14 から 0.7 の範囲で、それぞれ約 40 mm から 2 mm の焦点距離に相当します。倍率が高い対物レンズは通常、開口数が高く、結果として得られる画像の被写界深度が短くなります。一部の高性能対物レンズでは、最高の光学性能を実現するために、適合した接眼レンズが必要になる場合があります。

一部の顕微鏡では、高倍率でより高い解像度を得るために、油浸対物レンズまたは水浸対物レンズを使用しています。これらは、浸漬油や水などの屈折率整合材と、対物レンズとサンプルの間に適合したカバーガラスとともに使用されます。屈折率整合材の屈折率は空気よりも高いため、対物レンズの開口数を大きく（1 より大きい）することができ、光は最小限の屈折で標本から対物レンズの外面に伝達されます。開口数は 1.6 まで達成できます。^[26]開口数が大きいほど、より多くの光を集めることができ、より小さな細部の詳細な観察が可能になります。油浸レンズの倍率は通常 40 ～ 100 倍です。

調整ノブはステージを上下に動かし、粗調整と微調整を別々に調整します。同じコントロールで、顕微鏡をさまざまな厚さの標本に合わせて調整できます。古い設計の顕微鏡では、フォーカス調整ホイールがスタンドに対して顕微鏡のチューブを上下に動かし、ステージは固定されていました。

光学アセンブリ全体は、従来、剛性のあるアームに取り付けられており、さらに、必要な剛性を確保するために、頑丈な U 字型の脚に取り付けられています。アームの角度は調整可能で、視野角を調整できます。

フレームには、顕微鏡のさまざまなコントロールを取り付けるためのポイントがあります。通常、これにはフォーカス用のコントロールが含まれます。通常は、粗いフォーカスを調整するための大きなローレットホイールと、微調整用の小さなローレットホイールです。その他の機能としては、ランプコントロールやコンデンサー調整用のコントロールなどがあります。

ステージは、観察する標本を支える対物レンズの下のプラットフォームです。ステージの中央には、標本を照らす光が通る穴があります。ステージには通常、スライド(標本を載せる、通常 25×75 mm の長方形のガラス板) を保持するためのアームが付いています。

100 倍を超える倍率では、スライドを手で動かすのは現実的ではありません。中価格帯以上の顕微鏡に一般的に搭載されている機械式ステージでは、コントロール ノブを使用してスライドを微調整し、サンプル/スライドを希望どおりに再配置できます。顕微鏡に元々機械式ステージが装備されていない場合は、追加できる場合があります。

すべてのステージはフォーカスのために上下に動きます。機械式ステージでは、スライドが 2 つの水平軸上で動き、標本の位置を決めて標本の詳細を検査します。

ユーザーがステージ上で標本を中央に配置するために、フォーカスは低倍率から開始されます。高倍率に移動するには、ステージを垂直方向に高く移動して高倍率で再度フォーカスする必要があり、標本の水平位置をわずかに調整する必要もあります。標本の水平位置を調整するには、機械式ステージが必要です。

標本を準備してスライドに載せるのは難しいため、子供の場合は、使用する焦点レベルに関係なく、中央に配置され、簡単に焦点を合わせることができる準備済みのスライドから始めるのが最適です。

光源は数多く使用できます。最も単純なのは、日光を鏡で照射する方法です。ただし、ほとんどの顕微鏡には、調整可能で制御可能な独自の光源が備わっています。多くの場合、ハロゲンランプが使用されていますが、LEDやレーザーを使用した照明も一般的になりつつあります。より高価な機器には、 ケーラー照明が装備されていることがよくあります。

コンデンサーは、照明源からの光をサンプルに焦点を合わせるために設計されたレンズです。コンデンサーには、照明の品質と強度を管理するために、絞りやフィルターなどの他の機能も含まれる場合があります。暗視野、位相差、微分干渉コントラスト顕微鏡などの照明技術では、追加の光学部品を光路に正確に配置する必要があります。

複合光学顕微鏡の実際のパワーまたは倍率は、接眼レンズと対物レンズのパワーの積です。たとえば、接眼レンズの倍率が 10 倍で対物レンズの倍率が 100 倍の場合、合計の倍率は 1,000 倍になります。オイルや紫外線の使用など環境を変えると解像度が上がり、1,000 倍を超える倍率でも細部を解像できるようになります。

サンプルからコントラストを向上させた画像を生成するために光路を変更する技術は数多くあります。サンプルからコントラストを高める主な技術には、交差偏光、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト照明などがあります。最近の技術 ( Sarfus )では、交差偏光と特定のコントラスト強化スライドを組み合わせて、ナノメートル サンプルを視覚化します。

• ティッシュペーパーのサンプルにコントラストを生成するために使用される透過照明技術の 4 つの例。1.559 μm/ピクセル。
• 
  明視野照明では、サンプルのコントラストはサンプル内の光の吸収によって決まります。
• 
  交差偏光照明では、サンプルのコントラストはサンプルを通過する偏光の回転によって生じます。
• 
  暗視野照明では、サンプルのコントラストはサンプルによって散乱された光から生じます。
• 
  位相コントラスト照明では、サンプルのコントラストは、サンプルを通過する光の異なる経路長の干渉によって生じます。

現代の顕微鏡では、サンプルの透過光画像を観察するだけでなく、他の種類のデータを抽出するために使用できる技術が多数あります。これらのほとんどは、基本的な複合顕微鏡に加えて追加の機器を必要とします。

• 反射光または入射光（表面構造の分析用）
• 蛍光顕微鏡、両方:

• 落射蛍光顕微鏡
• 共焦点顕微鏡

• 顕微分光法（UV-可視分光光度計と光学顕微鏡を統合したもの）
• 紫外線顕微鏡
• 近赤外線顕微鏡
• コントラスト増強と収差低減のための多重透過顕微鏡法^[27]
• 自動化（大きなサンプルの自動スキャンや画像キャプチャ用）

光学顕微鏡は、マイクロエレクトロニクス、ナノ物理学、バイオテクノロジー、製薬研究、鉱物学、微生物学などで広く使用されています。^[28]

光学顕微鏡は医療診断に使用され、組織を扱う場合や遊離細胞や組織片の塗抹標本検査では組織病理学と呼ばれる分野が使用されます。

工業用途では、双眼顕微鏡が一般的です。真の奥行き知覚を必要とする用途とは別に、双眼接眼レンズを使用すると、顕微鏡ステーションでの長時間労働に伴う目の疲れを軽減できます。特定の用途では、長作動距離または長焦点顕微鏡^{[29]が有益です。アイテムを}窓の後ろで検査する必要がある場合や、工業対象が対物レンズにとって危険である場合があります。このような光学系は、近接焦点機能を備えた望遠鏡に似ています。^{[30] [31]}

測定顕微鏡は精密測定に使用されます。基本的なタイプは2つあります。1つは焦点面の距離を測定できるように目盛りが付いたレチクルを備えています。 ^[32] もう1つの（古い）タイプは、単純な十字線と、対象物を顕微鏡に対して移動させるためのマイクロメーター機構を備えています。^[33]

非常に小型で持ち運び可能な顕微鏡は、実験室用の顕微鏡を設置するのが面倒な場所で使用されています。^[34]

透過光による非常に高い倍率では、点状の物体は回折リングに囲まれたぼんやりとした円盤として見えます。これらはエアリーディスクと呼ばれます。顕微鏡の分解能は、2 つの近接したエアリーディスクを区別する能力 (言い換えれば、顕微鏡が隣接する構造の詳細を別個に明確に表示する能力) とされています。微細な詳細を解像する能力を制限するのは、これらの回折の影響です。回折パターンの範囲と大きさは、光の波長(λ)、対物レンズの製造に使用される屈折材料、および対物レンズの開口数(NA) の両方によって影響を受けます。したがって、回折限界と呼ばれる、対物フィールド内の個別の点を解像することが不可能になる有限の限界があります。光学セットアップ全体の光学収差が無視できると仮定すると、解像度dは次のように表すことができます。

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2NA}}}$

通常、波長は550nmと想定され、これは緑色光に相当します。外部媒体として空気を使用した場合、実用的なNAの最高値は0.95、オイルを使用した場合は1.5までです。実際には、従来のレンズで得られるdの最低値は約200nmです。光の多重散乱を使用する新しいタイプのレンズにより、解像度を100nm未満に向上させることができました。^[35]

上述の透過光限界を超える解像度を達成するための技術は複数存在する。1979年にCourjonとBulaboisが説明したホログラフィック技術もこの解像度限界を突破することができるが、実験分析では解像度が制限されていた。^[36]

蛍光サンプルを使用すると、より多くの技術が利用可能になります。例としては、Vertico SMI、エバネッセント波を使用する近接場走査光学顕微鏡、誘導放出減衰などがあります。2005年には、単一分子を検出できる顕微鏡が教育ツールとして説明されました。^[37]

過去 10 年間で大きな進歩があったにもかかわらず、回折限界を超える技術は依然として限られており、特殊なものとなっています。

ほとんどの技術は横方向の解像度の向上に重点を置いていますが、非常に薄いサンプルの分析を可能にすることを目的とした技術もいくつかあります。たとえば、Sarfus法では、薄いサンプルをコントラストを高める表面に置くことで、0.3 ナノメートルという薄さのフィルムを直接視覚化できます。

2014年10月8日、超解像蛍光顕微鏡の開発により、エリック・ベツィグ、ウィリアム・モーナー、シュテファン・ヘルの3名にノーベル化学賞が授与されました。^{[38] [39]}

SMI（空間変調照明顕微鏡法）は、いわゆる点像分布関数（PSF）工学の光光学プロセスです。これは、顕微鏡のPSFを適切な方法で変更して、光学解像度を高めたり、照明光の波長に比べて小さい蛍光物体の距離測定の精度を最大化したり、ナノメートル範囲の他の構造パラメータを抽出したりするプロセスです。^{[40] [41]}

SPDM（スペクトル精密距離顕微鏡法）は、基本的な位置特定顕微鏡技術であり、蛍光顕微鏡法の光光学プロセスであり、光学顕微鏡法の理論的な解像度の限界をはるかに下回る「光学的に分離された」粒子（分子など）の位置、距離、角度の測定を可能にします。「光学的に分離された」とは、特定の時点で、従来の光学解​​像度によって決定されるサイズ（通常、直径約200〜250 nm）の領域内にある単一の粒子/分子のみが記録されていることを意味します。これは、そのような領域内の分子がすべて異なるスペクトルマーカー（異なる色、または異なる粒子の発光における他の使用可能な違いなど）を持っている場合に可能です。 ^{[42] [43] [44] [45]}

GFP 、Alexa色素、Atto色素、Cy2/Cy3、フルオレセイン分子などの多くの標準的な蛍光色素は、特定の光物理的条件が存在する限り、局在顕微鏡検査に使用できます。このいわゆるSPDMphymod（物理的に変更可能な蛍光体）技術を使用すると、適切な強度の単一のレーザー波長でナノイメージングに十分です。^[46]

標準蛍光色素を用いた3D超解像顕微鏡は、標準蛍光色素SPDMphymodの局在顕微鏡と構造化照明SMIを組み合わせることで実現できます。^[47]

誘導放出減衰は、回折限界を超える高解像度がいかに可能であるかを示す単純な例ですが、大きな制限があります。STED は、サンプル内の蛍光分子の小さなサブポピュレーションで蛍光を誘発するために光パルスの組み合わせを使用する蛍光顕微鏡技術です。各分子は画像内で回折限界の光点を生成し、これらの光点の中心は分子の位置に対応します。蛍光分子の数が少ないため、光点が重なり合う可能性は低く、したがって正確に配置できます。このプロセスは、画像を生成するために何度も繰り返されます。マックスプランク生物物理化学研究所のシュテファン・ヘルは、 STED 顕微鏡と関連する方法論の開発により、2006 年に第 10 回ドイツ未来賞、2014 年にノーベル化学賞を受賞しました。^[48]

可視光の回折限界によって設定された制限を克服するために、他の波を使用する他の顕微鏡が設計されました。

• 原子間力顕微鏡（AFM）
• 走査型電子顕微鏡（SEM）
• 走査型イオン伝導顕微鏡（SICM）
• 走査トンネル顕微鏡(STM)
• 透過型電子顕微鏡（TEM）
• 紫外線顕微鏡
• X線顕微鏡

高周波の波は物質との相互作用が限られていることに注意することが重要です。たとえば、軟部組織は X 線に対して比較的透明であるため、コントラストの明確な発生源と異なるターゲット アプリケーションが生じます。

光の代わりに電子とX線を使用すると、はるかに高い解像度が可能になります。放射線の波長が短いため、回折限界が低くなります。短波長プローブを非破壊的にするために、原子ビームイメージングシステム（原子ナノスコープ）が提案され、文献で広く議論されていますが、従来のイメージングシステムとはまだ競合していません。

STM と AFM は、サンプル表面をスキャンする小さなプローブを使用する走査プローブ技術です。これらの場合の解像度はプローブのサイズによって制限されますが、マイクロマシニング技術では、先端半径が 5～10 nm のプローブを製造できます。

さらに、電子顕微鏡やX線顕微鏡などの方法では真空または部分真空を使用するため、生体サンプルや生物学的サンプルへの使用が制限されます（環境走査型電子顕微鏡を除く）。このような機器に必要な試料室もサンプルのサイズを制限し、サンプルの操作がより困難になります。これらの方法で作成された画像では色を見ることができないため、一部の情報が失われます。ただし、アルミニウム合金の時効硬化やポリマーの微細構造など、分子または原子の影響を調べるときには不可欠です。

• ヴァン・ヘルデン、アルバート;デュプレ、スヴェン。ヴァン・ゲント、ロブ (2011)。望遠鏡の起源。アムステルダム大学出版局。ISBN 978-9069846156。

• 「金属組織学および材料学の試料作製、光学顕微鏡検査、画像分析および硬度試験」、Kay Geels と Struers A/S の共同研究、ASTM International 2006。
• 「光学顕微鏡：進行中の現代革命」、Siegfried Weisenburger と Vahid Sandoghdar、arXiv:1412.3255 2014。

• アンティーク顕微鏡と科学機器 アンティーク顕微鏡、その付属品、歴史に関するサイト
• Antique Microscopes.com 初期の顕微鏡のコレクション
• 歴史的顕微鏡、ヨーロッパのメーカーによる科学顕微鏡の写真 3000 枚以上を収録したイラスト付きコレクション(ドイツ語)
• ゴルブコレクション、17世紀から19世紀の顕微鏡のコレクション。詳細な説明も含まれています。
• 分子表現、光学顕微鏡の概念
• ケンブリッジ大学における実用的な光学顕微鏡のオンラインチュートリアル
• オープンウェットウェア
• セル中心データベース