ハイコンテンツスクリーニング

ハイコンテントスクリーニング（HCS）は、ハイコンテント分析（HCA）またはセロミクスとも呼ばれ、生物学研究や創薬において、細胞の表現型を望ましい方法で変更する小分子、ペプチド、RNAiなどの物質を特定する方法である。^[1]^{[2]したがって、ハイコンテントスクリーニングは、細胞内で行われる}表現型スクリーニングの一種であり、細胞全体または細胞成分の分析と、複数のパラメータの同時読み出しを伴う。^[3] HCSは、ハイスループットスクリーニング（HTS）に関連しており、1つ以上の生物学的アッセイで何千もの化合物の活性を並行してテストしますが、出力としてより複雑な細胞表現型のアッセイが含まれます。^{[4]表現型の変化には、}タンパク質などの細胞産物の産生の増加または減少、および/または細胞の形態（外観）の変化が含まれる場合がある。したがって、HCAでは通常、自動顕微鏡検査と画像分析が含まれます。^[4]ハイコンテント分析とは異なり、ハイコンテントスクリーニングはスループットのレベルを意味するため、「スクリーニング」という用語でHCSとHCA（コンテンツは高いがスループットは低い可能性がある）を区別しています。

ハイコンテントスクリーニングでは、まず細胞を物質とともに培養し、一定時間後に細胞の構造と分子成分を分析します。最も一般的な分析は、タンパク質を蛍光タグで標識し、最後に自動画像解析を使用して細胞表現型の変化を測定することです。吸収と発光の最大値が異なる蛍光タグを使用することで、複数の異なる細胞成分を並行して測定することができます。さらに、画像化により細胞内レベルの変化（細胞質と核と他の細胞小器官など）を検出できます。したがって、細胞ごとに多数のデータポイントを収集できます。蛍光標識に加えて、さまざまなラベルフリーアッセイがハイコンテントスクリーニングで使用されています。^[5]

一般原則

細胞ベースのシステムにおけるハイコンテントスクリーニング（HCS）では、生きた細胞を生物学的研究のツールとして使用し、正常細胞と病気の細胞の働きを解明します。また、HCS は新薬候補の発見と最適化にも使用されます。ハイコンテントスクリーニングは、最新の細胞生物学とそのすべての分子ツール、自動化された高解像度顕微鏡検査、およびロボットによる処理を組み合わせたものです。最初に、細胞を化学物質またはRNAi試薬にさらします。次に、画像分析を使用して細胞形態の変化を検出します。細胞によって合成されたタンパク質の量の変化は、内因性タンパク質に融合された緑色蛍光タンパク質や蛍光抗体などのさまざまな技術を使用して測定されます。

この技術は、潜在的な薬剤が疾患修飾性を持つかどうかを判断するために使用できる可能性があります。たとえば、ヒトのGタンパク質共役受容体（GPCR）は、約880個の細胞表面タンパク質の大きなファミリーであり、環境の細胞外変化を細胞反応に変換します。たとえば、血流に調節ホルモンが放出されて血圧が上昇するなどです。これらのGPCRの活性化には細胞への侵入が伴う可能性があり、これを視覚化することができれば、化学遺伝学、体系的なゲノム全体のスクリーニング、または生理学的操作を通じて受容体機能を体系的に分析するための基礎となります。

細胞レベルでは、シグナル伝達カスケードの活動や細胞骨格の完全性など、さまざまな細胞特性に関するデータを並行して取得できることが、より高速だが詳細度の低いハイスループットスクリーニングと比較したこの方法の主な利点です。HCS は低速ですが、取得されたデータが豊富なため、薬物の効果をより深く理解できます。

自動画像ベースのスクリーニングにより、細胞表現型を変える小さな化合物を特定することができ、細胞機能を修正するための新しい医薬品や新しい細胞生物学的ツールの発見に関心が寄せられています。細胞表現型に基づく分子の選択には、化合物の影響を受ける生化学的ターゲットに関する事前の知識は必要ありません。しかし、生物学的ターゲットを特定することで、その後の化合物ヒットの前臨床最適化と臨床開発が大幅に容易になります。細胞生物学的ツールとしての表現型/視覚スクリーニングの使用が増えていることを考えると、これらの分子を幅広く使用するには、体系的な生化学的ターゲットの特定を可能にする方法が必要です。^[6]ターゲットの特定は、化学遺伝学/ハイコンテントスクリーニングにおける律速段階として定義されています。^[7]

計装

ハイコンテントスクリーニング技術は主に、自動化されたデジタル顕微鏡とフローサイトメトリーをベースとし、データの分析と保存のための IT システムと組み合わせたものです。「ハイコンテント」または視覚生物学技術には 2 つの目的があり、1 つ目はイベントに関する空間的または時間的に分解された情報を取得すること、2 つ目はそれを自動的に定量化することです。空間的に分解された機器は通常、自動化された顕微鏡であり、時間的分解にはほとんどの場合、何らかの蛍光測定が必要です。つまり、多くの HCS 機器は、何らかの画像分析パッケージに接続された (蛍光) 顕微鏡です。これらは、細胞の蛍光画像を撮影するすべての手順を処理し、実験の迅速で自動化された偏りのない評価を提供します。

現在市販されている HCS 機器は、機器の汎用性と全体的なコストに大きく影響する一連の仕様に基づいて分類できます。これには、速度、温度と CO2 の制御を含む生細胞チャンバー₍一部の機器は、より長期的な生細胞イメージング用に湿度の制御も行います)、高速運動アッセイ用の内蔵ピペッターまたはインジェクター、共焦点、明視野、位相差、FRET などの追加のイメージングモードが含まれます。最も決定的な違いの 1 つは、機器が光学共焦点であるかどうかです。共焦点顕微鏡法は、要約すると、物体の薄いスライスをイメージング/分解し、このスライスの外側から来る焦点外の光を排除するものです。共焦点イメージングでは、より一般的に適用されている落射蛍光顕微鏡法よりも高い画像信号対雑音比と高解像度が可能になります。機器に応じて、共焦点性はレーザースキャン、ピンホールまたはスリット付きの単一の回転ディスク、デュアル回転ディスク、または仮想スリットによって実現されます。これらのさまざまな共焦点技術の間には、感度、解像度、速度、光毒性、光退色、機器の複雑さ、価格などのトレードオフがあります。

すべての機器に共通するのは、画像を自動的に撮影、保存、解釈し、大型ロボットセル/培地処理プラットフォームに統合する機能です。

ソフトウェア

多くのスクリーンは、機器に付属する画像解析ソフトウェアを使用して解析され、ターンキーソリューションを提供します。特に難しいスクリーンや、研究室や施設に複数の機器があり、単一の解析プラットフォームに標準化したい場合には、サードパーティのソフトウェアの代替品がよく使用されます。ただし、サードパーティのソフトウェアを使用せずに単一の解析プラットフォームで標準化を行いたいユーザーのために、一部の機器ソフトウェアでは、画像とデータの一括インポートとエクスポートが提供されています。

アプリケーション

この技術により、（非常に）多数の実験を実施し、探索的スクリーニングが可能になります。細胞ベースのシステムは主に化学遺伝学で使用され、大規模で多様な小分子コレクションが細胞モデルシステムに与える影響について体系的にテストされます。何万もの分子のスクリーニングを使用して新薬が発見され、これらは医薬品開発の将来に有望です。新薬の発見を超えて、化学遺伝学は、細胞内の 21,000 の遺伝子産物のほとんどに作用する小分子を特定することでゲノムを機能化することを目指しています。ハイコンテント技術はこの取り組みの一部となり、化学的にノックアウトすることでタンパク質がどこでいつ作用するかを知るための便利なツールを提供できます。これは、タンパク質が発達や成長に必要であるか、またはタンパク質が存在しないと致命的であるため、ノックアウトマウス（1 つまたは複数の遺伝子が欠落している）を作成できない遺伝子に最も役立ちます。化学的ノックアウトは、これらの遺伝子がどのようにどこで機能するかに対処することができます。さらに、この技術はRNAiと組み合わせて使用され、細胞分裂などの特定のメカニズムに関与する遺伝子セットを特定します。ここでは、標的生物のゲノム内の予測遺伝子セット全体をカバーする RNAis のライブラリを使用して、関連するサブセットを特定し、事前に明確な役割が確立されていない遺伝子の注釈付けを容易にすることができます。自動化された細胞生物学によって生成される大規模なデータセットには、細胞と生物の機能のシステムレベルモデルとシミュレーションの構築に使用できる、空間的に分解された定量的データが含まれています。細胞機能のシステム生物学モデルにより、細胞が外部の変化、成長、および疾患に反応する理由、場所、方法を予測できます。

歴史

ハイコンテントスクリーニング技術により、完全な生物システムにおける複数の生化学的および形態学的パラメータの評価が可能になります。

細胞ベースのアプローチの場合、自動化された細胞生物学の有用性には、自動化と客観的な測定によって実験と疾患の理解がどのように改善されるかを検討することが必要です。第一に、自動化によって細胞生物学研究のほとんどの側面 (すべてではない) で研究者の影響が排除され、第二にまったく新しいアプローチが可能になります。

振り返ってみると、20 世紀の古典的な細胞生物学では、培養された細胞株が使用され、ここで説明したものと非常によく似た方法で実験が測定されていましたが、そこでは研究者が何をどのように測定するかを選択しました。1990 年代初頭、研究用の電荷結合素子(CCD) カメラの開発により、細胞の写真で核内のタンパク質の量や核外のタンパク質の量など、細胞の特徴を測定できるようになりました。すぐに、新しい蛍光分子を使用した高度な測定が続き、セカンドメッセンジャーの濃度や細胞内部の pH などの細胞特性の測定に使用されます。クラゲ由来の天然蛍光タンパク質分子である緑色蛍光タンパク質の広範な使用により、細胞生物学の主流技術として細胞イメージングに向かう傾向が加速しました。これらの進歩にもかかわらず、どの細胞をイメージングするか、どのデータを提示するか、それをどのように分析するかは、依然として研究者が選択していました。

類推すると、フットボール競技場とその上に並べられたディナープレートを想像すると、調査員はそれらすべてを見るのではなく、スコアラインに近い数枚を選び、残りはそのままにしておく必要があります。この類推では、競技場は組織培養皿で、プレートはその上で増殖する細胞です。これは合理的で実用的なアプローチですが、プロセスと分析全体を自動化することで、生きた細胞の全集団の分析が可能になり、フットボール競技場全体を測定できます。

参照

参考文献

^ Haney SA編 (2008)。ハイコンテントスクリーニング：科学、技術、アプリケーション。ニューヨーク：Wiley- Interscience。ISBN 978-0-470-03999-1。
^ Giuliano KA、Haskins JR編（2010年）。ハイコンテントスクリーニング：システム細胞生物学と創薬への強力なアプローチ。ニュージャージー州トトワ：ヒューマナプレス。ISBN 978-1-61737-746-4。
^ Gasparri F (2009 年 6 月). 「HCS における細胞表現型の概要: 限界と利点」. Expert Opinion on Drug Discovery . 4 (6): 643– 657. doi :10.1517/17460440902992870. PMID 23489157. S2CID 10771109.
^ ab Varma H, Lo DC, Stockwell BR (2011). 「ハンチントン病治療薬のハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング」。Lo DC、Hughes RE (編)。ハンチントン病の神経生物学：創薬への応用。フロリダ州ボカラトン：CRC Press/Taylor & Francis 。2018年12月5日閲覧。
^ Proll G、Steinle L、Pröll F、Kumpf M、Moehrle B、Mehlmann M、Gauglitz G (2007 年 8 月)。「高コンテンツスクリーニングアプリケーションにおけるラベルフリー検出の可能性」。J Chromatogr A。1161 ( 1–2 ) : 2–8。doi : 10.1016 /j.chroma.2007.06.022。PMID 17612548 。
^ Burdine L、Kodadek T (2004 年 5 月)。「化学遺伝学におけるターゲットの特定: (多くの場合) 欠けているリンク」。Chem . Biol . 11 (5): 593–7 . doi : 10.1016/j.chembiol.2004.05.001 . PMID 15157870。
^ Eggert US、Mitchison TJ (2006 年 6 月)。「イメージングによる小分子スクリーニング」。Curr Opin Chem Biol . 10 (3): 232– 7. doi :10.1016/j.cbpa.2006.04.010. PMID 16682248。

さらに読む

Abraham VC、Taylor DL、Haskins JR (2004 年 1 月)。「大規模細胞生物学へのハイコンテントスクリーニングの適用」。Trends Biotechnol . 22 (1): 15– 22. doi :10.1016/j.tibtech.2003.10.012. PMID 14690618。
Bleicher KH、Böhm HJ、Müller K、Alanine AI (2003 年 5 月)。「ヒットとリードの生成: ハイスループットスクリーニングを超えて」。Nat Rev Drug Discov . 2 (5): 369– 78. doi :10.1038/nrd1086. PMID 12750740. S2CID 4859609。
Burdine L、Kodadek T (2004 年 5 月)。「化学遺伝学におけるターゲットの特定: (多くの場合) 欠けているリンク」。Chem . Biol . 11 (5): 593–7 . doi : 10.1016/j.chembiol.2004.05.001 . PMID 15157870。
Carpenter AE、Sabatini DM (2004 年 1 月)。「遺伝子機能の体系的なゲノムワイドスクリーニング」。Nat . Rev. Genet . 5 (1): 11– 22. doi :10.1038/nrg1248. PMID 14708012. S2CID 637682.
Omta WA (2020年1月)。ハイコンテントスクリーニングにおける知識発見(論文)。ユトレヒト大学。doi : 10.33540/ 198。ISBN 978-90-393-7283-8。
Edwards BS、Oprea T、Prossnitz ER、Sklar LA (2004 年 8 月)。「ハイスループット、ハイコンテンツスクリーニングのためのフローサイトメトリー」。Curr Opin Chem Biol . 8 (4): 392–8 . doi :10.1016/j.cbpa.2004.06.007. PMID 15288249。
Xu GW、Mawji IA、Macrae CJ、Koch CA、Datti A、Wrana JL、Dennis JW、Schimmer AD (2008 年 3 月)。「高濃度化学スクリーニングにより、エリプチシンが p53 核局在の調節因子であることが確認されました」。アポトーシス。13 ( 3 ) : 413– 22。doi :10.1007/s10495-007-0175-4。PMID 18181020。S2CID 8321422 。
Giuliano KA、Haskins JR、Taylor DL (2003 年 8 月)。「新薬発見のためのハイコンテントスクリーニングの進歩」。Assay Drug Dev Technol . 1 (4): 565– 77. doi :10.1089/154065803322302826. PMID 15090253。
Liszewski, Kathy (2014). 「ハイコンテント分析: まさに適切なソリューション」. Gen. Eng. Biotechnol. News . 34 (3).
Milligan G (2003 年 7 月)。「G タンパク質結合受容体のリガンド調節のための高コンテンツアッセイ」。Drug Discov. Today。8 ( 13 ): 579– 85。doi : 10.1016/S1359-6446(03)02738-7。PMID 12850333 。
Battich N 、 Stoeger T 、 Pelkmans L (2013 年 10 月)。「単一分子解像度での数千の単一ヒト細胞における画像ベースのトランスクリプトミクス」。Nature Methods。10 ( 11): 1127– 1133。doi :10.1038/nmeth.2657。PMID 24097269。S2CID 17472560 。

外部リンク

画像ベースのハイコンテンツスクリーニングのガイドライン - NCBI
生体分子イメージングおよび情報科学学会

[Haney_2008-1] Haney SA編 (2008)。ハイコンテントスクリーニング：科学、技術、アプリケーション。ニューヨーク：Wiley- Interscience。ISBN 978-0-470-03999-1。

[Giuliano_Haskins_2010-2] Giuliano KA、Haskins JR編（2010年）。ハイコンテントスクリーニング：システム細胞生物学と創薬への強力なアプローチ。ニュージャージー州トトワ：ヒューマナプレス。ISBN 978-1-61737-746-4。

[Gasparri_2009-3] Gasparri F (2009 年 6 月). 「HCS における細胞表現型の概要: 限界と利点」. Expert Opinion on Drug Discovery . 4 (6): 643– 657. doi :10.1517/17460440902992870. PMID 23489157. S2CID 10771109.

[Varma2011-4] Varma H, Lo DC, Stockwell BR (2011). 「ハンチントン病治療薬のハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング」。Lo DC、Hughes RE (編)。ハンチントン病の神経生物学：創薬への応用。フロリダ州ボカラトン：CRC Press/Taylor & Francis 。2018年12月5日閲覧。

[pmid17612548-5] Proll G、Steinle L、Pröll F、Kumpf M、Moehrle B、Mehlmann M、Gauglitz G (2007 年 8 月)。「高コンテンツスクリーニングアプリケーションにおけるラベルフリー検出の可能性」。J Chromatogr A。1161 ( 1–2 ) : 2–8。doi : 10.1016 /j.chroma.2007.06.022。PMID 17612548 。

[6] Burdine L、Kodadek T (2004 年 5 月)。「化学遺伝学におけるターゲットの特定: (多くの場合) 欠けているリンク」。Chem . Biol . 11 (5): 593–7 . doi : 10.1016/j.chembiol.2004.05.001 . PMID 15157870。

[Eggert_Mitchison_2006-7] Eggert US、Mitchison TJ (2006 年 6 月)。「イメージングによる小分子スクリーニング」。Curr Opin Chem Biol . 10 (3): 232– 7. doi :10.1016/j.cbpa.2006.04.010. PMID 16682248。