赤外ナノ分光法（AFM-IR）

AFMと赤外分光法を組み合わせた最初の測定は、1999年に英国ランカスター大学のHammicheらによって、 M ReadingとHM Pollockが率いるEPSRC資金提供プロジェクトで行われた^{[ 1 ]} 。これとは別に、米国ジェット推進研究所のAndersonは2000年に同様の測定を行った^{[ 2 ]} 。両グループとも、広帯域熱源を備えた従来のフーリエ変換赤外分光計（FTIR）を使用し、放射はサンプルに接触しているプローブの先端付近に集束された。ランカスターグループは、温度に敏感な熱プローブを使用して赤外線の吸収を検出することでスペクトルを取得した。Anderson ^{[ 2 ]}は、従来のAFMプローブを使用して熱膨張を検出するという異なるアプローチをとった。彼は干渉図を報告したがスペクトルは報告しなかった。この方法で得られた最初の赤外スペクトルはHammicheらによって報告された。 2004年に^{[ 6 ]、}この手法を用いて試料のスペクトル情報を取得できることが初めて証明されました。

これらの初期の実験はいずれも、干渉計と併用して広帯域光源を使用していた。そのため、これらの技術はAFM-FTIRと呼ばれることもあるが、Hammicheらは最初の論文でより一般的な用語である光熱マイクロ分光法またはPTMSを考案した。^{[ 1 ]} PTMSにはさまざまなサブグループがあり、^{[ 27 ]}温度を測定する技術^{[ 1 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 6][7 ] [ 14 ] [ 28 ] 、熱膨張}を測定する技術^{[ 2 ] [ 6 ] [8] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]}、広帯域光源を使用する技術などが^{含まれる。[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 6 ] [ 7 ]}レーザーを使用する^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 28 ]}エバネッセント波を使用してサンプルを励起する、^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 15 ]}サンプルを上から直接照射する^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 12 ] [ 14 ] [ 25 ] [ 28 ]}など、これらのさまざまな組み合わせがあります。基本的に、これらはすべて光熱効果を利用しています。光源、方法、検出方法、および照射方法のさまざまな組み合わせは、さまざまなアプリケーションに利点があります。^{[ 6 ]}各ケースでどの形式のPTMSが使用されているかを明確にするよう注意する必要があります。現在、普遍的に受け入れられている命名法はありません。自由電子レーザーを使用してプローブに共鳴運動を誘起するAFM-IRと呼ばれる元の技術は、前述の組み合わせを利用して発展し、さまざまな形式に進化しました。

Hammicheらと Andersonによる先駆的な実験では、熱拡散（赤外線が吸収された領域から熱が拡散すること）のために空間分解能が制限されていました。熱拡散長（熱が拡散する距離）は変調周波数の平方根に反比例します。その結果、初期の AFM-IR アプローチで達成された空間分解能は、干渉計内のミラーの動きによって生成される入射放射の変調周波数が低いため、1 ミクロン以上でした。また、最初の熱プローブは、もともとマイクロ熱分析^{[ 29 ]}用に開発されたWollaston ワイヤデバイス^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}でした（実際、PTMS はもともとマイクロ熱技術のファミリーの 1 つと考えられていました^{[ 4 ]} ） 。これらのプローブの比較的大きなサイズも空間分解能を制限しました。Bozecら[ ^{3 ]と}Readingら^{[ 7 ]}はナノスケール寸法の熱プローブを使用し、より高い空間分解能を実証した。Yeら[ ^{30 ]は}100 nm以下の空間分解能を提供するMEM型熱プローブについて説明し、それをナノ熱分析に使用した。レーザー光源の探索プロセスは、2001年にHammicheらが可変レーザーを使用して最初のスペクトルを取得したときに始まった（パルスレーザー光源による分解能の向上を参照）。 

2001年にReadingら^{[ 4 ]}が、サンプルを上から照明しながら測定を行うことができるカスタムインターフェースを作成したことは、重要な進展でした。このインターフェースは、赤外線ビームを理論上の最大値に近い約500μmの直径のスポットに集束させました^{[注1 ]}。トップダウンまたはトップサイド照明の使用には、任意の厚さのサンプルを任意の基板上で研究できるという重要な利点があります。多くの場合、これはサンプルの準備なしで行うことができます。Hammiche、Pollock、Readingおよび彼らの共同研究者によるその後のすべての実験は、パルスレーザーを使用したナノスケールイメージング用にHillらが構築した装置を含め、このタイプのインターフェースを使用して行われました。 ^{[ 12 ]}ランカスター大学のグループがイーストアングリア大学の研究者と共同で行った研究は、この技術および関連技術を活用するためにAnasys Instrumentsという会社を設立することにつながりました^{[ 31 ]}（商業化を参照）。

Hammicheらによる AFM ベースの赤外線に関する最初の論文^{[ 1 ]}では、熱拡散長の減少により高速変調周波数を使用することで高空間分解能が達成できると予測する、関連する確立された理論的考察が概説されました。彼らは、20  nm ～ 30  nm の範囲の空間分解能が達成可能であると推定しました。^{[ 32 ]}高速変調周波数を実現できる最も容易に入手可能な光源はパルス レーザーです。パルスの速度が高くなくても、パルスの矩形波にはフーリエ空間で非常に高い変調周波数が含まれています。2001 年に、Hammicheらは、光パラメトリック発振器(OPO)として知られる卓上型のチューナブル パルス赤外線レーザーを使用し、パルス レーザーを使用した最初のプローブ ベースの赤外線スペクトルを取得しましたが、画像は報告していません。^{[ 24 ]}

パルスレーザーを用いたナノスケール空間分解能AFM-IRイメージングは​​、フランスのパリ・サウス大学のDazziら^{[ 8 ]}によって初めて実証されました。Dazziらは、フランスのオルセーにあるCLIO施設^{[注2 ]}の波長可変自由電子レーザーを用いて、短パルスの赤外線光源を提供しました。先行研究者^{[ 2 ] [ 6 ]}と同様に、彼らは従来のAFMプローブを用いて熱膨張を測定しましたが、新しい光学構成を導入しました。サンプルをIR透過プリズムに取り付け、エバネッセント波で励起できるようにしました。サンプルによる短赤外線レーザーパルスの吸収により急速な熱膨張が起こり、AFMカンチレバーの先端に力のインパルスが発生しました。この熱膨張パルスにより、AFMカンチレバープローブに一時的な共鳴振動が生じました。このことから、この技術は、この分野の一部の研究者によって光熱誘起共鳴（PTIR）と呼ばれるようになりました。^{[ 10 ] [ 24 ]この技術は必ずしも赤外線波長に限定されるわけではないため、AFM-IR よりも PTIR または PTMS [ 1 ] [ 3 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}という用語を好む人もいます。カンチレバーの振動振幅は、サンプルによって吸収される赤外線の量に直接関係しています。^{[ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ]}波数関数としてカンチレバーの振動振幅を測定することにより、Dazzi のグループはサンプルのナノスケール領域からの吸収スペクトルを取得することができました。以前の研究と比較して、このアプローチは空間分解能を向上させました。これは、短いレーザーパルスを使用することで熱膨張パルスの持続時間が短縮され、熱拡散長がミクロンではなくナノメートルのスケールになるようになったためです。

レーザーパルス照射後のカンチレバー振動の高速フーリエ変換。特徴的なピークの高さは、試料によって吸収された赤外線の量を測定する。

レーザー波長を変化させてAFM測定から得られたスペクトル（下図）。これは従来のFTIRスペクトル（上図）とよく一致している。

波長範囲が狭い可変レーザー光源を使用する主な利点は、サンプル表面上の特定の化学成分の位置を迅速にマッピングできることです。これを実現するために、Dazzi の研究グループは、自由電子レーザー光源を目的の化学物質の分子振動に対応する波長に調整し、サンプル全体にわたって位置の関数としてカンチレバーの振動振幅をマッピングしました。彼らは、大腸菌の化学組成をマッピングできることを実証しました。また、 Rhodobacter capsulatus細胞内のポリヒドロキシ酪酸(PHB)ベシクルを可視化し^{[ 35 ]}、細胞による PHB 生産の効率を監視することもできました。

英国のイースト・アングリア大学では、M. Reading と S. Meech が率いる EPSRC 資金提供プロジェクトの一環として、Hill と彼の同僚^{[ 12 ]}は Readingら^{[ 4 ]}と Hammicheら^{[ 6} ]の以前の研究に倣い、下からエバネッセント波でサンプルを励起したDazziら[ 8 ^]とは対照的に、サンプルを上から照明する光学構成^{[ 5 ]}を使用して熱膨張を測定した。Hillはまた、Hammicheら^{[ 24 ]}と同様に、赤外線光源として光パラメトリック発振器を使用した。この上面照明^{[ 4 ]} 、 OPO 光源^{[ 24 ]}、および熱膨張測定^{[ 2 ] [ 6 ] [ 8 ]}の斬新な組み合わせにより、^赤外線イメージングと分光法でナノスケールの空間分解能が得られることが証明された (図は UEA 装置の概略図と、それを使用して得られた結果を示している^)。ヒルとその同僚らが上方からの照明を用いることで、ダッツィの手法では不可能だった、はるかに広範囲の試料を研究することが可能になった。ハンミッシュ、ヒル、そして彼らの同僚らの研究は、卓上型赤外線光源と上方からの照明を導入することで、初の商業的に実現可能なSPMベースの赤外線装置を可能にした（「商業化」の項を参照）。

Reading らは、広帯域 QCL と熱膨張測定を組み合わせた使用法を検討した。^{[ 40 ]}上記では、熱広帯域光源では高空間分解能が得られないことについて議論した（履歴を参照）。この場合、変調周波数は干渉計のミラー速度によって制限され、その結果、達成可能な横方向の空間分解能が制限される。広帯域 QCL を使用する場合、分解能はミラー速度ではなく、レーザーパルス（またはその他の波形）の変調周波数によって制限される。^{[ 1 ]}広帯域光源を使用する利点は、各ピクセルについてスペクトル全体またはスペクトルの一部を含む画像を取得できることである。これは、単一波長に基づいて画像を取得するよりもはるかに強力である。Reading らの予備結果[ ^{40 ]は}、広帯域 QCL を干渉計に通すことで、熱膨張を測定する従来の AFM プローブから容易に検出可能な応答が得られることを示している。

パルス赤外線レーザー光源に基づく AFM-IR 技術は、2004 年に英国で Reading、Hammiche、Pollock によって設立された Anasys Instruments 社によって商品化されました。^{[ 31 ] [ 41 ]}姉妹会社である米国の企業は 1 年に設立されました。Anasys Instruments 社は、米国国立標準技術研究所と米国国立科学財団の支援を受けて製品を開発しました。自由電子レーザーは希少で、限られた機関でしか利用できないため、商用 AFM-IR を実現する鍵は、それらをよりコンパクトなタイプの赤外線光源に置き換えることでした。2001年にHammicheら^{[ 24 ]}と2008 年にHillら^{[ 12 ]}が先導したように、Anasys Instruments 社は、ナノ秒光パラメトリック発振器に基づく卓上レーザー光源を使用して、2010 年初頭に AFM-IR 製品を発表しました。^{[ 36 ]} OPO光源により、約1000～4000  cm⁻¹または^2.5～10 μmのチューニング範囲でナノスケール赤外分光が可能になった。

初期の製品では、サンプルを赤外線透過性プリズムに取り付ける必要があり、赤外線は Dazziらの方法^{[注 3 ]}に従って下から照射されました。最適な動作のためには、この照明方式では、プリズムの表面に準備された、厚さが 1 μm 未満の薄いサンプルが必要でした^{[ 24 ]} 。2013 年、Anasys は、Hillらの研究^{[ 12 ] [ 28 ]}に基づいて、上面照明をサポートする AFM-IR 装置をリリースしました。赤外線透過性プリズム上にサンプルを準備する必要がなくなり、サンプルの厚さの制限が緩和されたことで、研究できるサンプルの範囲が大幅に拡大しました。Anasys Instruments の CEO は、大学に宛てた手紙の中で、この成果を「刺激的な大きな進歩」と呼び、EPSRC プロジェクト EP/C007751/1 の最終報告書に含めました^{[ 42 ]} 。UEA技術は、Anasys Instruments の主力製品となりました。

AFM を用いて熱膨張を測定することによって得られた最初の赤外線スペクトルは、プローブ カンチレバーに共鳴運動を誘発することなく Hammiche ら^{[ 6 ]}によって得られたものであることに注目すべきである。この初期の例では変調周波数が低すぎて高い空間分解能を達成できなかったが、原理的には共鳴挙動を解析または誘発することなく、より高い周波数で熱膨張を測定することを妨げるものは何もない。^{[ 1 ]}カンチレバーに沿った波のその後の伝播ではなく、チップの変位を測定するための可能なオプションには、チップが配置されているカンチレバーの端に焦点を合わせた干渉法、オフセット プローブによるねじり運動 (これは二次効果としてカンチレバーの動きによってのみ影響を受ける)、加熱された熱プローブからの信号が表面に対するチップの位置に強く影響されるという事実を利用することなどがあり、これにより共鳴に強く影響されない、または共鳴に依存しない熱膨張の測定が可能になる。非共鳴検出方法の利点は、任意の周波数の光変調を使用できるため、深度情報を制御された方法で取得できることである（下記参照）。一方、共鳴に依存する方法は高調波に限定される。Hammiche ら [ 1 ] の熱プローブベースの方法は、多数の^{アプリケーションが見つかっ}ている。^{[ 14 ] [ 28 ]}

^{熱プローブ[ 4 ]}と組み合わせたトップダウン照明によって可能になった独自のアプリケーションは、局所的な深さプロファイリング^{[ 28 ]}です。これは、DazziらのAFM-IR構成やHillらの構成では不可能ですが、後者はトップダウン照明を使用しています。熱プローブを使用してラインスキャン^{[ 4 ] [ 43 ]}と画像^{[ 28 ]}を取得できることが示されており、回折限界以下の空間分解能を達成でき^{[ 4 ]}、境界を区別するための分解能はケモメトリックス技術を使用して向上させることができます。^{[ 28 ] [ 43 ]}

これらの例すべてにおいて、各ピクセルについて中赤外域全体にわたるスペクトルが取得されます。これは、Dazzi らの方法またはHillらの方法のいずれかを使用した場合の AFM-IR の場合のように、単一波長の吸収を測定するよりもはるかに強力です。Reading と彼のグループは、熱プローブを加熱できるため、局所的な熱分析^{[ 4 ] [ 28 ] [ 29 ]}を単一のプローブを使用した光熱赤外分光法と組み合わせることができることを実証しました。このようにして、局所的な化学情報を、融点やガラス転移温度などの局所的な物理的特性で補完することができます。 ^{[ 29 ]}これにより、熱アシストナノサンプリングの概念が生まれました。^{[ 5 ] [ 28 ]この概念では、加熱された先端が局所的な熱分析実験を行い、その後、先端に付着したフェムトグラム[注 4 ]}までの軟化した材料をプローブとともに引き抜きます。^{[ 38 ]}この材料は、光熱赤外分光法やその他の技術によって操作および/または分析することができます。^{[ 5 ] [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ]}これにより、Dazzi らまたは Hill らのバージョンを使用した場合の AFM-IR で使用されるような従来の AFM プローブで達成できるものよりも、この種の SPM ベースの赤外装置の分析能力が大幅に向上します。

熱プローブ技術は、理論的には可能であるものの、熱膨張法が達成したナノスケールの空間分解能にはまだ達していません。そのためには、堅牢な熱プローブと高強度の光源が必要です。最近、Reading ら^{[ 40 ]}によって QCL と熱プローブを使用した最初の画像が得られました。良好な信号対雑音比により高速イメージングが可能になりましたが、サブミクロンの空間分解能は明確には実証されていません。理論的には、入射放射の強度の段階的変化に対する熱応答の初期部分にデータ解析を限定することで、空間分解能の改善が達成できると予測されています。このようにして、隣接領域からの測定の汚染を回避できます。つまり、測定ウィンドウを熱波の飛行時間の適切な割合に限定できます (応答のフーリエ解析を使用すると、高周波成分を使用することで同様の結果が得られます)。これは、プローブをレーザーと同期してタップすることで達成できます。同様に、非常に高速な変調を提供するレーザーは、熱拡散長をさらに短縮できます。

これまでの取り組みのほとんどは熱膨張測定に集中していましたが、これは変わる可能性があります。最近、真に堅牢な熱プローブが利用可能になり^{[ 48 ]}、広い周波数範囲で調整可能な手頃な価格の小型QCLも利用可能になりました。したがって、熱プローブ技術が熱膨張に基づく技術と同じくらい広く使用されるようになるのは時間の問題かもしれません。最終的には、モードを簡単に切り替えたり、単一のプローブを使用してそれらを組み合わせたりできる機器が確実に利用可能になるでしょう。たとえば、単一のプローブで温度と熱膨張の両方を測定できるようになるでしょう。

AFM-IRはナノスケール赤外分光法を可能にし、^{[ 52 ]}すなわち試料のナノスケール領域から赤外吸収スペクトルを取得する能力を持つ。

化学組成マッピング AFM-IR は、AFM チップの半径によってのみ制限される、空間分解能が約 10～20  nmまでの化学イメージングまたは組成マッピングを実行するためにも使用できます^{[ 18 ]}。この場合、調整可能な赤外線光源は、特定の分子共鳴、つまり特定の赤外線吸収帯に対応する単一の波長を放射します。位置の関数として AFM カンチレバーの振動振幅をマッピングすることにより、特定の化学成分の分布をマッピングできます。異なる吸収帯で組成マップを作成して、異なる化学種の分布を明らかにすることができます。

AFM-IR技術は、試料表面の機械的剛性と散逸の相補的な測定を同時に提供できます。試料が赤外光を吸収すると、結果として生じる急速な熱膨張により、AFMカンチレバーの「接触共振」が励起されます。これは、カンチレバーの特性と試料表面の剛性および減衰の両方から生じる結合共振です。具体的には、共振周波数は、より硬い材料ではより高い周波数に、より柔らかい材料ではより低い周波数にシフトします。さらに、散逸が大きい材料では共振が広くなります。これらの接触共振は、AFMコミュニティによって広く研究されています（たとえば、原子間力音響顕微鏡を参照）。従来の接触共振AFMでは、カンチレバーの接触共振を励起するために外部アクチュエータが必要です。AFM-IRでは、これらの接触共振は、試料が赤外パルスを吸収するたびに自動的に励起されます。したがって、AFM-IR技術は、カンチレバーの振動応答の振幅によって赤外吸収を測定し、接触共振周波数と品質係数によって試料の機械的特性を測定できます。^{[ 53 ]}

ポリマーブレンド、複合材料、多層フィルムおよび繊維 AFM-IR は、ブレンド中のポリマー成分の識別とマッピング^{[ 39 ]} 、複合材料の界面の特性評価^{[ 80 ]}、さらには多層フィルムのリバースエンジニアリング^{[ 15 ]}に使用されています。さらに、AFM-IR は、ポリ (3][4-エチレンジオキシチオフェン) (PEDOT) 導電性ポリマーの化学組成の研究^{[ 56 ]}、およびポリエチレンテレフタレート PET 繊維への蒸気浸透の研究^{[ 74 ]にも使用されています。}

タンパク質の化学的および構造的特性は、さまざまな生化学的プロセスにおける相互作用、ひいてはその機能を決定します。遺伝性タンパク質ミスフォールディング疾患である3型脊髄小脳失調症の原因となるアタキシン-3のジョセフィンドメインの凝集経路に関するRuggeriらの先駆的な研究^{[ 16 ]以来、AFM-IRはタンパク質および生命科学の幅広い応用分野で分子構造を特徴付けるために使用されてきました。 [ 81 ]}このアプローチにより、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症に関与するAβ42 ^{[ 17 ]} 、ハンチンチン^{[ 21 ]}、FUS ^{[ 53 ]}などの疾患関連タンパク質およびペプチドの挙動に関する新しいメカニズム的洞察が得られました。同様に、AFM-IRはタンパク質ベースの機能性生体材料の研究にも応用されています。^{[ 54 ]}

AFM-IRは、染色体^{[ 82 ]} 、細菌^{[ 59 ] [ 83 ] [ 84 ]}、細胞^{[ 60 ]}をナノスケールの分解能で分光的に詳細に特徴付けるために使用されてきました。たとえば、ウイルス^{[ 59 ]}（バクテリオファージ）による細菌の感染の場合、また、Rhodobacter capsulatus細胞内のポリヒドロキシ酪酸（PHB）小胞^{[ 58 ]}およびStreptomyces細菌内のトリグリセリド^{[ 46 ]} （バイオ燃料用途）の生産の場合です。AFM-IRはまた、骨のさまざまな吸収バンドの比率分析を介して、ミネラル含有量、結晶性、コラーゲン成熟度、酸性リン酸含有量を評価してマッピングするためにも使用されています。^{[ 66 ] AFM-IRはまた、ヒトの皮膚[ 75 ]} 、細胞^{[ 60 ]}、毛髪^{[ 76 ]}の構造脂質の分光法と化学マッピングを実行するためにも使用されています。

AFM-IRは、燃料電池のセパレーターとして使用される水和ナフィオン膜の研究に用いられてきた。測定により、ナフィオン表面上の自由水とイオン結合水の分布が明らかになった。^{[ 73 ]}

AFM-IRは、高濃度シリコン添加インジウムヒ素微粒子の表面プラズモン共鳴の研究に用いられてきた。^{[ 79 ]}金スプリットリング共振器は、表面増強赤外吸収分光法での使用について研究されてきた。この場合、AFM-IRは、100 nmの空間分解能でプラズモニック構造の局所電場増強（約30倍）を測定するために使用された。^{[ 69 ] [ 80 ]} 

AFM-IRは、薬物ポリマーブレンドの混和性および相分離の研究^{[ 67 ] [ 68 ]} 、直径90 nmのナノ結晶薬物粒子の化学分析^{[ 35 ]} 、染色体と化学療法薬の相互作用^{[ 82 ]} 、および神経変性を抑制するための薬理学的アプローチとアミロイドの相互作用の研究に使用されてきました。^{[ 17 ]}