免疫染色

組織切片の免疫組織化学染色（または免疫細胞化学染色、すなわち細胞の染色）は、おそらく最も一般的に用いられている免疫染色法である。^{[ 2 ]}初期の免疫組織化学染色では蛍光色素が用いられたが（免疫蛍光染色を参照）、現在ではペルオキシダーゼ（免疫ペルオキシダーゼ染色を参照）やアルカリホスファターゼなどの酵素を用いた非蛍光法が用いられている。これらの酵素は、光学顕微鏡で容易に検出できる着色生成物を生じる反応を触媒することができる。あるいは、放射性元素を標識として用い、オートラジオグラフィーによって免疫反応を可視化することもできる。^{[ 3 ]}

細胞形態と組織構造の保存には、組織の準備または固定が不可欠です。不適切な固定や長時間の固定は、抗体結合能を著しく低下させる可能性があります。多くの抗原は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片で正常に検出できます。しかし、一部の抗原は、中程度のアルデヒド固定でも生存しません。このような場合、組織は液体窒素で急速凍結し、クライオスタットで切断する必要があります。凍結切片の欠点としては、形態が劣ること、高倍率での解像度が低いこと、パラフィン切片の上で切断するのが難しいこと、凍結保存が必要なことなどが挙げられます。一方、ビブラトーム切片では、組織を有機溶媒や高温で処理する必要がないため、抗原性が破壊されたり、凍結融解によって組織が破壊されたりすることがありません。ビブラトーム切片の欠点は、切断プロセスが遅く、軟らかく固定が不十分な組織では困難であること、また、チャッターマークやビブラトームラインが切片によく見られることです。

多くの抗原の検出は、固定によって形成されたタンパク質の架橋の一部を切断して隠れた抗原部位を明らかにする抗原賦活化法によって劇的に改善される。これは、さまざまな時間加熱することによって（熱誘導エピトープ賦活化またはHIER）、または酵素消化によって（タンパク質分解誘導エピトープ賦活化またはPIER）達成できる。^{[ 4 ]}

免疫組織化学染色における主な課題の一つは、特異的または非特異的なバックグラウンドを克服することです。固定方法と固定時間の最適化、ブロッキング剤による前処理、高塩濃度での抗体インキュベーション、抗体処理後の洗浄バッファーと洗浄時間の最適化は、いずれも高品質な免疫染色​​を得るために重要です。さらに、染色における陽性対照と陰性対照の両方の存在は、特異性を判断するために不可欠です。

フローサイトメーターは、 1つまたは複数の特定のタンパク質を発現する細胞を直接分析するために使用できる。細胞は、免疫蛍光染色と同様の方法を用いて溶液中で免疫染色され、その後フローサイトメトリーによって分析される。

フローサイトメトリーは、免疫組織化学に比べていくつかの利点があります。例えば、細胞の大きさや粒度によって異なる細胞集団を定義できること、死細胞を除外できること、感度が向上していること、複数の抗原を同時に測定できる多色分析が挙げられます。しかし、フローサイトメトリーは極めてまれな細胞集団の検出には効果が低く、組織切片がない場合は構造的な関係が失われます。^{[ 5 ]}また、フローサイトメトリーには、フローサイトメーターの購入に伴う高額な初期費用がかかります。

ウェスタンブロッティング法は、細胞や組織から抽出した特定のタンパク質を、精製前または精製後に検出できる手法です。タンパク質は通常、ゲル電気泳動によってサイズ別に分離され、その後、ドライブロッティング法、セミドライブロッティング法、またはウェットブロッティング法を用いて合成膜に転写されます。膜は、免疫組織化学と同様の方法で抗体を用いてプローブされますが、固定は不要です。検出は通常、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いて化学発光反応を触媒することで行われます。

ウェスタンブロッティングは、抽出物間のタンパク質レベルを半定量的に比較するために用いられる、一般的な分子生物学的手法である。ブロッティング前のサイズ分離により、既知の分子量マーカーと比較してタンパク質の分子量を測定することが可能となる。

酵素免疫測定法（ELISA）は、マルチウェルプレート（通常1プレートあたり96ウェル）を用いて、血漿、血清、または細胞／組織抽出物中のタンパク質濃度を定量的または半定量的に測定する診断法です。一般的に、溶液中のタンパク質はELISAプレートに吸着されます。目的のタンパク質に特異的な抗体を用いてプレートをプローブします。ブロッキングおよび洗浄方法を最適化することでバックグラウンドを最小限に抑え（免疫組織化学染色と同様）、陽性対照および陰性対照を用いることで特異性を確保します。検出方法は通常、比色法または化学発光法に基づいています。

電子顕微鏡（EM）は、組織や細胞の微細構造を詳細に研究するために使用できます。免疫電子顕微鏡（Immuno-EM）は、超薄切片組織中の特定のタンパク質を検出することを可能にします。重金属粒子（金など）で標識された抗体は、透過型電子顕微鏡を使用して直接可視化できます。免疫電子顕微鏡は、タンパク質の細胞内局在を検出するのに強力ですが、技術的に難しく、高価であり、組織の固定および処理方法の厳密な最適化が必要です。生体内でのタンパク質ビオチン化は 、抗体染色と細胞形態をよりよく保存する固定プロトコルとの頻繁な不適合によって引き起こされる問題を軽減するために提案されました。^{[ 6 ]}