Microscopy

Microscopy is the technical field of using microscopes to view subjects too small to be seen with the naked eye (objects that are not within the resolution range of the normal eye).^[1] There are three well-known branches of microscopy: optical, electron, and scanning probe microscopy, along with the emerging field of X-ray microscopy.^[2]

Optical microscopy and electron microscopy involve the diffraction, reflection, or refraction of electromagnetic radiation/electron beams interacting with the specimen, and the collection of the scattered radiation or another signal in order to create an image. This process may be carried out by wide-field irradiation of the sample (for example standard light microscopy and transmission electron microscopy) or by scanning a fine beam over the sample (for example confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy). Scanning probe microscopy involves the interaction of a scanning probe with the surface of the object of interest. The development of microscopy revolutionized biology, gave rise to the field of histology and so remains an essential technique in the life and physical sciences. X-ray microscopy is three-dimensional and non-destructive, allowing for repeated imaging of the same sample for in situ or 4D studies, and providing the ability to "see inside" the sample being studied before sacrificing it to higher resolution techniques. A 3D X-ray microscope uses the technique of computed tomography (microCT), rotating the sample 360 degrees and reconstructing the images. CT is typically carried out with a flat panel display. A 3D X-ray microscope employs a range of objectives, e.g., from 4X to 40X, and can also include a flat panel.

The field of microscopy (optical microscopy) dates back to at least the 17th-century. Earlier microscopes, single lensmagnifying glasses with limited magnification, date at least as far back as the wide spread use of lenses in eyeglasses in the 13th century^[3] but more advanced compound microscopes first appeared in Europe around 1620^[4][5] The earliest practitioners of microscopy include Galileo Galilei, who found in 1610 that he could close focus his telescope to view small objects close up^[6][7] and Cornelis Drebbel, who may have invented the compound microscope around 1620.^[8][9]Antonie van Leeuwenhoek developed a very high magnification simple microscope in the 1670s and is often considered to be the first acknowledged microscopist and microbiologist.^[10][11]

Optical or light microscopy involves passing visible light transmitted through or reflected from the sample through a single lens or multiple lenses to allow a magnified view of the sample.^[12] The resulting image can be detected directly by the eye, imaged on a photographic plate, or captured digitally. The single lens with its attachments, or the system of lenses and imaging equipment, along with the appropriate lighting equipment, sample stage, and support, makes up the basic light microscope. The most recent development is the digital microscope, which uses a CCD camera to focus on the exhibit of interest. The image is shown on a computer screen, so eye-pieces are unnecessary.^[13]

テクニック

試料のコントラストを向上させたり、試料内の構造を強調したりするには、特別な技術を用いる必要があります。コントラストを高めたり、試料に標識を付けたりするための顕微鏡技術は数多く存在します。

• ティッシュペーパーのサンプルにコントラストを生成するために使用される透過照明技術の4つの例。1.559 μm/ピクセル。
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  明視野照明では、試料のコントラストは試料による光の吸収によって生じる。
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  交差偏光照明では、試料のコントラストは偏光が試料を通過する際の回転によって生じる。
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  暗視野照明では、試料のコントラストは試料によって散乱された光から生じる。
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  位相差照明では、試料のコントラストは、試料を通過する光路長の異なる光が干渉することによって生じる。

明視野

明視野顕微鏡法は、あらゆる光顕微鏡法の中で最もシンプルな方法です。試料は透過白色光で照明され、下から照射されて上から観察されます。欠点としては、ほとんどの生物試料のコントラストが低いこと、焦点が合っていない部分のぼやけによって見かけ上の解像度が低くなることが挙げられます。しかし、この手法の簡便さと、試料の前処理が最小限で済むことが大きな利点です。

斜め照明

斜め（側面）からの照明を用いることで、画像に立体感を与え、通常は見えない特徴を強調することができる。この方法に基づいたより新しい技術として、細胞培養用の倒立顕微鏡に搭載されているホフマン変調コントラスト法がある。斜め照明は透明な標本でもコントラストを高めるが、光が軸外から入射するため、焦点を変えると対象物の位置がずれて見える。この制約により、光学的断層撮影やz軸方向の精密測定といった技術は不可能となる。

暗視野

暗視野顕微鏡は、染色されていない透明な標本のコントラストを向上させる技術です。^{[ 18 ]}暗視野照明では、慎重に調整された光源を使用して、画像面に入る直接透過光（散乱されていない光）の量を最小限に抑え、サンプルによって散乱された光のみを収集します。暗視野は、特に透明な物体の画像コントラストを劇的に向上させることができ、装置のセットアップやサンプルの準備はほとんど必要ありません。しかし、この技術は、多くの生物学的サンプルの最終画像で光強度が低いという問題があり、見かけ上の解像度が低いという影響を受け続けています。

ラインベルク照明は暗視野照明の一種で、コンデンサーの直前に透明なカラーフィルターを挿入することで、高開口時の光線と低開口時の光線が異なる色になる（つまり、標本の背景は青く見え、対象物は自発光する赤く見える）。他の色の組み合わせも可能だが、その効果はかなりばらつきがある。^{[ 19 ]}

分散染色

分散染色法は、無色の物体を着色した画像にする光学技術です。これは光学染色法であり、着色効果を得るために染色剤や染料は必要ありません。分散染色法には、5種類の顕微鏡構成が用いられます。それらは、明視野ベッケ線、斜視、暗視野、位相差、対物レンズストップ分散染色です。

位相差

電子顕微鏡における位相差イメージング

より高度な技術では、光学的密度の比例的な違いが示されます。位相差は、屈折率の違いをコントラストの違いとして示す広く使用されている技術です。これは、1930年代にオランダの物理学者フリッツ・ゼルニケによって開発されました（彼は1953年にノーベル賞を受賞しました）。たとえば、細胞の核は、周囲の細胞質に対して暗く見えます。コントラストは優れていますが、厚い物体には適していません。小さな物体でもハローが形成されることが多く、詳細が不明瞭になります。このシステムは、コンデンサー内の円形の環状部で構成されており、光の円錐を生成します。この円錐は、位相対物レンズ内の同じサイズのリングに重ね合わされます。すべての対物レンズは異なるサイズのリングを持っているため、すべての対物レンズに対して別のコンデンサー設定を選択する必要があります。対物レンズ内のリングは特別な光学特性を持っています。まず、直接光の強度を減少させますが、より重要なのは、約1/4波長の人工的な位相差を作り出すことです。直接光の物理的性質が変化すると、回折光との干渉が生じ、位相差像が得られます。位相差顕微鏡の欠点の1つは、ハロー（光の輪）の形成です。

微分干渉コントラスト

干渉コントラスト法を用いると、より優れた、そしてはるかに高価な結果が得られます。光学的密度の違いは、レリーフの違いとして現れます。ジョルジュ・ノマルスキーによれば、最もよく用いられる微分干渉コントラスト法では、細胞内の核は球状として現れます。ただし、これは光学的な効果であり、レリーフが必ずしも実際の形状に似ているとは限らないことに留意する必要があります。コントラストは非常に良好で、コンデンサー絞りを全開にできるため、被写界深度を浅くして解像度を最大化できます。

このシステムは、コンデンサー内に特殊なプリズム（ノマルスキープリズム、ウォラストンプリズム）を備えており、光を常光線と異常光線に分割します。2つの光線の空間的な差は最小限（対物レンズの最大解像度よりも小さい）です。試料を通過した後、光線は対物レンズ内の同様のプリズムによって再び合流されます。

均質な試料では、2つの光線に差はなく、コントラストは生じません。しかし、屈折境界（例えば細胞質内の核）付近では、常光線と異常光線の差によって像に凹凸が生じます。微分干渉コントラストを得るには偏光光源が必要であり、光路には2つの偏光フィルターを取り付ける必要があります。1つはコンデンサーの下（偏光子）、もう1つは対物レンズの上（検光子）に配置します。

注：顕微鏡の光学設計により2つのビームが横方向に大きく分離する場合、古典的な干渉顕微鏡法となり、レリーフ像は得られませんが、それでも微小物体の質量厚さを定量的に測定するために使用できます。

干渉反射

干渉を利用した別の手法として、干渉反射顕微鏡法（反射干渉コントラスト法、RICとも呼ばれる）がある。これは、細胞がスライドガラスに付着することで干渉信号が生じる仕組みである。ガラスに細胞が付着していなければ、干渉は発生しない。

干渉反射顕微鏡は、DICで使用されるものと同じ要素を用いますが、プリズムは使用しません。また、検出される光は、DICの場合とは異なり、透過光ではなく反射光です。

蛍光

特定の化合物に高エネルギーの光を照射すると、より低い周波数の光を放出します。この現象は蛍光として知られています。多くの場合、試料はその化学組成に基づいて、特徴的な自家蛍光像を示します。

この方法は、極めて高感度で単一分子の検出も可能なため、現代の生命科学において非常に重要です。構造物や化合物の染色には、多くの蛍光色素が用いられます。免疫染色のように、抗体と蛍光色素を組み合わせる方法は、強力な手法の一つです。一般的に用いられる蛍光色素の例としては、フルオレセインやローダミンなどが挙げられます。

抗体は特定の化合物に合わせて特注することができる。例えば、よく用いられる手法の一つに、遺伝暗号（DNA）に基づいてタンパク質を人工的に作製する方法がある。これらのタンパク質を用いてウサギを免疫すると、そのタンパク質に結合する抗体が生成される。その後、抗体は化学的に蛍光色素と結合され、研究対象の細胞内のタンパク質を追跡するために使用される。

緑色蛍光タンパク質（GFP）などの高効率蛍光タンパク質は、分子生物学的手法である遺伝子融合を用いて開発されました。遺伝子融合とは、蛍光化合物の発現を標的タンパク質の発現に連結させるプロセスです。この結合型蛍光タンパク質は、一般的に生物に対して無毒であり、研究対象タンパク質の機能にほとんど影響を与えません。遺伝子改変された細胞や生物は、蛍光標識されたタンパク質を直接発現するため、生体内で元のタンパク質の機能を研究することが可能になります。

タンパク質結晶の成長により、タンパク質結晶と塩結晶の両方が生成されます。どちらも無色で微細です。タンパク質結晶の回収にはイメージングが必要であり、これはタンパク質の固有蛍光または透過型顕微鏡を使用して行うことができます。タンパク質は280  nmの光を吸収するため、どちらの方法も紫外線顕微鏡が必要です。タンパク質は280 nmの光で励起されると、約353  nmで蛍光を発します 。^{[ 20 ]}

蛍光発光は励起光とは波長（色）が異なるため、理想的な蛍光画像では、蛍光色素で標識された目的の構造のみが映し出されます。この高い特異性により、蛍光顕微鏡は生物医学研究において広く利用されるようになりました。異なる蛍光色素を用いて様々な生物学的構造を染色することで、色素の色の違いによる特異性を保ちながら、それらを同時に検出することが可能です。

励起光が観察者や検出器に到達しないようにするには、高品質のフィルターセットが必要です。これらは通常、励起波長範囲を選択する励起フィルター、ダイクロイックミラー、および励起光を遮断する発光フィルターで構成されます。ほとんどの蛍光顕微鏡は、検出器に入る励起光の量をさらに減らすために、落射照明モード（試料の片側から照明と検出を行う）で動作します。

関連項目： 全反射蛍光顕微鏡、神経科学

共焦点

共焦点レーザー走査顕微鏡は、集束されたレーザービーム（例えば488  nm）を試料上で走査し、点ごとに蛍光を励起します。放出された光はピンホールを通して検出器（通常は光電子増倍管）に到達しないようにします。画像はコンピュータ上で構築され、励起レーザーの位置に応じて測定された蛍光強度がプロットされます。試料全体を照射する場合と比較して、共焦点顕微鏡は横方向の解像度がわずかに高く、光学的断層撮影（軸方向の解像度）が大幅に向上します。そのため、共焦点顕微鏡は3D構造が重要な場合によく使用されます。

共焦点顕微鏡の一種であるスピニングディスク顕微鏡は、試料上の複数の点を同時に走査することができます。ピンホールを備えたディスクが、焦点外の光を除去します。スピニングディスク顕微鏡の光検出器はデジタルカメラであり、一般的にはEM-CCDまたはsCMOSが使用されます。

二光子顕微鏡

二光子顕微鏡もレーザースキャン顕微鏡の一種ですが、励起には紫外線、青色、緑色のレーザー光ではなく、パルス赤外線レーザーが使用されます。レーザーのごく小さな焦点でのみ強度が十分に高くなり、二光子励起によって蛍光が生成されるため、焦点外蛍光は生成されず、画像をクリーンアップするためのピンホールも不要です。^{[ 21 ]}これにより、共焦点顕微鏡では光子を効率的に収集できない散乱組織の深部をイメージングできます。^{[ 22 ]}広視野検出を備えた二光子顕微鏡は、脳組織のカルシウムイメージングなどの機能イメージングによく使用されます。 ^{[ 23 ]}いくつかの企業ではマルチフォトン顕微鏡として販売されていますが、二光子励起の代わりに三光子励起を使用することによる利点はわずかです。

単面照明顕微鏡法およびライトシート蛍光顕微鏡法

円筒レンズを通して狭い角度で光を集光することによって形成される光面、または対物レンズの軸に垂直な平面で光線を走査することによって形成される光面を使用することで、高解像度の光学断面を取得できます。^{[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]}単一平面照明、またはライトシート照明は、複数のプリズムビームエキスパンダーを組み込んだビーム整形技術を使用しても実現されます。^{[ 27 ] [ 28 ]}画像はCCDでキャプチャされます。これらのバリアントにより、非常に高速で高信号対雑音比の画像キャプチャが可能になります。

広視野多光子顕微鏡

広視野多光子顕微鏡^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]}は、走査を必要とせずに対象物の広い領域を照明して画像化する光学的非線形イメージング技術を指します。二光子蛍光や第二高調波発生などの非線形光学プロセスを誘起するには、高強度が必要です。走査型多光子顕微鏡では、光を強く集束させることで高強度を実現し、ビーム走査によって画像を取得します。広視野多光子顕微鏡では、広い視野 (~100 μm) を得るために、光増幅パルスレーザー光源を使用することで高強度を最適に実現します 。^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]}この場合、画像は走査を必要とせずに CCD カメラで単一フレームとして取得されるため、この技術は対象物全体にわたる動的プロセスを同時に可視化するのに特に役立ちます。広視野多光子顕微鏡では、フレームレートを多光子走査顕微鏡と比較して最大1000倍まで上げることができます。^{[ 30 ]}しかし、散乱組織では、画像品質は深さが増すにつれて急速に劣化します。

デコンボリューション

蛍光顕微鏡は、複雑な環境下で特定の標識構造を可視化し、生物構造の三次元情報を提供する強力な技術です。しかし、蛍光標識された構造は、焦点が合っているか否かに関わらず、照射されるとすべて発光するため、得られる情報はぼやけてしまいます。そのため、特定の構造の画像は、焦点が合っていない構造からの光の影響で常にぼやけてしまいます。この現象は、特に高分解能の対物レンズ、例えば開口数の高い油浸対物レンズを使用する場合に、コントラストの低下を招きます。

しかし、ぼやけは光散乱などのランダムなプロセスによって引き起こされるのではなく、顕微鏡イメージングシステムにおける画像形成の光学特性によって明確に定義できます。小さな蛍光光源（本質的には明るい点）を考えると、その点から発せられる光は、点が焦点から外れるにつれて、私たちの視点から見てさらに広がります。理想的な条件下では、これにより、この点光源は3次元（軸方向）で「砂時計」のような形状になります。この形状は、顕微鏡イメージングシステムの点像分布関数（PSF）と呼ばれます。蛍光画像はこのような小さな蛍光光源の多数から構成されているため、画像は「点像分布関数によって畳み込まれた」ものと言えます。テラヘルツレーザーパルスイメージングシステムの数学的にモデル化されたPSFを右に示します。

画像システムの出力は、次の式を用いて表すことができる。

${\displaystyle s(x,y)=PSF(x,y)*o(x,y)+n}$

ここでnは加算ノイズです。^{[ 34 ]}この点像分布関数^{[ 35 ]}がわかっているということは、デコンボリューション顕微鏡法として一般的に知られているコンピュータベースの方法によって、このプロセスをある程度逆算できることを意味します。^{[ 36 ]} 2D または 3D デコンボリューションにはさまざまなアルゴリズムが利用可能です。これらは、非復元法と復元法に大まかに分類できます。非復元法は焦点面から焦点外の光を除去することでコントラストを改善できますが、復元法だけが実際に光をその適切な発生源に再割り当てできます。このように蛍光画像を処理すると、共焦点顕微鏡からの画像のように焦点外の光なしで画像を直接取得するよりも有利になる場合があります。なぜなら、そうでなければ除去される光信号が有用な情報になるからです。3D デコンボリューションの場合、通常は異なる焦点面から取得した一連の画像 (Z スタックと呼ばれる) と PSF の知識が提供されます。PSF は、実験的に、または顕微鏡のすべての寄与パラメータを知ることによって理論的に導出できます。

サブ回折技術

近年、回折限界を克服する数多くの超解像顕微鏡技術が開発されてきた。

これは主に、十分に静止したサンプルを複数回撮影し、励起光を変更するか、画像内の確率的変化を観察することによって実現されます。前節で説明した、PSF によるぼけを除去し、光の数学的に「正しい」起源を割り当てるデコンボリューション法が使用されますが、ピクセル値の意味については若干異なる理解に基づいています。ほとんどの場合、1 つの蛍光色素が 1 つの撮影画像上の 1 つのブロブに寄与すると仮定すると、画像内のブロブを計算された位置に置き換えることができ、解像度を回折限界をはるかに下回るレベルまで大幅に向上させることができます。

このような仮定を実現するには、蛍光体の光物理学に関する知識と化学的制御がこれらの技術の中核であり、それによって約20ナノメートルの解像度が得られます。^{[ 37 ] [ 38 ]}

回折限界以下の顕微鏡が発明されるまでは、光の波長が従来の顕微鏡の解像度を約0.2マイクロメートルに制限していた。より高い解像度を得るために、電子顕微鏡でははるかに波長の短い電子ビームが用いられるようになった。

• 透過型電子顕微鏡（TEM）は、試料の非常に薄い切片に電子ビームを照射することで観察を行う点で、複合光学顕微鏡と非常によく似ています。2005年時点での分解能限界は約0.05ナノメートルでしたが、それ以降、目立った進歩は見られません。
• 走査型電子顕微鏡（SEM）は、試料表面の細部を可視化し、非常に鮮明な3D像を提供します。実体顕微鏡とよく似た結果が得られます。2011年時点でのSEMの最高解像度は0.4ナノメートルでした。

X線分光法に対応した電子顕微鏡は、定性的および定量的な元素分析を行うことができます。分析用電子顕微鏡としても知られるこのタイプの電子顕微鏡は、ナノ材料の研究に非常に強力なツールとなり得ます。^{[ 41 ]}

これは回折限界以下の技術です。走査型プローブ顕微鏡の例としては、原子間力顕微鏡（AFM）、走査型トンネル顕微鏡、光子力顕微鏡、リカレンストラッキング顕微鏡などがあります。これらの方法はすべて、固体プローブ先端の物理的な接触を利用して、ほぼ平坦であると想定される物体の表面を走査します。

紫外線顕微鏡には主に2つの用途があります。1つ目は、紫外線の電磁エネルギーの短い波長を利用して、標準的な光学顕微鏡の回折限界を超える画像解像度を実現することです。この技術は、現代の半導体などに見られるような非常に小さな構造を持つデバイスの非破壊検査に用いられます。UV顕微鏡の2つ目の用途はコントラスト強調です。これは、光と試料内の分子との相互作用により、個々の試料の応答が周囲と比較して強調される現象です。例えば、タンパク質結晶の成長が挙げられます。タンパク質結晶は塩溶液中で形成されます。成長過程では塩結晶とタンパク質結晶の両方が形成され、どちらも一般的に人間の目には透明であるため、標準的な光学顕微鏡では区別できません。タンパク質のトリプトファンは280 nmの光を吸収するため、280 nmバンドパスフィルターを備えたUV顕微鏡で観察すると、2種類の結晶を簡単に区別できます。タンパク質結晶は暗く見え、塩結晶は透明に見えます。  

赤外線顕微鏡法とは、赤外線波長で行われる顕微鏡法を指します。典型的な装置構成では、フーリエ変換赤外分光計（FTIR）が光学顕微鏡および赤外線検出器と組み合わされています。赤外線検出器は、単一点検出器、線形アレイ、または2D焦点面アレイのいずれかです。FTIRは、赤外分光法による化学分析を実行する機能を提供し、顕微鏡と点またはアレイ検出器により、この化学分析を空間的に分解、つまりサンプルの異なる領域で実行できます。そのため、この技術は赤外線マイクロ分光法とも呼ばれます^{[ 42 ] [ 43 ]。}レーザー直接赤外線（LDIR）イメージング と呼ばれる別のアーキテクチャでは、可変赤外線光源と飛行対物レンズ上の単一点検出器が組み合わされています。この技術は、赤外線化学イメージングによく使用され、画像のコントラストは、ユーザーが選択した特定のIR波長（通常は特定のIR吸収帯と関連する分子共鳴）に対する個々のサンプル領域の応答によって決定されます。従来の赤外マイクロ分光法の重要な限界は、空間分解能が回折限界によって制限される点である。具体的には、空間分解能は光の波長に関連する数値に制限される。実用的な赤外顕微鏡の場合、空間分解能は使用する技術や装置によって異なるが、波長の1～3倍に制限される。中赤外波長域では、これにより実用的な空間分解能の限界は3～30μm程度となる。

IR サブ回折顕微鏡も存在します。^{[ 42 ] [ 43 ]}これらには、IR近接場走査型光学顕微鏡 (NSOM)、^{[ 44 ]}光熱マイクロ分光法、原子間力顕微鏡ベースの赤外分光法 (AFM-IR)、散乱型走査近接場光学顕微鏡 (s-SNOM) ^{[ 45 ]}およびナノ FTIR が含まれ、これらは IR 波長でナノスケールの空間分解能を提供します。

デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）では、コヒーレント（単色）光源からの干渉波面がセンサー上に記録されます。記録されたホログラムから、コンピューターによって画像がデジタル的に再構成されます。通常の明視野像に加えて、位相シフト像も生成されます。

DHMは反射モードと透過モードの両方で動作可能です。反射モードでは、位相シフト画像から相対的な距離が測定され、反射面の地形図として表されます。透過モードでは、位相シフト画像から標本の光学的厚さをラベルフリーで定量的に測定できます。生物細胞の位相シフト画像は染色された細胞の画像と非常によく似ており、高コンテンツ解析ソフトウェアによる解析に成功しています。

DHMのユニークな特徴の一つは、ホログラムによって全ての焦点面が同時に記録されるため、画像記録後に焦点を調整できることです。この機能により、体積内の移動する粒子を画像化したり、表面を高速スキャンしたりすることが可能になります。また、ソフトウェアによる光学収差補正によって低コストの光学系を使用できることも、DHMの魅力的な特徴の一つです。

デジタル病理学とは、コンピュータ技術によって実現された画像ベースの情報環境であり、デジタルスライドから生成された情報の管理を可能にするものです。デジタル病理学は、仮想顕微鏡検査によって部分的に実現されています。仮想顕微鏡検査とは、ガラススライドをデジタルスライドに変換し、閲覧、管理、分析できるようにする技術です。

レーザー顕微鏡は、さまざまな形態の顕微鏡でレーザー照明光源を使用する急速に成長している分野です。^{[ 46 ]}例えば、生物学的応用を目的としたレーザー顕微鏡では、非線形顕微鏡、飽和顕微鏡、二光子励起顕微鏡と呼ばれる多くの技術で超短パルスレーザーが使用されます。^{[ 47 ]}

高強度短パルス実験室用X線レーザーは、数年前から開発が進められています。この技術が実用化されれば、生体内の基本的な生物学的構造を、正確に定義された瞬間に拡大した3次元画像として取得することが可能になります。水とタンパク質の最適なコントラスト、および最高の感度と解像度を得るには、レーザーを窒素線付近の約0.3ナノメートルに調整する必要があります。解像度は、必要な数の光子が記録されている間に発生する流体力学的膨張によって主に制限されます。^{[ 48 ]}したがって、試料は照射によって破壊されますが、爆発する前にその形状を捉えることができます。^{[ 49 ] [ 50 ] [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] [ 54 ]}

適切なレーザーの開発が長期間に及んでいるにもかかわらず、科学者たちはX線ホログラフィック顕微鏡の実用的な設計とプロトタイプの開発に取り組んできた。^{[ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ] [ 61 ] [ 62 ]}

光音響効果を利用した顕微鏡技術^{[ 63 ]}、すなわち光吸収によって生じる（超音波）音の発生を利用する。集束され強度変調されたレーザービームをサンプル上でラスタースキャンする。発生した（超音波）音は超音波トランスデューサによって検出される。一般的に圧電式超音波トランスデューサが使用される^{[ 64 ] 。}

画像のコントラストは試料の吸収係数に関係している。${\displaystyle \alpha }$これは、透過率や散乱によって画像コントラストが決まる明視野顕微鏡や暗視野顕微鏡とは対照的です。原理的には、蛍光顕微鏡のコントラストも試料の吸収率に比例します。しかし、蛍光顕微鏡では蛍光量子収率が$\displaystyle \eta _{fl}}$信号を検出するためには、ゼロ以外でなければならない。しかし、光音響顕微鏡では、すべての吸収物質が光音響信号を発する。${\displaystyle PA}$これは

${\displaystyle PA\propto \alpha *\Gamma *((1-\eta _{fl})*E_{g}+(E_{laser}-E_{g}))}$

ここ${\displaystyle \Gamma }$ はグリューナイゼン係数です。${\displaystyle E_{laser}}$レーザーの光子エネルギーと${\displaystyle E_{g}}$は試料のバンドギャップエネルギーです。したがって、光音響顕微鏡は蛍光顕微鏡の補完的な技術として非常に適していると考えられます。なぜなら、蛍光量子収率が高いと蛍光信号が高くなり、蛍光量子収率が低いと光音響信号が高くなるからです。

非線形効果を無視すると、横方向分解能dxはアッベの回折限界によって制限される。

${\displaystyle dx=\lambda /(2*NA)}$

どこ${\displaystyle \lambda }$は励起レーザーの波長、NAは対物レンズの開口数です。入射波面が平行であれば、アッベの回折限界が成り立ちます。しかし実際には、レーザービームのプロファイルはガウス型です。したがって、達成可能な解像度を計算するには、切り捨てガウスビームの式を使用する必要があります。^{[ 65 ]}

アマチュア顕微鏡観察とは、生物標本や非生物標本を趣味として調査・観察することです。鉱物、昆虫、貝殻、植物などの収集家は、収集した標本を分類するのに役立つ特徴を明らかにするツールとして顕微鏡を使用することがあります。また、池の水やその他の標本に見られる生物の観察に興味を持つアマチュアもいます。家庭用水槽を飼育している人にとっては、水質評価にも顕微鏡が役立つでしょう。顕微鏡画像の撮影やスケッチも楽しみの一つです。顕微鏡写真の芸術性を競うコンテストも開催されています。この趣味を楽しむ人は、市販の顕微鏡用プレパラートを使用することも、自分でプレパラートを作成することもできます。

顕微鏡観察は生物標本の記録において中心的な役割を果たすツールですが、顕微鏡観察のみに基づいて新種の記載を正当化するには不十分な場合が少なくありません。新種の発見を確認するには、遺伝子検査や生化学検査が必要となることがよくあります。研究室と学術文献へのアクセスは不可欠です。しかし、アマチュアにはプロにはない利点が一つあります。それは、周囲を探索する時間があることです。熟練したアマチュアは、発見を検証し、場合によっては新種を記載するために、プロと協力することがよくあります。

1800年代後半、アマチュア顕微鏡観察はアメリカとヨーロッパで人気の趣味となった。日曜の午後の暇つぶしとして、何人かの「プロのアマチュア」が、慈善家から標本採取旅行や顕微鏡観察の報酬を受け取っていた（例えば、珪藻類の専門家A.グルノーは、ベルギーの実業家などから報酬を受け取っていた）。ジョン・フィン教授は『顕微鏡の選択と使用に関する実践的ヒント（第2版、1878年）』を出版し、『アメリカ顕微鏡学ジャーナル』の編集者も務めた。

アマチュアが撮影した顕微鏡画像の例：

• 
  「家蜂」口 100倍
• 
  米の茎 cs 400X
• 
  ウサギの精巣 100倍
• 
  シダ植物のプロタリウム 400倍

顕微鏡は法医学にも応用されています。^{[ 66 ]}顕微鏡は、多くの場合、改変や破壊をすることなく、最小の証拠品を検出、解像、画像化することができます。顕微鏡は、繊維、毛髪、土壌、塵などを識別および比較するために使用されます。

インク痕、血痕、弾丸などの場合は、試料の前処理は不要で、顕微鏡検査で直接証拠が確認できます。特定の物質の痕跡については、顕微鏡検査を行う前に試料の前処理が必要です。

光学顕微鏡は法医学で最もよく使われており、光子を使って画像を形成します。法医学試料の検査に最も適した顕微鏡は次のとおりです。^{[ 67 ]}

1. 複合顕微鏡

2. 比較顕微鏡

3. 実体顕微鏡

4. 偏光顕微鏡

5. マイクロ分光光度計

法医学用途における顕微鏡の種類が多様である主な理由は、その倍率範囲にあり、光学顕微鏡、SEM、TEMではそれぞれ(1～1200倍)、(50～30,000倍)、(500～250,000倍)となっている。^{[ 67 ]}