抗生物質感受性試験

抗生物質感受性試験または抗生物質感受性検査は、細菌の抗生物質に対する感受性を測定するものです。細菌は一部の抗生物質に対して耐性を持っている可能性があるため、この検査が行われます。感受性検査の結果により、臨床医は、感染部位と一般的な原因菌に関する臨床的疑いに基づいて抗生物質を選択する経験的治療から、病原体とその感受性に関する知識に基づいて抗生物質を選択する指向的治療へと、抗生物質の選択を変更することができます。^{[ 1 ]}

感受性試験は通常、医療検査室で行われ、細菌を抗生物質に曝露させる培養法、または細菌が耐性を付与する遺伝子を持っているかどうかを検査する遺伝子法が用いられます。培養法では、細菌を均一に接種した寒天培地上の抗生物質を含むペーパーディスクの周囲に細菌の増殖がない領域（阻止円）の直径を測定することがよくあります。最小発育阻止濃度（MIC）、つまり細菌の増殖を阻害する抗生物質の最低濃度は、標準化されたガイドラインを使用して阻止円の大きさから推定できます。^{[ 2 ]}

抗生物質感受性試験は、β-ラクタム系抗生物質であるペニシリンの発見以来必要とされてきた。初期の方法は表現型に基づくもので、培養または希釈法が用いられていた。抗生物質を含浸させたストリップであるEテストは1980年代から利用可能となり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）検査などの遺伝子検査法は2000年代初頭から利用可能となった。現在も、既存の方法をより迅速またはより正確に改良するとともに、マイクロ流体技術などの新しい検査法の開発に向けた研究が続けられている。

臨床医学では、抗生物質は患者の症状と医療ガイドラインに基づいて処方されることが最も多い。この抗生物質の選択方法は経験的治療と呼ばれ、^{[ 1 ]}感染症を引き起こす細菌の種類と、細菌がどの抗生物質に感受性または耐性を示すかについての知識に基づいている。^{[ 1 ]}加重発生率症候群併用抗生物質感受性検査（WISCA）は、局所的な病原体の発生率を感受性データに対して加重することでこれを拡張し、単剤または併用療法の症候群レベルのカバー率を推定する。^{[ 3 ]}

例えば、単純な尿路感染症はトリメトプリム/スルファメトキサゾールで治療されることがある。^{[ 4 ]}これは、大腸菌が最も可能性の高い原因菌であり、この組み合わせの抗生物質に感受性がある可能性があるためである。^{[ 4 ]}しかし、細菌はいくつかの種類の抗生物質に対して耐性を持つことがある。^{[ 4 ]}この耐性は、ある種の細菌が特定の抗生物質に対して固有の耐性を持っているため、^{[ 4 ]}過去に抗生物質に曝露された後に耐性を獲得したため、^{[ 4 ]}またはプラスミドなどの他の供給源から耐性が伝達されたためである可能性がある。^{[ 5 ]}抗生物質感受性試験は、どの抗生物質がより効果的である可能性が高いか、したがって感染症の治療に使用すべきかについての情報を提供する。^{[ 1 ]}

抗生物質感受性試験は、一部の国ではスクリーニングの一形態として集団レベルでも実施されています。^{[ 6 ]}これは、抗生物質耐性の背景率（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）を評価するためであり、ガイドラインや公衆衛生対策に影響を与える可能性があります。^{[ 6 ]} R用のAMR パッケージなどのオープンソースツールは、このような集団レベルの表現型感受性データを標準化し、国際的なブレークポイントと比較して分析するために使用できます。^{[ 7 ]}

微生物培養によって細菌が特定されると、感受性試験のために抗生物質が選択されます。^{[ 8 ]}感受性試験法は、細菌を抗生物質に曝露し、細菌の増殖への影響を観察する（表現型試験）か、特定の遺伝子マーカーを特定する（遺伝子試験）ことに基づいています。^{[ 9 ]}使用される方法は、結果が耐性の有無を示す定性的なもの、または細菌が感受性を示す抗生物質の濃度を表す最小発育阻止濃度（MIC）を使用する定量的なものがあります。 ^{[ 9 ]}

抗生物質感受性試験の結果には、機器の故障、温度、湿度、抗菌剤の効力など、多くの要因が影響する可能性があります。品質管理（QC）試験は、試験結果の正確性を確保するのに役立ちます。^{[ 10 ]}アメリカ培養細胞コレクションや国立培養細胞コレクションなどの組織は、品質管理に使用できる既知の耐性表現型を持つ細菌株を提供しています。^{[ 11 ]}

表現型的方法

細菌を抗生物質に曝露させる試験では、寒天平板または寒天もしくはブロスでの希釈法が用いられる。^{[ 12 ]}抗生物質の選択は、培養する微生物と、その地域で入手可能な抗生物質によって決まる。^{[ 8 ]} 結果の正確性を確保するため、寒天またはブロスに添加する細菌の濃度（接種物）を標準化する必要がある。これは、生理食塩水またはブロスに懸濁した細菌の濁度をマクファーランド標準液（特定の濃度の細菌を含む懸濁液の濁度と同等の濁度を持つ溶液）と比較することによって達成される。適切な濃度（最も一般的には0.5マクファーランド標準液）^{[ 13 ]}に達したら、目視検査または光度測定によって決定し、接種物を培養培地に加える。^{[ 14 ] [ 13 ]}

マニュアル

ディスク拡散法では、細菌株を選択し、寒天培地に置き、抗生物質を含浸させたディスク付近での細菌の増殖を観察します。^{[ 15 ]}これはKirby-Bauer法とも呼ばれますが、^{[ 16 ]}改良法も使用されています。^{[ 17 ]}場合によっては、尿サンプルまたは陽性血液培養サンプルを試験培地に直接適用し、微生物を分離する前処理ステップを省略します。^{[ 18 ]}抗生物質が微生物の増殖を阻害すると、ディスクの周囲に透明なリング、つまり阻止円が見られます。阻止円の直径をMICと相関する定義された閾値と比較することにより、細菌は抗生物質に対して感受性、中間、または耐性に分類されます。^{[ 17 ] [ 19 ]}

ディスク拡散試験では、ミューラー・ヒントン寒天が頻繁に使用されます。 ^{[ 17 ]}臨床検査標準協会（CLSI）と欧州抗菌薬感受性試験委員会（EUCAST）は、寒天の種類と深さ、培養温度、および結果の分析方法に関する標準を提供しています。^{[ 14 ]}ディスク拡散は、感受性試験に使用される方法の中で最も安価で簡単な方法と考えられており、新しく入手可能な抗生物質や製剤の試験に容易に適用できます。^{[ 8 ]}成長が遅く、培養条件が複雑な細菌の中には、この方法で正確に試験できないものもありますが、^{[ 8 ]}連鎖球菌属やインフルエンザ菌などの他の細菌は試験できますが、特殊な培養培地と培養条件が必要です。^{[ 20 ]}

Etestなどの勾配法では、寒天培地上に置かれたプラスチックストリップを使用します。^{[ 8 ]}異なる濃度の抗生物質を染み込ませたプラスチックストリップを培養培地上に置き、一定期間培養した後、培養培地を観察します。^{[ 8 ]}涙滴状の阻止円とストリップ上のマーキングの交点に基づいて、最小阻害濃度を特定できます。^{[ 8 ]}異なる抗生物質用に複数のストリップを使用することもできます。^{[ 8 ]}このタイプのテストは拡散テストとみなされます。^{[ 21 ]}

寒天希釈法と液体培地希釈法では、細菌を異なる濃度の抗生物質が入った複数の小さな試験管に入れます。^{[ 17 ]}細菌が感受性であるかどうかは、一定期間の培養後、目視検査または自動光学法によって判定されます。^{[ 8 ]}液体培地希釈法は、表現型試験のゴールドスタンダードと考えられています。^{[ 17 ]}増殖を阻害する抗生物質の最低濃度はMICと考えられています。^{[ 8 ]}

自動化

拡散試験で阻止円を報告するために画像処理とソフトウェア解析を使用したり、希釈試験でサンプルを分注して結果を判定したりするなど、手動プロセスを再現する自動化システムが存在する。^{[ 17 ]} VITEK 2、BD Phoenix、Microscanシステムなどの自動化機器は、ASTの最も一般的な方法である。各機器の仕様は異なるが、基本原理は、あらかじめ調製された抗生物質のパネルに細菌懸濁液を導入することである。パネルはインキュベートされ、濁度測定、分光光度測定、蛍光検出などの方法を使用して、抗生物質による細菌増殖の阻害が自動的に測定される。^{[ 22 ]}エキスパートシステムはMICと感受性結果を相関させ、^{[ 23 ]}結果は検証と報告のために自動的に検査情報システムに送信される。このような自動検査は手動検査よりも労力が少なく標準化されているが、特定の微生物や抗生物質に対しては精度が比較的低い場合があるため^{[ 24 ]}、ディスク拡散法はバックアップ方法として依然として有用である^{[ 25 ] 。}

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  自動感受性試験用のマルチターゲット微生物パネル。各ウェルに試験対象の細菌を少量ずつ入れ、各ウェルには個別の試験に必要な成分が含まれています。
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  各ウェルの自動抗生物質感受性試験に使用される装置に微生物パネルをロードする
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  検査技師が、自動分析装置の画面に表示された感度検査結果を確認している。

細菌は、最小発育阻止濃度（MIC）に基づいて、抗生物質に対して感受性、耐性、または中間耐性があると分類されます。MICは、細菌の増殖を止める抗生物質の最低濃度です。MICは、特定の細菌と抗生物質の標準閾値（「ブレークポイント」と呼ばれる）と比較されます。^{[ 31 ]}同じ微生物と抗生物質のブレークポイントは、感染部位によって異なる場合があります。^{[ 32 ]}例えば、CLSIは一般的に、肺炎球菌をMICが≤0.06 μg/mlの場合は静脈内ペニシリンに感受性、MICが0.12～1 μg/mlの場合は中間、MICが≥2 μg/mlの場合は耐性と定義していますが、髄膜炎の場合、ブレークポイントはかなり低くなります。^{[ 33 ]}抗生物質が耐性であると分類されるかどうかは、 β-ラクタマーゼ産生の可能性など、既知の耐性方法に関連する細菌の特性に基づいている場合もあります。^{[ 31 ] [ 23 ]}薬剤耐性または多剤耐性の特定のパターン、例えば、広域スペクトルβラクタマーゼの存在などが観察されることがある。^{[ 31 ]}このような情報は、臨床医にとって有用であり、経験的治療を原因菌のみを標的とした個別化治療に変更することができる。^{[ 1 ] [ 12 ]}特定の期間に実施された抗菌薬感受性試験の結果は、通常、表の形式でまとめられ、アンチバイオグラムとなる。^{[ 34 ] [ 35 ]}アンチバイオグラムは、臨床医が検査結果が出るまで、地域の耐性パターンに基づいて最適な経験的抗菌療法を選択するのに役立つ。^{[ 35 ]}

理想的な抗生物質療法は、原因菌とその抗生物質感受性を特定することに基づいています。経験的治療は、検査室での微生物学的報告が得られる前に開始されることがよくあります。これは、臨床ガイドラインに基づく一般的な感染症や比較的軽微な感染症（市中肺炎など）の場合もあれば、敗血症や細菌性髄膜炎などの重篤な感染症で、治療の遅延が重大なリスクを伴う場合もあります。^{[ 1 ]}個々の抗生物質の有効性は、感染部位、抗生物質が感染部位に到達する能力、および細菌が抗生物質に抵抗または不活化する能力によって異なります。^{[ 37 ]}

抗生物質感受性試験用の検体は、治療開始前に採取するのが理想的です。^{[ 1 ]}検体は、感染が疑われる部位から採取できます。例えば、血流中に細菌が存在すると疑われる場合（菌血症）は血液培養検体、肺炎の場合は喀痰検体、尿路感染症の場合は尿検体などです。感染源が不明な場合は、複数の検体を採取することもあります。^{[ 1 ]}これらの検体は微生物検査室に移送され、そこで培養培地に加えられ、細菌が同定および感受性試験を行うのに十分な量になるまで培養されます。^{[ 38 ] [ 31 ]}

抗生物質感受性試験が完了すると、サンプル中に存在する微生物と、それらがどの抗生物質に感受性があるかが報告されます。^{[ 31 ]}抗生物質感受性試験は実験室（in vitro）で行われますが、この試験で得られた情報は、多くの場合、人（in vivo）における抗生物質の臨床的意義を持ちます。^{[ 39 ]}時には、細菌が感染症の原因なのか、単なる常在菌や汚染菌なのかを判断する必要が生じます。^{[ 31 ]}例えば、表皮ブドウ球菌^{[ 40 ]}やその他の日和見感染症などが挙げられます。抗生物質の選択には、感染部位（膿瘍など）まで浸透させる必要性や、サンプル中に感染症の原因となる細菌が1つ以上検出されなかったという疑いなど、他の要因も影響する可能性があります。^{[ 1 ]}

β-ラクタム系抗生物質ペニシリンの発見以来、抗菌薬耐性率は上昇している。^{[ 41 ]}時が経つにつれ、細菌の抗生物質に対する感受性を検査する方法が開発され、変化してきた。^{[ 28 ]}

1920年代にアレクサンダー・フレミングは、感受性試験の最初の方法を開発した。彼が開発した「ガター法」は、寒天で作られた溝を通して抗生物質を拡散させる拡散法であった。^{[ 28 ]} 1940年代には、ポープ、フォスター、ウッドラフ、ヴィンセント、ヴィンセントなど複数の研究者が代わりに紙ディスクを使用した。^{[ 28 ]}これらの方法はすべて、ペニシリンに対する感受性のみを試験するものであった。^{[ 28 ]}結果は、研究室間で標準化されていない不正確な結果のため、解釈が難しく信頼性に欠けていた。^{[ 28 ]}

希釈法は1870年代から細菌の培養と識別の方法として、また1929年からはアレクサンダー・フレミングによって細菌の抗生物質感受性をテストする方法として使用されてきました。^{[ 28 ]}感受性の判定方法は、溶液の濁度からpH（1942年）、光学機器へと変化しました。^{[ 28 ]}より大きなチューブを用いた「マクロ希釈」テストは、より小さな「ミクロ希釈」キットに取って代わられました。^{[ 8 ]}

1966年、世界保健機関は、カービー・バウアー法を感受性試験の標準法として承認しました。この方法は簡便で費用対効果が高く、複数の抗生物質を検査できます。 ^{[ 28 ]}

Etestは1980年にBolmstrӧmとErikssonによって開発され、MALDI-TOFは2000年代に開発されました。^{[ 28 ]} 1980年代以降、さまざまな自動化システムが開発されました。^{[ 28 ]} PCRは利用可能な最初の遺伝子検査であり、2001年に抗生物質感受性を検出する方法として初めて発表されました。^{[ 28 ]}

ポイントオブケア検査は、検査時間を短縮し、精密医療のスタイルで医療従事者が不必要な抗生物質を処方しないようにするために開発されています。^{[ 42 ]}従来の技術では通常12～48時間かかりますが、^{[ 9 ]}最大5日間かかる場合もあります。^{[ 31 ]}対照的に、分子診断を用いた迅速検査は、「8時間の勤務シフト内で実施可能」と定義されています。^{[ 9 ]}コストや規制などさまざまな理由により、進歩は遅れています。^{[ 43 ]}

追加の研究は、現在の検査方法の欠点に焦点を当てています。表現型方法の報告にかかる時間だけでなく、手間がかかり、持ち運びが難しく、資源が限られた環境での使用が難しく、交差汚染の可能性もあるのです。^{[ 28 ]}

2017年現在、分子診断会社CepheidのGeneXpertにより、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、リファンピシン耐性結核菌（TB）、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）のポイントオブケア耐性診断が利用可能となっている。^{[ 44 ]}

2014年、ロンギチュード賞は、世界中のどこでも簡単に使用できる、手頃な価格で正確かつ迅速な細菌感染症のポイントオブケア検査を開発した研究チームに800万ポンドの賞金を提供しました。2024年には、単一細胞イメージングに基づく45分の尿路感染症のポイントオブケア抗生物質感受性検査を開発したSysmex Astrego ABに同賞が授与されました。 ^{[ 45 ]}

検出された細菌のうち耐性遺伝子を持つ細菌の割合を決定する目的で、定量PCRが研究されている。^{[ 12 ]}分離された細菌の全ゲノムシーケンスも研究されており、時間の経過とともにコストが下がり、速度が上がるにつれて、より利用しやすくなる可能性が高い。^{[ 12 ]}

迅速表現型ASTは、抗生物質感受性の判定に必要な時間を短縮することを目的とした活発な研究分野です。新しい方法は、イメージング、バイオセンサー、マイクロ流体システムなどの技術を使用して、抗生物質に対する細菌の初期反応を検出することを目的としています。これらの方法は、抗生物質への曝露直後の細菌の増殖、形態、または代謝活動の変化をモニタリングし、従来の培養ベースのアッセイよりも迅速に感受性を判定できるようにします。^{[ 46 ]}

検討されたその他の方法には、少量の流体と光学、電気化学、磁気などのさまざまな試験方法を使用するマイクロ流体技術が含まれます。 ^{[ 12 ]}このようなアッセイは、試験に多くの流体を必要とせず、迅速で持ち運び可能です。^{[ 12 ]}

蛍光色素の使用が検討されている。^{[ 12 ]}これらは、細菌が抗生物質に耐性を示すときに細胞内に存在する核酸配列であるバイオマーカーを標的とした標識タンパク質を含む。 ^{[ 12 ]}細菌の分離株を固定し、溶解する。次に、分離株を蛍光色素に曝露すると、観察時に発光する。^{[ 12 ]}

既存のプラットフォームの改良も検討されており、表現型サンプル中のMICをより迅速に特定できるイメージングシステムの改良や、細菌の増殖を明らかにして変化をより容易に可視化する生物発光酵素の使用などが含まれる。^{[ 28 ]}

• 「抗菌薬感受性検査（選択された病原体の抗菌薬感受性）」（PDF）。ミネソタ州保健局。