岡崎フラグメント

岡崎フラグメントは、DNA複製中に不連続に合成され、後にDNAリガーゼ酵素によって連結されてラギング鎖を形成する短いDNA ヌクレオチド配列（真核生物では約150〜200塩基対）である。^[1]これらは、1960年代に日本の分子生物学者岡崎令治と岡崎恒子が同僚の協力を得て発見した。

DNA複製の際、二重らせんがほどけ、相補鎖は酵素DNAヘリカーゼによって分離され、DNA複製フォークと呼ばれるものが形成される。このフォークに続いて、DNAプライマーゼとDNAポリメラーゼが作用し、新しい相補鎖を作成する。これらの酵素は5'から3'方向にしか機能しないため、2つのほどけたテンプレート鎖は異なる方法で複製される。^[2]一方の鎖、すなわちリーディング鎖は、そのテンプレート鎖が3'から5'の方向性を持っているため連続的な複製プロセスを受け、リーディング鎖を組み立てるポリメラーゼは中断することなく複製フォークをたどることができる。しかし、ラギング鎖は、そのテンプレート鎖が5'から3'の方向性を持っているため連続的に作成することができず、ポリメラーゼは複製フォークから逆方向に作業しなければならない。これにより、ラギング鎖の作成プロセスで定期的な中断が発生する。プライマーゼとポリメラーゼはフォークの反対方向に移動するため、DNAヘリカーゼが鎖を分解する間、酵素は停止と再開を繰り返す必要があります。断片が作られると、DNAリガーゼがそれらを1本の連続した鎖に結合します。^[3]複製プロセス全体は、新しい鎖の1つが連続的に形成され、もう1つは連続的に形成されないため、「半不連続」であると考えられます。^[4]

^[2] 1960年代、岡崎礼二と岡崎恒子は大腸菌でDNA複製に関する実験を行った。それまでは、複製は両方の鎖に対して連続的なプロセスであると一般に考えられていたが、大腸菌に関する発見は複製の新しいモデルにつながった。科学者たちは、DNAをパルス標識し、非連続的な複製を示唆する変化を観察することで、不連続な複製プロセスがあることを発見した。

坂部貴和子、岡崎礼治、岡崎恒子の研究は、 DNA複製が不連続なプロセスであるという仮説を裏付ける実験的証拠を提供した。これまで、複製は3'から5'方向と5'から3'方向の両方で連続的であると一般に認められていた。3'と5'は、核酸のデオキシリボース環上の特定の番号が付けられた炭素であり、鎖の方向または方向性を指す。1967年、岡崎恒子と小川徹は、3'から5'方向への連続的な複製を示すメカニズムは見つかっておらず、複製酵素であるDNAポリメラーゼを使用した5'から3'方向のみであることが示唆された。研究チームは、不連続複製が使用される場合、複製点で合成された短いDNA鎖が、5'から3'方向で古い鎖に結合できると仮説を立てた。^[5]

DNAの複製方法を実験的に区別するために、研究チームは大腸菌の染色体の新しく複製された領域をパルス標識し、DNAを変性させて抽出した。放射性の短いユニットが多数存在したことから、複製方法は不連続である可能性が高いことがわかった。この仮説は、短いDNA鎖を連結する酵素であるポリヌクレオチドリガーゼの発見によってさらに裏付けられた。 ^[6]

1968 年、岡崎礼二と恒子は新生 DNA 鎖のさらなる証拠を集めた。彼らは、ポリヌクレオチド リガーゼによって連結された短い DNA 鎖を伴う不連続複製が DNA 合成のメカニズムであるならば、「リガーゼの機能が一時的に損なわれる状況下では、新しく合成された短い DNA 鎖が細胞内に蓄積する」という仮説を立てた。大腸菌は、温度感受性ポリヌクレオチド リガーゼを生成するバクテリオファージ T4に感染した。T4 ファージに感染した細胞は、仮説で予測されたように、高温にさらされると、多数の短い新しく合成された DNA 鎖を蓄積した。この実験は、ポリヌクレオチド リガーゼによる不連続複製と連結という岡崎夫妻の仮説をさらに裏付けるものとなった。また、抽出プロセス中にも短い鎖が生成されるという考えを否定した。^[7]

岡崎夫妻の実験により、DNA の複製プロセスと、後に岡崎断片として知られるようになった新しく合成された短い DNA 鎖の存在に関する広範な情報が得られました。

岡崎フラグメントを処理するための 2 つの経路、すなわち短いフラップ経路と長いフラップ経路が提案されています。

真核生物の短いフラップ経路では、DNAのラギング鎖が短い間隔でプライミングされる。短い経路にのみ、ヌクレアーゼFEN1が関与している。Pol δは、下流のプライミングされた岡崎断片に頻繁に遭遇し、RNA/DNAイニシエータープライマーを5'フラップに置き換える。FEN1 5'-3'エンドヌクレアーゼは、5'フラップが置き換えられたことを認識し、切断してライゲーションの基質を作成する。この方法では、Pol a合成プライマーが除去される。研究^{[ which? ]}は、FEN1において、ヌクレアーゼが5'フラップからそのベースに移動して切断を行う「追跡」モデルを示唆していることを示している。^[8] Pol δは、置き換えられたフラップを切断するためのヌクレアーゼ活性を処理しない。FEN1は、形成後すぐに短いフラップを切断する。 DNA フラップの 5' 末端が相補プライマーまたはビオチン結合ストレプトアビジン部分でブロックされると、切断は阻害されます。DNA リガーゼは FEN1 によって作られた切れ目を密閉し、機能的な連続した DNA の二重鎖を作成します。PCNA は、FEN1 と DNA リガーゼの両方のタンパク質の酵素機能をシミュレートします。この相互作用は、遅れている DNA 鎖を適切にライゲーションする上で重要です。Pol δ と FEN1 による連続的な鎖置換と切断は、ライゲーション前にイニシエーター RNA 全体を除去するのに役立ちます。イニシエーター プライマーを除去するには、多くの置換と切断反応が必要です。作成されたフラップは処理され、短いフラップ経路によって成熟します。

場合によっては、FEN1 は短時間しか持続せず、複製複合体から外れます。これにより、切断が遅れ、Pol δ によって置き換えられたフラップが長くなります。RPA が十分な長さに達すると、安定して結合できます。RPA に結合したフラップが FEN1 切断にリファクタリングされると、処理に別のヌクレアーゼが必要になります。これは代替ヌクレアーゼ DNA2 として特定されています。DNA2 は DEN1 の過剰発現に欠陥があります。DNA2 は FEN1 と連携して長いフラップを処理することが示されています。DNA2 は RPA を長いフラップから分離することができ、FEN1 のようなメカニズムを使用してこれを行います。DNA2 はフラップに結合し、フラップの 5' 末端を通します。ヌクレアーゼはフラップを切断して RPA に結合できないようにし、フラップが短すぎるということは FEN1 とライゲーションに使用できることを意味します。これはロング フラップ法として知られています。DNA2 はヌクレアーゼ活性のバックアップとして FEN1 として機能しますが、効率的なプロセスではありません。

最近まで、岡崎断片を処理する経路は2つしか知られていませんでした。しかし、現在の研究では、岡崎断片化とDNA複製のための新しい経路が存在すると結論付けられています。この代替経路には、Pol δとPif1という酵素が関与しており、これらはPol δとFEN1と同じフラップ除去プロセスを実行します。^[9]

プライマーゼはラギング鎖にRNAプライマーを追加し、5'から3'への岡崎フラグメントの合成を可能にします。しかし、プライマーゼは、DNAポリメラーゼがリーディング鎖でDNAを合成する速度よりもはるかに低い速度でRNAプライマーを作成します。ラギング鎖上のDNAポリメラーゼも、RNAプライマーに続いて岡崎フラグメントを構築するために継続的にリサイクルされる必要があります。これにより、ラギング鎖の合成速度はリーディング鎖の合成速度よりもはるかに遅くなります。これを解決するために、プライマーゼは一時的な停止信号として機能し、 DNA複製中に複製フォークの進行を一時的に停止します。この分子プロセスは、リーディング鎖がラギング鎖を追い越すのを防ぎます。^[10]

この段階では、5' から 3' 方向に DNA を合成する酵素によって新しい DNA が作られます。DNA ポリメラーゼは、DNA 合成において連続した鎖として作られるリーディング鎖と小さな断片として作られるラギング鎖の両方に不可欠です。このプロセスは、新しく合成されたフラグメントの延長と RNA および DNA セグメントの排除のために行われます。合成は、DNA ポリメラーゼ α-プライマーゼと DNA ポリメラーゼ δ という 2 つの異なるポリメラーゼによる 3 つの段階で行われます。このプロセスは、クランプ ローダー複製効果によってポリメラーゼ α-プライマーゼが RNA および DNA プライマーから置換することから始まります。この効果により、スライディング クランプが DNA 上に導かれます。この後、DNA ポリメラーゼ δ がホロ酵素形式に移行し始め、合成が開始されます。合成プロセスは、前の Okazaki フラグメントの 5' 末端に到達するまで続きます。到達すると、Okazaki フラグメント処理が開始され、新しく合成されたフラグメントがラギング ストランドに結合されます。 DNA ポリメラーゼ δ の最後の機能は、FEN1/RAD27 5' フラップ エンドヌクレアーゼ活性の補助として機能することです。rad27-p 対立遺伝子はほとんどの組み合わせでは致死的ですが、rad27-p ポリメラーゼと exo1 では生存可能でした。rad27-p ポリメラーゼと exo1 は両方とも、CAN 1 重複変異の強力な相乗的増加を示します。この変異が生存可能である唯一の理由は、二本鎖切断修復遺伝子 RAD50、RAD51、および RAD52 によるものです。RAD27/FEN1 は、ラギング鎖での鎖排除の量を最小限に抑えることで、隣接する Okazaki フラグメント間に切れ目を作成します。

ラギング鎖合成中、DNAリガーゼIは、 DNAポリメラーゼδによるRNAプライマーのDNAヌクレオチドへの置換に続いて、岡崎断片を連結する。連結されていない岡崎断片は、DNAを切断する二本鎖切断を引き起こす可能性がある。 ^[11]二本鎖切断は少数しか許容されず、修復できるのも少数だけなので、十分な数の連結失敗は細胞にとって致命的となる可能性がある。

さらなる研究により、増殖細胞核抗原（PCNA）がDNAリガーゼIの岡崎断片を結合する機能に補助的な役割を果たしていることが示唆されている。DNAリガーゼIのPCNA結合部位が不活性の場合、DNAリガーゼIの岡崎断片を結合する能力は著しく損なわれる。したがって、提案されているメカニズムは次の通りである。PCNA-DNAポリメラーゼδ複合体が岡崎断片を合成した後、DNAポリメラーゼδが放出される。次に、DNAリガーゼIはラギング鎖の切れ目にクランプされたPCNAに結合し、ホスホジエステル結合の形成を触媒する。^{[12] [13] [14]}

フラップエンドヌクレアーゼ1（FEN1）は、岡崎断片の処理を担う。DNAポリメラーゼと連携して岡崎断片のRNAプライマーを除去し、DNAポリメラーゼがラギング鎖合成中に鎖を置換する際に5'リボヌクレオチドと5'フラップを除去することができる。これらのフラップの除去にはニックトランスレーションと呼ばれるプロセスが関与し、ライゲーションのためのニックを作成する。したがって、FEN1の機能は、長く連続したDNA鎖を形成する岡崎断片の成熟に必要である。同様に、DNA塩基修復中に、損傷したヌクレオチドはフラップに置換され、その後FEN1によって除去される。^{[15] [16]}

Dna2エンドヌクレアーゼは特定の構造を持たず、その特性は十分に特徴付けられていないが、自由末端を持つ一本鎖DNA（ssDNA）と呼ぶことができる。Dna2エンドヌクレアーゼは、岡崎過程中にFEN1から出る長いDNAフラップを切断するために不可欠である。Dna2エンドヌクレアーゼは、岡崎断片の開始RNAセグメントの除去を担う。また、Dna2エンドヌクレアーゼは、多様なDNA代謝中に生成される中間体において極めて重要な役割を果たしており、テロメアの維持に機能している。^{[17] [18] [19] [20] [21]}

Dna2 エンドヌクレアーゼは、末端 RNA セグメントが 5' 末端に結合すると、5' から 3' 方向に転座するため、活性化します。一本鎖 DNA 結合タンパク質 RPA が存在すると、DNA 5' フラップが長くなりすぎて、切れ目が FEN1 の基質として適合しなくなります。これにより、FEN1 は 5' フラップを除去できなくなります。したがって、Dna2 の役割は、これらのフラグメントの 3' 末端を縮小し、FEN1 がフラップを切断できるようにして、岡崎フラグメントの成熟をより効率的にすることです。岡崎プロセス中、Dna2 ヘリカーゼとエンドヌクレアーゼは切り離せません。Dna2 エンドヌクレアーゼは、その活性において 5' テールフォーク構造に依存しません。非生産的な結合は、FEN1 の切断と追跡をブロックすることが知られています。ATP は活性を低下させますが、3' 末端ラベルの解放を促進することが知られています。研究では、Dna2エンドヌクレアーゼとFEN1の新しいモデルが岡崎断片の成熟に部分的に関与していることが示唆されている。^{[20] [18] [17] [22]}

新しく合成された DNA (別名オカザキ断片) は、DNA リガーゼによって結合され、新しい DNA 鎖を形成します。DNA が合成されると、2 つの鎖が作成されます。リーディング鎖は継続的に合成され、このプロセス中に伸長して、ラギング鎖 (オカザキ断片) に使用されるテンプレートを露出します。DNA 複製のプロセス中に、DNA および RNA プライマーがラギング DNA 鎖から削除され、オカザキ断片が結合できるようになります。このプロセスは非常に一般的であるため、1 回の DNA 複製が完了する間に、オカザキ成熟が約 100 万回発生します。オカザキ成熟が発生するには、RNA プライマーが連結される断片上にセグメントを作成する必要があります。これは、ラギング鎖での DNA 合成の構成要素として使用されます。テンプレート鎖では、ポリメラーゼが複製フォークと反対方向に合成します。テンプレートが不連続になると、オカザキ断片が作成されます。岡崎断片の成熟における欠陥は、DNA の鎖の切断を引き起こし、さまざまな形の染色体異常を引き起こす可能性があります。染色体のこれらの変異は、外観、セット数、または個々の染色体の数に影響を与える可能性があります。染色体は特定の種ごとに固定されているため、DNA が変化し、その種の遺伝子プールに欠陥を引き起こす可能性もあります。

岡崎フラグメントは、原核生物と真核生物の両方に存在します。^[23]真核生物の DNA 分子は、原核生物の環状分子よりも大きく、通常は複数の複製起点を持つという点で異なります。つまり、各真核生物の染色体は、複数の複製起点を持つ多くの複製 DNA ユニットで構成されています。これと比較して、原核生物の DNA には 1 つの複製起点しかありません。真核生物では、DNA 全体に多数存在するこれらの複製フォークが、複製中に DNA 内に「バブル」を形成します。複製フォークは、自律複製配列(ARS) と呼ばれる特定のポイントで形成されます。真核生物には、クランプ ローダー コンプレックスと、増殖細胞核抗原と呼ばれる 6 ユニットのクランプがあります。^[24]複製フォークの効率的な動きは、ATP 依存性クランプ ローダー コンプレックスによって、ラギング DNA 鎖上の新しくプライミングされたサイトにスライディング クランプを迅速に配置することにも大きく依存しています。これは、岡崎断片の断片的生成が、リーディング鎖上のDNAの連続合成に追いつくことができることを意味する。これらのクランプローダー複合体はすべての真核生物の特徴であり、原核生物と真核生物における岡崎断片の合成におけるいくつかの小さな違いを分離している。^[25] 原核生物と真核生物の岡崎断片の長さも異なります。原核生物の岡崎断片は真核生物のものよりもかなり長い。真核生物の岡崎断片は通常100〜200ヌクレオチド長であるのに対し、原核生物の大腸菌の断片は2,000ヌクレオチド長になることがあります。この不一致の理由は不明です。

真核生物の各染色体は、複数の複製起点を持つ多数の DNA 複製単位で構成されています。これに対して、原核生物の大腸菌染色体には複製起点が 1 つしかありません。原核生物の複製は細胞質内で行われ、約 100 ～ 200 個以上のヌクレオチドで構成される複製が開始されます。真核生物の DNA 分子には、約 50,000 個以上のレプリコンがあり、かなり多数ありますが、すべてのレプリコンで同時に複製が行われるわけではありません。真核生物では、DNA 複製は核内で行われます。複製中の DNA 分子 1 つだけで多数の複製が形成され、DNA 複製の開始点はマルチサブユニット タンパク質によって移動されます。この複製は遅く、1 秒あたり約 100 ヌクレオチドが追加されることもあります。

このことから、原核細胞は構造がより単純で、核や細胞小器官がなく、DNA は 1 本の染色体という形でごくわずかしかないことがわかります。真核細胞には、複数の細胞小器官を持つ核があり、より多くの DNA が線状染色体に配置されています。また、原核細胞と真核細胞のもう 1 つの違いは大きさです。平均的な真核細胞は、原核細胞の約 25 倍の DNA を持っています。複製は、原核細胞の方が真核細胞よりもはるかに速く起こります。細菌では 40 分しかかからないこともありますが、動物細胞では最大 400 時間かかることがあります。真核生物には、最後の染色体の末端にあるテロメアを複製するための独特の操作もあります。原核生物は環状の染色体を持っているため、末端が合成されません。原核生物では、短い複製プロセスが継続的に発生します。一方、真核細胞は細胞周期のS期にのみDNA複製を行います。

類似点は、DNA 複製の手順です。原核生物と真核生物の両方において、複製は DNA ヘリカーゼと呼ばれる酵素によって DNA をほどくことによって行われます。新しい鎖は DNA ポリメラーゼと呼ばれる酵素によって生成されます。これらは両方とも半保存的複製と呼ばれる同様のパターンに従います。このパターンでは、個々の DNA 鎖が異なる方向に生成され、リーディング鎖とラギング鎖が形成されます。これらのラギング鎖は、すぐに結合される岡崎フラグメントの生成によって合成されます。これらの生物は両方とも、小さな RNA 鎖も含む新しい DNA 鎖を開始します。

細胞は遺伝子配列に変異が起こらないように複数のステップを踏むが、オカザキ断片の成熟中に特定の欠失やその他の遺伝子変化が気付かれないことがある。オカザキ断片はラギング鎖のヌクレオチドのセットであるため、元の鎖からの欠失、挿入、または複製を含むあらゆる変化は、検出され修正されなければ変異を引き起こす可能性がある。変異の他の原因には、DNA複製を助けるタンパク質の問題が含まれる。例えば、プライマーゼに関連する変異はRNAプライマーの除去に影響し、DNA鎖をより脆弱にして切断されやすくする可能性がある。別の変異はポリメラーゼαに関係し、オカザキ断片配列の編集とタンパク質の遺伝物質への組み込みを阻害する。どちらの変化も染色体異常、意図しない遺伝子再編成、および後年のさまざまな癌につながる可能性がある。^[26]

タンパク質変異が生体に及ぼす影響を試験するため、研究者らは実験用マウスを遺伝子操作し、DNA複製に関連するタンパク質であるフラップエンドヌクレアーゼ1（FEN1）の別の変異をホモ接合体とした。結果は特定の遺伝子改変によって異なった。ホモ接合ノックアウト変異マウスは「細胞増殖の失敗」と「早期胎児致死」を経験した（27）。変異F343AおよびF344A（FFAAとしても知られる）を持つマウスは、 汎血球減少症や肺低形成などの出産時の合併症のため、出生直後に死亡した。これは、FFAA変異によってFEN1がPCNA（増殖細胞核抗原）と相互作用できなくなり、その結果、岡崎フラグメント成熟中にその目的を果たせなくなるためである。このタンパク質との相互作用は、FEN1の生物学的機能における重要な分子機能であると考えられている。 FFAA 変異は RNA プライマー除去と長塩基対修復に欠陥を引き起こし、DNA に多くの切断を引き起こします。注意深く観察すると、FFAA FEN1 変異のホモ接合細胞は成熟に部分的な欠陥しか示さないようです。つまり、変異のヘテロ接合マウスは、ゲノムに複数の小さな傷が残っているにもかかわらず、成体まで生き残ることができるということです。しかし、これらの傷は、複製フォークの崩壊を引き起こし、実際の DNA 配列で二重鎖切断を引き起こすため、必然的に将来の DNA 複製を妨げます。やがて、これらの傷は完全な染色体切断も引き起こし、深刻な変異や癌につながる可能性があります。他の変異は、ポリメラーゼ α の改変バージョンを使用して実装され、同様の結果をもたらしました。^[26]

• 米国国立医学図書館の医学件名標目表(MeSH)における Okazaki+fragments
• DNA合成について論じたマグロウヒル高等教育の記事