磁気ピンセット

磁気ピンセット (MT)は、生体分子またはポリマーの操作と特性評価のための科学機器です。これらの装置は、個々の分子または分子のグループに力とトルクを加えます。引張強度や分子によって生成される力を測定するために使用できます。

磁気ピンセットは、単一分子実験でDNAやタンパク質などの生物学的高分子の機械的特性を研究するために最もよく使用されます。その他の用途としては、ソフトマターのレオロジーや、生細胞における力制御プロセスの研究があります。力は通常、ピコニュートンからナノニュートン (pN から nN) のオーダーです。磁気ピンセットは構造がシンプルなため、生物物理学のツールとしてよく使用されています。

実験では、対象となる分子が磁性微粒子に付着します。磁気ピンセットには磁石が装備されており、この磁石を使って磁性微粒子を操作し、その位置をビデオ顕微鏡で測定します。

磁気ピンセット装置は、外部磁場を利用して操作できる磁性微粒子で構成されています。磁性微粒子の位置は、カメラ付きの顕微鏡対物レンズによって決定されます。

磁気ピンセットで使用する磁性粒子にはさまざまな特性があり、用途に応じて選択する必要があります。次の段落では、2 種類の基本的な磁性粒子について説明します。ただし、細胞内での実験を可能にする 強磁性流体内の磁性ナノ粒子など、他の磁性粒子も存在します。

超常磁性ビーズ

超常磁性ビーズは、さまざまな特性を持つものが市販されています。最も一般的なのは、直径がマイクロメートル範囲の球状粒子を使用するものです。これらは、磁性ナノ粒子が埋め込まれた多孔質ラテックスマトリックスで構成されています。ラテックスは自己蛍光を発するため、位置の画像化に有利です。不規則な形状の粒子は表面積が大きいため、研究対象の分子に結合する可能性が高くなります。^[1]マイクロビーズのコーティングには、目的の分子を結合できるリガンドが含まれている場合もあります。たとえば、コーティングには、目的の分子に結合する可能性のあるビオチンと強く結合するストレプトアビジンが含まれている場合があります。

外部磁場にさらされると、これらのマイクロビーズは磁化されます。誘導される磁気モーメントは弱い外部磁場に比例します。 ${\displaystyle {\overrightarrow {m}}({\overrightarrow {B}})}$${\displaystyle {\overrightarrow {B}}}$

${\displaystyle {\overrightarrow {m}}({\overrightarrow {B}})={\frac {V\chi {\overrightarrow {B}}}{\mu _{0}}}}$

ここで、は真空透磁率です。また、 はマイクロスフィアの体積に比例します。これは、磁性ナノ粒子の数がビーズのサイズに比例するという事実に由来します。この最初の推定では、磁化率はスカラーであると仮定され、 によって計算できます。ここで、は相対透磁率です。強い外部磁場では、誘導された磁気モーメントは材料に依存する値 で飽和します。マイクロビーズが受ける力は、外部磁場におけるこの磁気モーメントの電位から導き出すことができます。 ^[2]${\displaystyle \mu_{0}}$${\displaystyle V}$${\displaystyle \chi}$${\displaystyle \chi =3{\frac {\mu _{r}-1}{\mu _{r}+2}}}$${\displaystyle \mu_{r}}$${\displaystyle {\overrightarrow {m}}_{sat}}$${\displaystyle {\overrightarrow {F}}}$${\displaystyle U=-{\frac {1}{2}}{\overrightarrow {m}}({\overrightarrow {B}})\cdot {\overrightarrow {B}}}$

${\displaystyle {\overrightarrow {F}}=-{\overrightarrow {\nabla }}U={\begin{cases}{\frac {V\chi }{2\mu _{0}}}{\overrightarrow {\nabla }}\left|{\overrightarrow {B}}\right|^{2}&\qquad {\text{in a weak magnetic field}}\\{\frac {1}{2}}{\overrightarrow {\nabla }}\left({\overrightarrow {m}}_{sat}\cdot {\overrightarrow {B}}\right)&\qquad {\text{in a strong magnetic field}}\end{cases}}}$

外部磁場は、有限要素解析の助けを借りて数値的に評価するか、ホール効果センサーの助けを借りて磁場を測定することによって評価できます。理論的には、これらの式を使用してビーズにかかる力を計算することができますが、関係する変数の不確実性のため、結果はあまり信頼できませんが、大きさのオーダーを推定し、システムをよりよく理解するのに役立ちます。ビーズの ブラウン運動を考慮すると、より正確な数値が得られます。

マイクロビーズ内のナノ粒子の確率的分布の異方性により、磁気モーメントは外部磁場と完全には一致しません。つまり、磁化率テンソルをスカラーに縮小することはできません。このため、ビーズは、一致しようとするトルクも受けます。 ${\displaystyle {\overrightarrow {\Gamma }}}$${\displaystyle {\overrightarrow {m}}}$${\displaystyle {\overrightarrow {B}}}$

${\displaystyle {\overrightarrow {\Gamma }}={\overrightarrow {m}}\times {\overrightarrow {B}}}$

この方法で生成されるトルクは通常 よりもはるかに大きく、対象の分子をねじるのに必要な量よりも大きい。^[3]${\displaystyle 10^{3}\mathrm {pNnm} }$

強磁性ナノワイヤ

磁気ピンセットの操作に強磁性ナノワイヤを使用すると、実験の適用範囲が広がります。これらのワイヤの長さは通常、数十ナノメートルから数十マイクロメートルのオーダーで、直径よりもはるかに大きくなります。超常磁性ビーズと比較して、はるかに大きな力とトルクを適用できます。さらに、残留磁気モーメントを示します。これにより、弱い磁場強度での操作が可能になります。異なる化学的性質を示す表面セグメントを持つナノワイヤを生成できるため、研究対象の分子がワイヤに結合できる位置を制御できます。^[1]

マイクロビーズにトルクを加えるには少なくとも 2 つの磁石が必要ですが、磁性マイクロビーズを引っ張るだけの 1 つの磁石から、デジタル フィードバック ループを介して 3 次元の位置と回転を完全に制御できる 6 つの電磁石のシステムまで、さまざまな構成が実現されています。^[4]磁場の強度は、2 つの磁石をリンクする軸からの距離とともに、磁石間のギャップの幅程度の典型的なスケールでほぼ指数関数的に減少します。このスケールは距離に比べてかなり大きいため、実験中にマイクロビーズが移動する場合、それに作用する力は一定として扱うことができます。したがって、磁気ピンセットは、光ピンセットとは対照的に、その構造上、受動的な力クランプですが、フィードバック ループと組み合わせると、正のクランプとしても使用できます。磁場の強度は、磁石の極面を鋭くすることで増加できますが、磁場が一定であると見なせる領域も減少します。磁石の外側の極を鉄のリングで接続すると、漂遊磁場を減らすのに役立つ場合があります。磁気ピンセットは永久磁石と電磁石の両方で操作できます。2つの技術にはそれぞれ固有の利点があります。^[3]

永久磁石

磁気ピンセットの永久磁石は、通常、ネオジムなどの希土類材料から作られており、1.3テスラを超える磁場強度に達することができます。^[5]ビーズにかかる力は、磁石を垂直軸に沿って動かすことで制御できます。磁石を上に動かすと、ビーズの位置での磁場強度が低下し、逆に磁石を上に動かすと、ビーズの位置での磁場強度が低下します。磁石を垂直軸の周りで回転させて磁場の方向を変えることで、磁気ビーズにトルクをかけることができます。磁石のサイズは、間隔と同様にミリメートル単位です。^[3]

電磁石

磁気ピンセットに電磁石を使用すると、磁石の電流の振幅と位相を調整するだけで磁場の強さと方向を変更できるという利点があります。このため、磁石を動かす必要がなくなり、システムの制御が高速化され、機械的なノイズが低減します。最大磁場強度を高めるために、飽和度が高く残留磁化が低い軟磁性材料のコアをソレノイドに追加することができます。ただし、いずれの場合も、一般的な磁場強度は、同等の大きさの永久磁石に比べてはるかに低くなります。さらに、電磁石を使用するには高電流が必要であり、熱が発生するため、冷却システムが必要になる場合があります。^[1]

磁性ビーズの変位は、印加された磁場に対するシステムの応答に対応するため、正確に測定する必要があります。一般的なセットアップでは、実験ボリュームが上から照らされ、ビーズが、テザリング サーフェスの下に配置された対物レンズの焦点面に回折リングを生成します。次に、回折パターンがCCD カメラによって記録されます。画像は、コンピューターによってリアルタイムで分析できます。テザリング サーフェスの平面での位置の検出は、回折リングの中心に対応するため複雑ではありません。精度は最大で数ナノメートルです。垂直軸に沿った位置については、回折パターンを参照画像と比較する必要があります。参照画像には、焦点面からの既知の距離にあるビーズの回折パターンが表示されます。これらのキャリブレーション画像は、ビーズを固定したまま、圧電素子を使用して対物レンズ、つまり焦点面を既知の距離だけ移動させることによって取得されます。補間を使用すると、この軸に沿って解像度を最大 10 nm の精度にすることができます。^[6]得られた座標は、例えばビーズを特定の位置に保つために磁場の強さを制御するデジタルフィードバックループの入力として使用される場合がある。

非磁性ビーズも通常、背景変位ベクトルを提供するための参照としてサンプルに追加されます。非磁性ビーズは、光学的に区別できるように磁性ビーズとは異なる直径を持っています。これは、流体の潜在的なドリフトを検出するために必要です。たとえば、磁性粒子の密度が高すぎる場合、周囲の粘性流体を引きずる可能性があります。磁性ビーズの変位ベクトルは、その初期位置ベクトルとこの背景変位ベクトルを現在の位置から減算することで決定できます。

磁場によって磁性ビーズに及ぼされる力は、水平面におけるビーズの熱変動を考慮して計算できます。この問題は、垂直軸に関して回転対称です。以降、対称面内で任意に選択した 1 つの方向を と呼びます。解析は x 方向に直交する方向についても同じであり、精度を上げるために使用できます。ビーズが熱変動により - 軸上の平衡位置からずれると、一次近似内でとともに線形に増加する復元力を受けます。関係するベクトルの絶対値のみを考慮すると、比例定数は、ビーズを固定面に固定する分子の 長さにわたって磁石によって及ぼされる力であることが幾何学的に明らかです。${\displaystyle x}$${\displaystyle x}$${\displaystyle \delta x}$${\displaystyle F_{\chi }}$${\displaystyle \delta x}$${\displaystyle F}$${\displaystyle l}$

${\displaystyle F_{\chi }={\frac {F}{l}}\delta x}$。

等分配定理によれば、この「バネ」に蓄えられた平均エネルギーは自由度あたり に等しい。ここでは 1 方向のみを考慮しているため、システムの位置エネルギーは次のようになります。このことから、ビーズに作用する力の最初の推定値は次のように推定できます。 ${\displaystyle {\frac {1}{2}}k_{B}T}$${\displaystyle \langle E_{p}\rangle ={\frac {1}{2}}{\frac {F}{l}}\langle \delta x^{2}\rangle ={\frac {1}{2}}k_{B}T}$

${\displaystyle F={\frac {lk_{B}T}{\langle \delta x^{2}\rangle }}}$。

ただし、より正確な較正を行うには、フーリエ空間での分析が必要です。ビーズの位置のパワー スペクトル密度は 、実験的に得られます。このスペクトルの理論式は次のように導出され、これを実験曲線に当てはめて、磁石がビーズに及ぼす力をフィッティング パラメータとして取得できます。定義により、このスペクトルは、スペクトル帯域幅にわたる 位置のフーリエ変換の2 乗係数です。 ${\displaystyle P(\omega )}$${\displaystyle X(\omega )}$${\displaystyle \Delta f}$

${\displaystyle P(\omega )={\frac {\left|X(\omega )\right|^{2}}{\Delta f}}}$

${\displaystyle X(\omega )}$質量のビーズの運動方程式を考慮すると、次の式が得られます。 ${\displaystyle m}$

${\displaystyle m{\frac {\partial ^{2}x(t)}{\partial t^{2}}}=-6\pi R\eta {\frac {\partial x(t)}{\partial t}}-{\frac {F}{l}}x(t)+f(t)}$

項は、粘性媒体中の半径 の球状粒子に対するストークス摩擦力に対応し、ブラウン運動による確率力に対抗する復元力である。ここでは、系が非常に低いレイノルズ数の領域にあるため、慣性項を無視することができる。^[1]${\displaystyle 6\pi R\eta {\frac {\partial x(t)}{\partial t}}}$${\displaystyle R}$${\displaystyle \eta }$${\displaystyle {\frac {F}{l}}x(t)}$${\displaystyle f(t)}$${\displaystyle m{\frac {\partial ^{2}x(t)}{\partial t^{2}}}}$ ${\displaystyle \left(\mathrm {Re} <10^{-5}\right)}$

運動方程式は、駆動力と位置をフーリエ空間に挿入することでフーリエ変換できます。

${\displaystyle {\begin{aligned}f(t)=&{\frac {1}{2\pi }}\int F(\omega )\mathrm {e} ^{i\omega t}\mathrm {d} t\\x(t)=&{\frac {1}{2\pi }}\int X(\omega )\mathrm {e} ^{i\omega t}\mathrm {d} t.\end{aligned}}}$

これは次の結果につながります:

${\displaystyle X(\omega )={\frac {F(\omega )}{6\pi iR\eta \omega +{\frac {F}{l}}}}}$。

確率力のパワースペクトル密度は、等分割定理とブラウン運動の衝突が完全に無相関であるという事実を用いて導くことができる：^[7]${\displaystyle F(\omega )}$

${\displaystyle {\frac {\left|F(\omega )\right|^{2}}{\Delta f}}=4k_{B}T\cdot 6\pi \eta R}$

これは変動散逸定理に対応します。この表現により、パワースペクトルの理論的な表現を与えることができます。

${\displaystyle P(\omega )={\frac {24\pi k_{B}T\eta R}{36\pi ^{2}R^{2}\eta ^{2}\omega ^{2}+\left({\frac {F}{l}}\right)^{2}}}}$

この式における唯一の未知数であるは、この式を実験的パワースペクトルに当てはめることによって決定することができる。より正確な結果を得るためには、フィッティングを行う前に、有限のカメラ積分時間による影響を実験スペクトルから差し引く必要がある。^[6]${\displaystyle F}$

もう 1 つの力の校正方法は、マイクロビーズの粘性抵抗を使用することです。したがって、マイクロビーズは粘性媒体に引っ張られながら位置を記録します。システムのレイノルズ数は非常に低いため、ストークスの法則を適用して、磁石によって及ぼされる力と平衡状態にある摩擦力を計算することができます。

${\displaystyle F=6\pi \eta Rv}$。

速度は記録された速度値を使用して決定できます。この式で得られた力は、磁石の特定の構成と関連付けられ、校正として使用できます。^[8]${\displaystyle v}$

^{このセクションでは、磁気ピンセットを使用して Strick、Allemand、Croquette [9]}が行った実験の例を示します。二本鎖 DNA 分子は、一方の端が複数の結合部位でガラス表面に、もう一方の端が磁気ピンセット装置で操作できる磁気マイクロビーズに固定されています。磁石を回転させることにより、DNA 分子にねじり応力を加えることができます。DNA らせんの方向の回転は正にカウントされ、逆もまた同様です。ねじりながら、磁気ピンセットは DNA 分子を伸ばすこともできます。このようにして、異なる伸張力でねじり伸長曲線を記録できます。低い力 (約 0.5 pN 未満) の場合、DNA はプレクトネムと呼ばれるスーパーコイルを形成し、正のねじれと負のねじれに対して DNA 分子の伸長を非常に対称的に減少させます。引っ張る力を増大させると、課せられたねじれがゼロの場合に伸長が増加します。正のねじれは再びプレクトネム形成につながり、伸長を減少させます。一方、負のねじれは DNA 分子の伸長を大きく変化させません。これは 2 つの鎖の分離、つまり分子の変性と解釈できます。高力領域では、伸長は加えられたねじれ応力とはほとんど無関係です。これは、DNA が極度に巻きすぎた局所領域が出現したと解釈できます。この実験の重要なパラメータは、3 つの力領域を分ける加えられた引っ張り力の臨界値に影響を与える溶液のイオン強度です。^[9]

磁気理論を生物学の研究に応用することは、1920年代初頭にドイツで登場し始めた生物物理学的手法である。おそらく最初の実証は1922年にアルフレッド・ハイルブロンによって発表されたものであり、彼の研究は原形質体の粘度を調べたものである。^[10]翌年、フロイントリッヒとザイフリツは棘皮動物の卵のレオロジーについて研究した。どちらの研究にも、細胞への磁性粒子の挿入と、その結果生じる磁場勾配内での動きの観察が含まれていた。^[11]

1949年、ケンブリッジ大学でフランシス・クリックとアーサー・ヒューズがこの技術の斬新な使い方を実証し、「磁性粒子法」と名付けました。もともとオナー・フェル博士が考案したこのアイデアは、培養された細胞全体によって貪食された小さな磁性ビーズを外部磁場によって操作できるというものでした。組織培養は磁性物質の存在下で成長させられ、磁性粒子を含む細胞は高倍率顕微鏡で観察できました。磁性粒子が磁場によって細胞内を移動すると、細胞質の物理的特性に関する測定が行われました。^{[12]彼らの方法と測定の一部は、自他ともに認めるほど粗雑なものでしたが、彼らの研究は磁場粒子操作の有用性を実証し、この技術のさらなる開発への道を拓きました。磁性粒子貪食法は、細胞全体の細胞質}レオロジーやその他の物理的特性の研究に長年使用され続けました。^{[13] [14]}

1990年代の革新により、当時登場した光ピンセット法に似た方法で、この技術の有用性が拡大しました。個々のDNA分子を磁気ビーズとガラススライドの間で化学的にリンクすることで、研究者は単一のDNA分子を外部磁場で操作できるようになりました。分子にねじり力を加えると、自由形状の動きからの偏差を理論的な標準力曲線またはブラウン運動解析と比較して測定できます。これにより、弾性などのDNAの構造的および機械的特性に関する洞察が得られました。^{[15] [16]}

実験技術としての磁気ピンセットは、その用途と応用が非常に多様化している。最近では、さらに新しい方法の導入が発見または提案されている。2002年以来、多くの結合分子と平行な磁気ビーズを含む実験の可能性が探求され、特にDNA結合タンパク質の場合に相互作用の力学が明らかになってきた。^[17] 2005年には、磁気ビーズを分子受容体でコーティングし、ガラススライドをそのリガンドでコーティングする技術が発表された。これにより、受容体-リガンド解離力を独自の方法で観察することができる。^[18] 2007年には、KollmannsbergerとFabryによって細胞全体を磁気的に操作する新しい方法が開発された。この技術では、ビーズを細胞外マトリックスに付着させ、膜の外側から細胞を操作して構造弾性を調べる。^{[11]この方法は、}レオロジーや細胞構造タンパク質の研究手段として引き続き使用されている。^[19] 2013年に発表された研究では、磁気ピンセットを使用して、単一のニューロンSNARE複合体全体を磁気ビーズとスライドの間に固定し、印加磁場の力を使用して複合体を引き離すことで、複合体の巻き戻しと巻き戻しを機械的に測定した。^[20]

磁気ピンセットは、細胞全体のレオロジー（物質の流れと弾性の研究）などの機械的特性を測定するために使用できます。前述の貪食法は、細胞内の磁性ビーズを捕捉するのに役立ちます。外部磁場からの操作に応じて細胞内のビーズの動きを測定すると、細胞内の物理的環境と内部媒体のレオロジー（細胞質の粘性、内部構造の剛性、粒子の流れやすさ）に関する情報が得られます。^{[12] [13] [14]}

フィブロネクチンでコーティングされた磁性ビーズを介して磁性ビーズを細胞外マトリックスに付着させることにより、細胞全体を磁気的に操作することもできます。フィブロネクチンは細胞外膜タンパク質に結合するタンパク質です。この技術により、細胞の硬さの測定が可能になり、構造タンパク質の機能についての洞察が得られます。^{[11]右に示す概略図は、マウス細胞の構造タンパク質}プレクチンを研究するためにBonakdar と Schilling ら (2015) ^[19]が考案した実験セットアップを示しています。硬さは、外部の磁気操作に対するビーズの位置に比例して測定されました。

単一分子法としての磁気ピンセットは、近年最も一般的に使用されている方法であることは間違いありません。単一分子法を通じて、分子ピンセットは生物学的高分子の物理的および機械的特性を詳細に調べることができます。光ピンセットなどの他の単一分子法と同様に、この方法は、周囲の分子の影響を受けずに個々の分子を分離して操作する方法を提供します。^[17]ここでは、磁気ビーズが対象の分子によって固定面に取り付けられます。DNAまたはRNAは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形式で固定される場合があり、DNAホリデイジャンクション、DNAヘアピン、またはヌクレオソームとクロマチン全体などの構造モチーフ全体を固定することもできます。磁気ビーズに磁場を作用させることで、さまざまな種類のねじり力を適用してDNA内相互作用を研究することができます。 ^[21]また、染色体中のトポイソメラーゼやヒストンとの相互作用も研究することができます。^[17]

しかし、磁気ピンセットは、複合体間および複合体内の相互作用も観察できるという点で、他の単一分子法の能力を超えています。これにより、DNA結合タンパク質、受容体-リガンド相互作用、^[18]、および制限酵素切断に関する最近の理解が深まりました。^[17]磁気ピンセットの最近の応用は、単一複合体研究で見られます。DNAを結合剤として使用することで、分子複合体全体をビーズと結合表面の間に取り付けることができます。磁気ビーズに力を加えてDNAヘアピンを引き離すのとまったく同じように、複合体全体を引き離し、解離に必要な力を測定することができます。^[20]これは、受容体-リガンド相互作用を磁気ピンセットで引き離して解離力を測定する方法にも似ています。^[18]

このセクションでは、磁気ピンセットの特徴を、他の最も重要な単一分子実験方法である光ピンセットと 原子間力顕微鏡の特徴と比較します。磁気相互作用は、使用される超常磁性マイクロビーズに非常に特異的です。磁場は実質的にサンプルに影響を与えません。光ピンセットには、屈折率のコントラストにより、レーザービームが生物学的サンプルの他の粒子とも相互作用する可能性があるという問題があります。それに加えて、レーザーは光損傷とサンプルの加熱を引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡の場合、研究対象の分子と先端の相互作用を他の非特異的な相互作用と区別することも難しい場合があります。

トラップの剛性が低いため、磁気ピンセットでアクセスできる力の範囲は、他の 2 つの技術と比較して低くなります。磁気ピンセットでトルクを及ぼす可能性は他に類を見ません。光学ピンセットも、円偏光レーザー ビームと組み合わせて複屈折マイクロビーズを操作することで、この機能を提供できます。

磁気ピンセットのもう一つの利点は、多数の単一分子測定を並行して実行することが容易なことです。

磁気ピンセットの重要な欠点は、ビデオ顕微鏡によるデータ取得のため、時間的および空間的解像度が低いことです。^[3]しかし、高速カメラを追加することで、時間的および空間的解像度がオングストロームレベルに達することが実証されています。^[22]

• De Vlaminck, I.; Dekker, C. (2012). 「磁気ピンセットの最近の進歩」。Annual Review of Biophysics . 41 : 453–472. doi :10.1146/annurev-biophys-122311-100544. PMID  22443989.