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DNA巻き戻し要素（DUEまたはDNAUE ）は、 DNA合成の複製起点にあるDNAの二重らせん構造を開く開始部位です。[1] ATに富み、らせん安定性が低いため変性しやすいため、[2]一本鎖領域が複製起点認識複合体によって認識されます。
DUE は原核生物と真核生物の両方に見られますが、最初に発見されたのは Huang Kowalski による酵母と細菌の起源です。[3] [4] DNA がほどけることで、複製機構は新しく一本鎖になった部分にアクセスできるようになります。[1]真核生物では、DUE は複製開始に必要な DNA ほどき要素結合 (DUE-B) タンパク質の結合部位です。[3]原核生物では、DUE はDnaA 結合ドメインの 5' 末端に隣接するタンデムコンセンサス配列の形で見つかります。 [2]これらの AT に富む要素でのほどきは、負の超らせん力により起源結合タンパク質が存在しない場合でも発生するため、エネルギー的に有利な動作となります。[2] DUE は通常、複製起源の 30～100 bp にわたって見られます。[4] [5]
関数
DUE の特定の巻き戻しにより、一本鎖 DNA の複製部位で開始複合体の組み立てが可能になることが、Huang Kowalski によって発見されました。[4] DNAヘリカーゼと関連酵素は、巻き戻された領域に結合して、複製フォークの開始点を作成できます。この二重鎖領域の巻き戻しは、特定の塩基スタッキング相互作用によって引き起こされるらせんの不安定性と、対抗するスーパーコイル化の組み合わせにより、自由エネルギー要件が低くなります。[4] [6]負のスーパーコイル化により、ねじれ応力の減少によって、DNA は融解時に安定します。[5]細菌と酵母の両方の複製起点に見られ、一部の哺乳類の複製起点にも存在します。[5]長さは 30～100 bp であることがわかっています。[4] [5]
原核生物
原核生物では、ほとんどの場合、DNA複製は1本のDNA配列上の1つの複製起点から起こります。このゲノムが線状であろうと環状であろうと、細菌は複製を起こすために必要な独自の機構を持っています。[7]
プロセス
細菌では、タンパク質DnaAが複製開始因子である。[8]これは DnaA ボックス配列で oriC にロードされ、そこで結合してフィラメントを組み立て、二重鎖を開き、DnaCの助けを借りてDnaB ヘリカーゼをリクルートする。DnaA は高度に保存されており、2 つの DNA 結合ドメインを持つ。この DnaA ボックスのすぐ上流には、3 つのタンデム 13 マー配列がある。5' から 3' にかけて L、M、R とラベル付けされたこれらのタンデム配列は、細菌の DUE である。これらの AT に富む 3 つの領域のうち 2 つ (M と R) は、DnaA が DnaA ボックスに結合すると、ほどける二重鎖に近接してほどける。この DnaA ボックスから最も遠い最後の 13 マー配列 L は、最終的にそれを取り囲む DnaB ヘリカーゼによってほどかれる。これにより、DNA 複製が続行される複製バブルが形成される。[2]
古細菌は、真核生物の複製起点認識複合体のより単純な相同体を使用して、複製起点を、複製起点認識ボックス（ORB）と呼ばれる配列で見つけます。[9]
好感度
これら 3 つの DUE の巻き戻しは、DNA 複製を開始するために必要なステップです。DnaA ボックス配列での二重鎖融解による遠距離からの引力により、M および R DUE 部位でのさらなる融解が誘発されます。その後、より遠距離の L 部位が DnaB 結合によって巻き戻されます。これらの 13 mer 部位の巻き戻しは、oriC 結合タンパク質とは無関係です。巻き戻しを引き起こすのは、負のスーパーコイルの生成です。[2]
3つの大腸菌DUEにおけるDNAの巻き戻し速度は、核共鳴分光法によって実験的に比較されました。生理学的条件下では、ATに富む配列のそれぞれにおける開口効率は互いに異なっていました。これは主に、周囲の遠く離れた配列が異なるためです。[2]
さらに、AT/TA塩基対の融解はGC/CG塩基対の融解よりもはるかに速いことがわかった（15～240秒−1対約20秒−1）。これは、AT配列は解けやすいため、DUE要素では進化的に有利であるという考えを裏付けている。[2]
コンセンサスシーケンス
大腸菌でDUEとして特定された3つの13塩基配列は、記録されているすべての腸内細菌の複製起点でよく保存されています。保存された細菌の比較によって一般的なコンセンサス配列が作成され、11塩基配列GATCTnTTnTTTTが形成されました。大腸菌は、 13塩基配列内のoriCに11塩基コンセンサス配列の9塩基を含んでいます。これらの配列は、単一の複製起点でのみ見られ、ゲノム配列内の他の場所には存在しません。[2]
真核生物
真核生物の複製機構は原核生物のものと比較的よく似ていますが、より細かく調整されています。[10]各 DNA 分子が 1 回だけ複製され、適切な場所で適切なタイミングで複製されるようにする必要があります。[7]細胞外シグナルに反応して機能し、組織ごとに異なる分裂の開始を調整します。外部シグナルはサイクリンを生成して S 期の複製をトリガーし、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)を活性化して複合体を形成します。[10]
真核生物における DNA 複製は、複製起点認識複合体(ORC) が複製起点に結合することで開始されます。これはG 1細胞期に発生し、細胞周期をS 期に進める役割を果たします。この結合により、さらなる因子が結合して複製前複合体 (pre-RC) が作成されます。pre-RC は、サイクリン依存性キナーゼ (CDK) と Dbf4 依存性キナーゼ (DDK) が結合すると開始されます。開始複合体により、MCM ヘリカーゼ活性化因子 Cdc45 がリクルートされ、その後、複製起点で二重鎖がほどかれます。[10] [11]
真核生物における複製は配列上の複数の部位で開始され、複数の複製フォークが同時に形成される。この効率は、複製する必要がある大規模なゲノムに必要となる。[10]
真核生物では、ヌクレオソーム構造が複製開始を複雑にすることがある。[4]ヌクレオソーム構造はDUE-BのDUEへのアクセスをブロックし、転写開始を抑制することがある。[4]速度を阻害することがある。しかし、真核生物DNAの直線的な性質は、原核生物の環状DNAと比較して、ヌクレオソームから適切にほどかれた二重鎖をほどくのが容易である。[4] DUEの活性は、ABF1などの転写因子によって調節されることがある。[4]
酵母
真核生物の複製をよく表す一般的な酵母モデル系はサッカロミセス・セレビシエである。[12]この酵母は、プラスミド内で形質転換され、良好に維持される自律複製配列（ARS）を有する。これらのARSの一部は、複製起点として機能するとみられている。これらのARSは、A、B、Cの3つのドメインから構成される。Aドメインには、ACSと呼ばれるARSコンセンサス[5]配列が存在する。BドメインにはDUEが含まれる。最後に、Cドメインはタンパク質間相互作用を促進するために必要である。[12] ARSは16の染色体に分布しており、30～40 kbごとに繰り返されている。[12]
種によってARS配列は異なりますが、A、B、Cドメインはよく保存されています。[12] DUE（ドメインB）の変化は、複製開始におけるARS全体の機能低下を引き起こします。これは、イミノ交換とNMR分光法を用いた研究によって発見されました。[2]
哺乳類
DUEはこれまでにいくつかの哺乳類の複製起点に見つかっています。一般的に、哺乳類の複製起点はほとんど分析されていないため、定義された複製起点においてDUEがどの程度普及しているかを判断するのは困難です。[5]
ヒト細胞の起源については、いまだにほとんど解明されていない。[5]複製は、c-mycやβ-グロビン遺伝子などの既知のタンパク質に関連する大きな開始領域領域で開始されることが知られている。DUEを持つものは、酵母細胞とほぼ同じように機能すると考えられている。[5]
哺乳類細胞のプラスミドの起源であるSV40は、 T-agヘキサマーと関連していることがわかっており、これが逆のスーパーコイル構造を導入して鎖の巻き戻しの容易さを高めている。[4]
DUEを持つ哺乳類は、ほどけたDNAの一本鎖安定性を提供する構造形成能力の証拠を示しています。これには十字形構造、分子内三重鎖などが含まれます。[5]
DUE結合タンパク質
DNA巻き戻し要素タンパク質（DUE-B）は真核生物に存在します。[3]
それらは、DUEに結合して鎖分離を開始するように作用する。[3] DUE -B配列相同体は、魚類、両生類、げっ歯類など、様々な動物種で発見されている。 [3] DUE-Bは、このC末端を認識することによってDUEに結合する無秩序なC末端ドメインを有する。[3]この相互作用には他の配列特異性はない。[3] DUE-B配列の長さに沿って変異を誘発することによって確認されたが、すべてのケースで二量体化能力は損なわれていない。[3] DNAに結合すると、C末端は整列し、プロテアーゼ分解に対する安定性が増す。 [3] DUE-Bは合計209残基で、そのうち58はDUEに結合するまで無秩序である。[3] DUE-Bは機能するためにATPを加水分解する。[3]また、アミノアシルtRNA合成酵素に類似した配列を有し、以前はそのように分類されていた。[13] DUE-Bはホモ二量体を形成し、その全体に広がる拡張βシート二次構造を形成します。[3]これらのホモ二量体のうち2つが一緒になって、全体的に非対称なDUE-B構造を形成します。[3]
pre-RCの形成において、Cdc45はDUE-Bとの相互作用を介して活性のためにDUEに局在する。[11]これにより二重鎖の巻き戻しと複製の開始が可能になる。[11]
ヒトでは、DUE-Bは酵母の相同遺伝子よりも60アミノ酸長い。[13]どちらも主に核内に局在する。[13]
DUE-B レベルは細胞周期に関係なく一定量である。[13]しかしS 期では、DUE-B は早期複製を防ぐために一時的にリン酸化されることがある。 [13] DUE-B 活性は共有結合的に制御される。[13] DUE 領域でのこれらの DUE-B の組み立ては、局所キナーゼおよびホスファターゼ活性に依存する。[13] DUE-B はsiRNAによってダウンレギュレーションされることもあり、 G1期の延長に関与していることが示唆されている。[13]
突然変異の影響
DUE部位での巻き戻しを阻害する変異は、DNA複製活性を直接阻害します。[14]これは、DUE領域の欠失/変更、反応性試薬の添加、または特定のヌクレアーゼの添加の結果である可能性があります。[4]ただし、DUE部位は点突然変異に対して比較的鈍感であり、タンパク質結合部位の塩基を変更しても活性を維持します。[4]多くの場合、DUE活性は温度を上げることで部分的に回復できます。[4] DUE部位の再追加によっても回復できます。[3]
DUEに重度の突然変異があり、DUE-Bに結合しなくなった場合、Cdc45はc-myc転写因子と結合できず、結合しません。これは、DUE配列の疾患関連（ATTCT）（n）長さ拡張で回復できます。DUE活性が過剰に回復すると、異常な起源形成と細胞周期の進行を引き起こす可能性があります。[11]
真核生物では、DUE-Bがノックアウトされると、細胞はDNA複製が行われるS期に移行しません。その結果、アポトーシスが増加します。 [3]しかし、異なる種のDUE-Bを再添加することで活動を回復させることができます。これは、DUE-Bが種間で相同であるためです。[3]たとえば、アフリカツメガエルの卵子のDUE-Bが変異すると、DNA複製は行われなくなりますが、HeLa DUE-Bを追加することで完全な機能を回復できます。[3]
参考文献
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