DNAポリメラーゼI

DNAポリメラーゼI
クレノウ断片 (左) と DNA ポリメラーゼ I (右) の機能ドメイン。
識別子
生物	大腸菌（K-12株 MG1655株）
シンボル	ポラ
エントレズ	948356
ＰＤＢ	1DPI
RefSeq (プロテイン)	NP_418300.1
ユニプロット	P00582
その他のデータ
EC番号	2.7.7.7
染色体	ゲノム: 4.04 - 4.05 Mb
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DNAポリメラーゼI（またはPol I）は、原核生物のDNA複製のプロセスに関与する酵素です。1956年にアーサー・コーンバーグによって発見され、 ^[1]最初のDNAポリメラーゼ（およびあらゆる種類のポリメラーゼの最初のもの）でした。最初は大腸菌で特徴付けられ、原核生物に遍在しています。大腸菌と他の多くの細菌では、 Pol Iをコードする遺伝子はpolAとして知られています。大腸菌Pol I酵素は928個のアミノ酸で構成されており、プロセッシブ酵素の例であり、一本鎖テンプレートを解放することなく、複数の重合ステップを順番に触媒することができます。^[2] Pol Iの生理学的機能は主に損傷したDNAの修復をサポートすることですが、 RNAプライマーを削除してリボヌクレオチドをDNAに置き換えることで 岡崎断片を結合するのにも貢献しています。

1956年、アーサー・コーンバーグと同僚は、大腸菌（E. coli ）抽出物を使用してDNA合成アッセイを開発し、Pol Iを発見しました。科学者は、 RNAではなくDNAの放射性ポリマーを回収できるように、 ¹⁴ C標識チミジンを加えました。DNAポリメラーゼの精製を開始するために、研究者は大腸菌抽出物に硫酸ストレプトマイシンを加えました。これにより、抽出物は核酸を含まない上清（S画分）と核酸を含む沈殿物（P画分）に分離しました。P画分には、Pol IとDNA合成反応に不可欠な熱安定性因子も含まれていました。これらの因子は、核酸の構成要素であるヌクレオシド三リン酸であると特定されました。S画分には、複数のデオキシヌクレオシドキナーゼが含まれていました。^{[3] 1959年、アーサー・コーンバーグと}セベロ・オチョアは「リボ核酸とデオキシリボ核酸の生物学的合成に関与するメカニズムの発見」によりノーベル生理学・医学賞を受賞しました。^[4]

Pol I は主に損傷した DNA の修復に機能します。構造的には、Pol I はアルファ/ベータ タンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、α ヘリックスおよび β ストランドが不規則な配列で発生するタンパク質を包含します。大腸菌DNA Pol I は、3 つの異なる酵素活性を持つ複数のドメインで構成されています。親指、指、手のひらドメインと呼ばれることが多い 3 つのドメインは、DNA ポリメラーゼの活性を維持するために連携して機能します。^[5]手のひらドメインの隣にある 4 番目のドメインには、校正と呼ばれるプロセスで 3' から 5' の方向に誤って組み込まれたヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼ活性部位が含まれています。5 番目のドメインには、DNA または RNA を 5' から 3' の方向に除去する別のエキソヌクレアーゼ活性部位が含まれており、DNA 複製中の RNA プライマーの除去や DNA 修復プロセス中の DNA の除去に不可欠です。

大腸菌は5つの異なるDNAポリメラーゼを産生する：DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリメラーゼIII、DNAポリメラーゼIV、DNAポリメラーゼV。^[6]

DNA複製では、リーディングDNA鎖は複製フォークの移動方向に連続的に伸びるのに対し、ラギングDNA鎖は岡崎断片として反対方向に不連続に伸びる。^[7] DNAポリメラーゼもDNA鎖を開始できないため、プライマーと呼ばれる短いRNAまたはDNAセグメントによって開始されなければならない。^[5] DNA重合が起こるためには、2つの要件を満たす必要がある。まず、すべてのDNAポリメラーゼはテンプレート鎖とプライマー鎖の両方を持っている必要がある。RNAとは異なり、DNAポリメラーゼはテンプレート鎖からDNAを合成できない。合成は、プライマーゼによって5'から3'方向に合成されるRNAプライマーと呼ばれる短いRNAセグメントによって開始されなければならない。次に、既存のDNA鎖またはRNAプライマーの末端の3'ヒドロキシル基にdNTPが付加されることによってDNA合成が起こる。第二に、DNAポリメラーゼは、既存の鎖に水素結合を介してのみ新しいヌクレオチドを追加できます。^[6]すべてのDNAポリメラーゼは同様の構造を持っているため、2つの金属イオン触媒ポリメラーゼメカニズムを共有しています。金属イオンの1つはプライマー3'ヒドロキシル基を活性化し、次にdNTPの一次5'リン酸を攻撃します。2番目の金属イオンは、離脱する酸素の負電荷を安定化し、その後、2つのリン酸基をキレートします。^[8]

DNAポリメラーゼのポリメラーゼドメインのX線結晶構造は、人間の右手に例えて説明されています。すべてのDNAポリメラーゼには3つのドメインがあります。最初のドメインは「フィンガードメイン」と呼ばれ、dNTPと対になったテンプレート塩基と相互作用します。また、「フィンガードメイン」はテンプレートと相互作用して、活性部位に正しく配置します。^[9]「パームドメイン」と呼ばれる2番目のドメインは、リン酸基の転移反応を触媒します。最後に、「サムドメイン」と呼ばれる3番目のドメインは、二本鎖DNAと相互作用します。^[10]エキソヌクレアーゼドメインには独自の触媒部位があり、誤った対になった塩基を除去します。7つの異なるDNAポリメラーゼファミリーのうち、「パームドメイン」は5つのファミリーで保存されています。「フィンガードメイン」と「サムドメイン」は、異なる配列からのさまざまな二次構造要素のため、各ファミリーで一貫していません。^[9]

Pol I は 4 つの酵素活性を持ちます。

1. 5 '→3'（順方向）DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、3'プライマー部位とテンプレート鎖を必要とする
2. 校正を仲介する3'→5'（逆）エキソヌクレアーゼ活性
3. DNA修復中にニックトランスレーションを媒介する5'→3'（順方向）エキソヌクレアーゼ活性。
4. 5'→3'（順方向）RNA依存性DNAポリメラーゼ活性。Pol IはRNAテンプレートに対してDNAテンプレートよりもかなり低い効率（0.1～0.4％）で作用し、この活性はおそらく生物学的に限られた意義しかありません。^[11]

Pol I が主に DNA 複製に使われているのか、それとも DNA 損傷の修復に使われているのかを調べるために、大腸菌の Pol I 欠損変異株を用いた実験が行われた。Pol I を欠損した変異株を分離し、変異原で処理した。変異株は正常に成長し続け、Pol I を欠損した細菌コロニーを生じた。これにより、Pol I は DNA 複製に必要ではないことが確認された。しかし、変異株は紫外線など DNA を損傷する特定の要因に対して極度に敏感であるという特徴も示した。したがって、Pol I は DNA 複製よりも DNA 損傷の修復に関与している可能性が高いことが再確認された。^[6]

複製プロセスでは、RNase H がラギング鎖からRNAプライマー (プライマーゼによって作成)を除去し、次にポリメラーゼ I が5'→3' 方向に岡崎断片( DNA 複製を参照)の間に必要なヌクレオチドを補充し、その過程で間違いがないか校正します。これはテンプレート依存酵素であり、テンプレートとして機能する既存の DNA 鎖と正しく塩基対を形成するヌクレオチドのみを追加します。これらのヌクレオチドが DNA テンプレート鎖と塩基対を形成するのに適切な方向と形状になっていることが重要であり、そうすることでDNA リガーゼがさまざまな断片を 1 つの連続したDNA鎖に結合できます。ポリメラーゼ I の研究では、異なる dNTP がポリメラーゼ I の同じ活性部位に結合できることが確認されています。ポリメラーゼ I は、構造変化を起こした後でのみ、異なる dNTP を積極的に区別できます。この変化が起こると、Pol I は、結合した dNTP とテンプレート鎖上の対応する塩基の間で形成された塩基対の適切な形状と適切な配置をチェックします。活性部位に適合できるのは、A = T および G≡C 塩基対の正しい形状のみです。ただし、10 ⁴～ 10 ⁵ヌクレオチドのうち 1 つは誤って追加されることを知っておくことが重要です。それでも、Pol I は、選択的なアクティブ識別方法を使用して、DNA 複製におけるこのエラーを修正できます。^[5]

ポリメラーゼ I は、初期に特性評価が行われたにもかかわらず、ほとんどの DNA 合成を担う酵素ではないことがすぐに明らかになりました。大腸菌での DNA 複製は毎秒約 1,000 ヌクレオチドの速度で進行しますが、ポリメラーゼ I による塩基対合成速度は、平均して毎秒 10 ～ 20 ヌクレオチドにすぎません。さらに、細胞あたり約 400 分子というポリメラーゼ I の細胞内存在量は、大腸菌に複製フォークが通常 2 つしかないという事実とは相関していませんでした。さらに、ポリメラーゼ I は 25 ～ 50ヌクレオチドを取り込んだだけで脱落するため、ゲノム全体をコピーするには不十分なプロセッシブ性しかありません。1969年にジョン ケアンズがポリメラーゼ活性を欠いた生存可能なポリメラーゼ I変異体を単離したときに、複製におけるポリメラーゼ I の役割が証明されました。 ^{[12]ケアンズの研究室助手であるポーラ デ ルシアは、}大腸菌コロニー から何千もの無細胞抽出物を作成し、DNA ポリメラーゼ活性を測定した。 3,478番目のクローンにはpolA変異体が含まれていたが、これはケアンズによって「ポーラ」[デ・ルシア]にちなんで名付けられた。^[13] DNAポリメラーゼIIIが発見されるまで、主要な複製DNAポリメラーゼは最終的に特定され なかった。

大腸菌から得られるDNAポリメラーゼIは、分子生物学の研究に広く使用されています。しかし、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性のために、多くの用途には適していません。この望ましくない酵素活性は、ホロ酵素から簡単に除去することができ、分子生物学で広く使用されているクレノウ断片と呼ばれる有用な分子を残します。実際、クレノウ断片は、耐熱性TaqポリメラーゼIの供給源であるThermus aquaticusが1976年に発見されるまで、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅の最初のプロトコルで使用されていました。 ^[15] DNAポリメラーゼIをプロテアーゼサブチリシンにさらすと、分子はDNAポリメラーゼと校正活性のみが保持される小さな断片に切断されます。

• DNAポリメラーゼII
• DNAポリメラーゼIII
• DNAポリメラーゼV