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細胞周期チェックポイントは、真核細胞周期の適切な進行を保証する制御機構です。各チェックポイントは細胞周期の潜在的な終結点として機能し、その間に細胞の状態が評価され、好ましい条件が満たされた場合にのみ細胞周期のさまざまな段階が進行します。細胞周期には多くのチェックポイントがありますが、[ 1 ]主要な 3 つのチェックポイントは、開始チェックポイント、制限チェックポイント、または主要チェックポイントとしても知られる G1 チェックポイント、G2/M チェックポイント、および紡錘体チェックポイントとしても知られる中期から後期への移行です。[ 2 ]これらのチェックポイントを通過する進行は、主にサイクリンと呼ばれる制御タンパク質サブユニットによるサイクリン依存性キナーゼの活性化によって決定され、細胞周期の各段階で異なる形態のサイクリンが産生され、そこで発生する特定のイベントを制御します。[ 3 ] [ 4 ]
すべての生物は、細胞の成長と分裂の繰り返しによって生み出されます。[ 5 ]この細胞周期と呼ばれる過程において、細胞はその内容物を複製し、2つに分裂します。細胞周期の目的は、各生物のDNAを正確に複製し、細胞とその内容物を結果として生じる2つの細胞に均等に分配することです。真核生物では、細胞周期は主に4つの段階から構成されます。G1期は、細胞が代謝的に活発で継続的に成長する段階です。S期は、DNA複製が行われる段階です。G2期は、細胞の成長が続き、細胞が分裂に備えてさまざまなタンパク質を合成する段階です。M期（有糸分裂）は、複製された染色体（姉妹染色分体として知られる）が2つの娘核に分離し、細胞が2つの娘細胞に分裂し、それぞれが完全なDNAのコピーを持つ段階です。[ 6 ]真核細胞の細胞周期と比較すると、原核細胞の細胞周期（二分裂として知られる）は比較的単純で速い。染色体は複製起点から複製され、新しい膜が組み立てられ、細胞壁が隔壁を形成して細胞を2つに分ける。[ 7 ]
真核細胞の細胞周期は複雑なプロセスであるため、真核生物は細胞周期制御システムとして知られる制御タンパク質のネットワークを進化させており、細胞周期における細胞の進行を監視し、指示しています。[ 5 ]このシステムはタイマーまたは時計のように機能し、細胞が細胞周期の各段階で費やす時間を固定すると同時に、制御するプロセスから受け取った情報にも応答します。細胞周期チェックポイントは、DNA複製や染色体分離などの必須プロセス中に発生する欠陥を感知し、欠陥が修復されるまで細胞周期の停止を誘導することで、制御システムにおいて重要な役割を果たしています。 [ 8 ]細胞周期チェックポイントの主な作用機序は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）と呼ばれるタンパク質キナーゼファミリーの活性の調節によるものであり、CDKはサイクリンと呼ばれる様々なクラスの調節タンパク質に結合し、細胞周期の異なる段階で特定のサイクリン-CDK複合体が形成されて活性化される。これらの複合体は、今度は下流の様々な標的を活性化して、細胞周期の進行を促進または阻害する。[ 9 ]
G1チェックポイントは、哺乳類細胞では制限点、酵母では開始点とも呼ばれ、細胞が細胞周期に入ることを決定づけるポイントです。細胞がG1期を進むにつれて、内部および外部条件に応じて、G1期を遅らせたり、G0期と呼ばれる静止状態に入ったり、制限点を通過したりすることができます。[ 5 ] DNA損傷は、細胞が「制限」して細胞周期に入らない主な兆候です。細胞分裂の新たなラウンドに進む決定は、細胞がサイクリン-CDK依存性転写を活性化し、S期への移行を促進するときに起こります。このチェックポイントは、その後のプロセスを保証します。[ 10 ]
G1期初期には、 E2F転写因子に結合するポケットタンパク質と呼ばれる3つの転写抑制因子が存在する。E2F遺伝子ファミリーは、サイクリン、CDK、チェックポイント調節因子、DNA修復タンパク質など、細胞周期の制御に重要な多くの遺伝子を標的とする転写因子のグループである。E2Fファミリーの調節異常は癌の場合によく見られ、E2FファミリーがDNA複製と分裂の厳密な制御に不可欠であることを示す証拠となっている。[ 10 ] 3つのポケットタンパク質は、網膜芽細胞腫（Rb）、p107、p130であり、これらはE2F転写因子に結合してG1チェックポイントを超える進行を阻止する。
E2F遺伝子ファミリーには、活性化機構を持つタンパク質と抑制機構を持つタンパク質が含まれています。P107とp130は、G1からSへの移行を促進する因子の転写を抑制するE2F4とE2F5の共抑制因子として機能します。第3ポケットタンパク質であるRbは、活性化能力を持つE2Fタンパク質であるE2F1、E2F2、およびE2F3に結合して抑制します。[ 10 ]
正のフィードバックは、特にサイクリン/CDKタンパク質複合体によるRbのリン酸化に関与して、G1期からS期への進行を制御する上で重要な役割を果たします。リン酸基を持たないRb、つまりリン酸化されていないRbは、G0期の細胞周期からの離脱と分化を制御します。G1期の開始時に、成長因子とDNA損傷はサイクリンDレベルの上昇を促し、サイクリンDはCdk4とCdk6に結合してサイクリンD:Cdk4/6複合体を形成します。[ 11 ]この複合体は、リン酸化によってRbを不活性化することが知られています。しかし、Rbのリン酸化の詳細は、G1チェックポイントに関するこれまでの知識と比較して非常に複雑で特異的です。サイクリンD:Cdk4/6は、Rbの14個のアクセス可能な固有のリン酸化部位の1つにリン酸基を1つだけ配置します。つまり、Rbをモノリン酸化します。 14種類の特異的なモノリン酸化アイソフォームはそれぞれE2Fファミリーメンバーに対する結合特異性が異なるため、哺乳類の体内における細胞プロセスの多様性に寄与していると考えられる。[ 11 ]
E2F 4 と E2F 5 は、核内局在を維持するために p107 と p130 に依存しています。しかし、サイクリン D:Cdk 4/6 は p107 と p130 もリン酸化します。このプロセスにより、E2F 4 と 5 との結合が解除され（その後、細胞質へ移動します）、E2F 1～3 が DNA に結合してサイクリン E の転写を開始できるようになります。[ 10 ] Rb タンパク質は、G1 期初期にモノリン酸化状態を維持し、その間にサイクリン E が蓄積して Cdk2 に結合します。
サイクリンE:Cdk2は、G1からSへの移行において、リン酸化の重要な役割も果たします。特に、サイクリンE:Cdk2は、「全か無か」のスイッチを作り出す正のフィードバックループを促進します。多くの遺伝子制御ネットワークでは、正のフィードバックによって細胞が細胞周期の各段階を行ったり来たりしないようにしています[ 12 ]。サイクリンE:Cdk2は、Rbのすべてのリン酸化部位をリン酸化します。これは「過剰リン酸化」とも呼ばれ、Rbの完全な不活性化を保証します。Rbの過剰リン酸化は、後期G1制限点と考えられており、その後、細胞は細胞周期を逆行することはできません。この時点で、E2F 1-3タンパク質がDNAに結合し、サイクリンAとCdc 6を転写します[ 11 ]。
サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1B（CDKN1B）、別名p27は、サイクリンE:Cdk2に結合して阻害により活性化を阻害します。しかし、サイクリンAが蓄積してCdk2に結合すると、複合体を形成してp27を阻害します。G1期サイクリン依存性キナーゼは、S期サイクリン依存性キナーゼと協働してp27を分解の標的とします。これにより、サイクリンA:Cdk2複合体が完全に活性化され、E2F 1-3がリン酸化されてDNAプロモーター部位からの解離が開始されます。これにより、E2F 6-8がDNAに結合して転写を阻害します。[ 10 ] 阻害因子p27を効果的に阻害するために使用される負のフィードバックループは、細胞が細胞周期を通して一方向の移動と逆戻りがないことを保証するために使用するもう1つの重要なプロセスです。
DNA損傷が発生した場合、または細胞がG1期での細胞周期の遅延または停止を必要とする欠陥を検出した場合、いくつかのメカニズムによって細胞周期停止が起こります。迅速な応答には、損傷の種類に応じてセンサーとして機能するキナーゼATM（Ataxia telangiectasia mutated）またはATR（Ataxia Telangiectasia and Rad3 related）のいずれかから始まるリン酸化イベントが含まれます。これらのキナーゼは、それぞれエフェクターキナーゼChk2およびChk1をリン酸化して活性化し、次にホスファターゼCdc25Aをリン酸化してユビキチン化および分解の目印を付けます。Cdc25Aは、CDK2から阻害性リン酸を除去することによって前述のサイクリンE-CDK2複合体を活性化するため、Cdc25Aが存在しない場合、サイクリンE-CDK2は不活性のままであり、細胞はG1期にとどまります。
細胞周期停止を維持するために、別の反応が開始され、Chk2またはChk1が腫瘍抑制因子であるp53をリン酸化します。これにより、p53は、分解の標的とすることでp53を阻害するユビキチンリガーゼであるMdm2との結合を阻害され、安定化されます。安定化したp53は、G1からSへの移行を促進する複合体であるサイクリンE-CDK2の阻害因子であるp21を含む、いくつかの標的遺伝子の転写活性化因子として機能します。さらに、p21が活性化される別のメカニズムは、DNA損傷に応答してp16が蓄積することです。p16はサイクリンD-CDK4複合体を破壊し、複合体からp21を放出します。これにより、Rbの脱リン酸化と活性化が起こり、RbがE2F 1-3に結合して阻害し、細胞がS期に移行しないようにします。[ 13 ]最近、このモデルのいくつかの側面が議論されています。[ 14 ]
S期におけるDNA複製後、細胞はG2期と呼ばれる成長期に入ります。この間、必要な有糸分裂タンパク質が産生され、細胞は再び制御機構の影響を受け、増殖期である有糸分裂（M）期への移行に適した状態が維持されます。G2期からM期への移行には複数の機構的チェックポイントが関与しており、サイクリン-Cdk活性が共通の因子となっています。
生物種によって必要なサイクリン-Cdk複合体のバリエーションは存在するが、キナーゼ活性の必要性は保存されており、通常は単一のペアリングに焦点が当てられている。分裂酵母では3種類の有糸分裂サイクリンが存在し、出芽酵母では6種類存在するが、主に利用されるサイクリンはサイクリンBである。[ 15 ]サイクリンBは、G2/Mチェックポイント移行の議論の参照として機能する。
S期と同様に、G2期にもDNA損傷チェックポイントが存在する。細胞は再びDNA損傷部位や不完全な複製部位について検査され、キナーゼATRとATMが損傷部位にリクルートされる。Chk1とChk2の活性化、およびp53の活性化も起こり、細胞周期停止を誘導して有糸分裂への進行を阻止する。S期のもう1つの構成要素である複製前複合体は、サイクリンB-Cdk1リン酸化によって不活性化されなければならない。[ 16 ]
これらの以前のチェックポイントが評価されると、G2タンパク質の蓄積は、複数のメカニズムを介してサイクリンB-Cdk1活性を活性化する役割を果たします。サイクリンA-Cdk2は、サイクリンB-Cdk1の活性化因子であるCdc25を活性化し、Cdc25はサイクリンB-Cdk1阻害因子であるWee1を不活性化します。これにより、正のフィードバックループが生じ、サイクリンBの発現とCdk1の活性化が大幅に増加します。細胞がG2期を経てG2/M期移行期に達すると、キナーゼPlk1がWee1をリン酸化し、Wee1はSCFユビキチンリガーゼ複合体を介して分解されます。[ 17 ] Plk1のもう1つの機能は、リン酸化を介してCdc25を活性化することです。Wee1の分解とCdc25の活性化の複合効果は、cdc2からの阻害リン酸化の正味の除去であり、これによりcdc2が活性化されます。 Plk1は、G2期に蓄積して活性化複合体を形成するAurora AとBoraによってG2/M期移行時に活性化される。Plk1-Cdc2-cdc25複合体は、Cdc2をさらに活性化する正のフィードバックループを開始し、G2期中のサイクリンBレベルの上昇と相まって、結果として生じるcdc2-サイクリンB複合体は、有糸分裂への移行を促進する下流の標的を活性化する。[ 18 ]結果として生じるCdk1活性は、G2/M期移行遺伝子であるMem1-Fkhの発現も活性化する。[ 19 ] M期開始はヒステリシスを伴う全か無かの事象であるため、サイクリンB-Cdk1活性の急速な急増が必要である。サイクリンBを介したCdk1活性のヒステリシスは、サイクリンB濃度の最小閾値を確立することによってM期への移行を促進する。これは、M期への移行後に継続するために必要な最低限のレベルよりも高いレベルで存在し、全か無かの事象を保護する役割を果たします。不完全なDNA複製の場合、この移行濃度はさらに増加し、G2/M移行点に別の制御機構が追加されます。[ 20 ]ヒステリシスの存在により、サイクリンB-Cdk1活性に応じてM期への移行が高度に制御されます。
DNA損傷に応答して有糸分裂への移行が阻止されるメカニズムは、G1/Sチェックポイントのメカニズムと類似している。DNA損傷は、前述のATM/ATR経路の活性化を引き起こし、この経路ではATM/ATRがChk1/Chk2チェックポイントキナーゼをリン酸化して活性化する。Chk1/2はcdc25をリン酸化し、cdc25は阻害されるだけでなく、14-3-3タンパク質によって細胞質内に隔離される。14-3-3はp53によって発現が亢進され、p53は前述のようにChk1とATM/ATRによって活性化される。p53はp21も転写活性化し、p21と14-3-3はともにcdc2のリン酸化と細胞質内隔離によってサイクリンB-cdc2複合体を阻害する。さらに、cdc25の不活性化は、cdc2の脱リン酸化と活性化を阻害する。[ 21 ] [ 22 ]最後に、損傷応答の別のメカニズムは、ATM/ATRによるPlk1の負の制御を介するものであり、その結果Wee1とMyt1が安定化し、cdc2をリン酸化して阻害し、損傷が修復されるまで細胞をG2期で停止させる。[ 23 ]
G2期の終わりに、細胞は核分裂を起こす有糸分裂期へと移行します。G2期からM期への移行は劇的で、全か無かの二択であり、不可逆的な変化です。これは細胞にとって有利です。なぜなら、有糸分裂期への移行は細胞のライフサイクルにおいて極めて重要な段階だからです。もし細胞が完全に分裂を完了しなければ、不完全な分裂によって多くの問題が生じ、最終的には細胞死に至る可能性が高くなります。
カエルの卵母細胞では、プロゲステロンが膜結合型受容体に結合するとシグナル伝達カスケードが誘導される。下流ではMosが活性化される。MosはMEK1をリン酸化し、MEK1はMAPKをリン酸化する。MAPKは2つの役割を果たす。1つはサイクリンB-Cdk1複合体を活性化して有糸分裂への移行を開始させること、もう1つはMosを活性化することである。Mosの活性化は正のフィードバックループを引き起こし、有糸分裂への移行を「オンオフ」で制御する「トグルスイッチ」として機能する。
このフィードバックループは、プロゲステロン濃度の上昇に伴ってMAPK-P（リン酸化MAPK）濃度が上昇することを示すことで初めて発見されました。[ 24 ]単一細胞レベルでは、各細胞は完全にリン酸化されたMAPKを持つか、リン酸化MAPKを持たないかのどちらかであり、各細胞でスイッチのようなメカニズムとして機能していることが確認されました。さらに、Mosタンパク質の合成を阻害するとMAPK-Pの応答がより段階的になることが示され、Mosタンパク質の合成がMAPK活性化の全か無かの性質に必要であることが示されました。[ 25 ]
このプロセスは不安定性を用いて理解できます。右のグラフを見ると、プロゲステロンの添加量が増加するにつれてMos合成速度が変化することがわかります。各曲線には、安定固定点と不安定固定点が存在します。不安定固定点では、システムは安定固定点のいずれかに向かって移動します。つまり、システムは「オン」状態か「オフ」状態のどちらか一方しか存在せず、中間状態はありません。プロゲステロン濃度が十分に高くなると、Mos曲線は上方にシフトし、最終的に分解線と一点で交差するため、安定な「オン」状態は1つしか存在せず、有糸分裂への移行を示します。
有糸分裂の遷移点に見られる不可逆性は、細胞内のプロゲステロン濃度が十分に高いことに起因します。プロゲステロン濃度が十分に高い場合、MAPKとMOS間の正のフィードバックループの結果として、システムは単安定状態になります。システムが双安定状態から単安定状態に切り替わる点を、サドルノード分岐と呼びます。
つまり、分子調節因子の数理モデルを正のフィードバックの存在に依存する双安定系として捉えることで、有糸分裂移行の全か無かの不可逆的な反応を理解することができる。「オフ状態」は十分な量のプロゲステロンによって消滅し、細胞がオフ状態を通過すると、オン状態に固定される。
この双安定モデルから、有糸分裂の遷移はヒステリシスに依存して進行すると理解できます。ヒステリシスは、システムの現在の状態がその履歴に依存することと定義されます。ノバック・タイソンモデルは、細胞周期の進行に関する数学モデルであり、有糸分裂への進入と退出の不可逆的な遷移はヒステリシスによって駆動されると予測します。このモデルには、細胞周期の進行がヒステリシスに依存する周期的な卵母細胞抽出物で真であるはずの3つの基本的な予測があります。[ 26 ]
Sha らは2003 年にアフリカツメガエル卵抽出液で実験を行い、このヒステリシス特性を実証した。 [ 27 ]サイクリン B の活性化閾値は 32 ～ 42 nM であるのに対し、不活性化閾値は 16 ～ 24 nM の Δcyclin B であることを観察した。したがって、これらの実験により、このシステムの双安定性と、この細胞周期移行におけるヒステリシスの重要性が確認された。中間のサイクリン B 濃度では、細胞は間期または分裂期のいずれかの状態になる可能性がある。
有糸分裂への移行は細胞にとって大きなコストのかかる作業であるため、この段階への時期尚早な移行を防ぐためのシステムが備わっているのは当然である。DNAの複製されていない部分が存在するなど、以前の段階でのミスが細胞周期の進行を阻害することが示されている。[ 28 ]ノバック・タイソンモデルは、有糸分裂への移行に必要なサイクリンBのレベルを上昇させることによってこれが起こると予測している。[ 26 ]
Shaらは、これがアフリカツメガエル卵抽出物でも当てはまるかどうかを調査した。彼らはアフィジコリン（APH）を用いてDNAポリメラーゼを阻害し、DNA複製を阻止した。間期にサイクリンBで処理すると、活性化の閾値はNovak–Tysonモデルで予測されたように80～100 nMに上昇した。[ 27 ]したがって、これらの実験は、細胞内の未複製DNAのストレスがヒステリシスループに影響を与え、有糸分裂に入るためのサイクリンBの閾値がはるかに高くなることを確認している。
有糸分裂紡錘体チェックポイントは、中期においてすべての染色体が有糸分裂板に整列し、双極性張力の下にあるべき/既に整列している時点で発生します。この双極性結合によって生じる張力が感知され、後期への移行が開始されます。これを行うために、感知機構は後期促進複合体（APC/C）がもはや阻害されていないことを確認し、APC/CはDボックス（破壊ボックス）を持つサイクリンBを分解し、セキュリンを分解できるようになります。[ 29 ]後者は、姉妹染色分体の凝集に関与するタンパク質複合体であるコヒーシンを切断するセパラーゼを阻害する機能を持つタンパク質です。 [ 30 ]この阻害タンパク質がユビキチン化とそれに続くタンパク質分解によって分解されると、セパラーゼは姉妹染色分体の分離を引き起こします。[ 31 ]細胞が2つの娘細胞に分裂した後、細胞はG1期に入ります。
DNA修復プロセスと細胞周期チェックポイントは、それぞれゲノムの安定性と細胞の進行を制御する機能のため、癌と密接に関連している。これらの経路の機能不全と特定の癌の発症を結びつける正確な分子メカニズムは、ほとんどの場合よく理解されていない。[ 32 ] ATMの喪失は、おそらく過剰な相同組換えによって高いゲノム不安定性につながるため、リンパ腫の発症に先行することが示されている。[ 33 ]マウスにおけるChk1の破壊は、細胞周期チェックポイントの重大な誤制御、DNA損傷の蓄積、および腫瘍形成の発生率の増加をもたらした。[ 34 ] BRCA1またはBRCA2の単一変異の遺伝は、女性を乳癌および卵巣癌に罹患しやすくする。[ 35 ] BRCA1はS期およびG2/M期の移行に必要であることが知られており、DNA損傷に対する細胞応答に関与している。 BRCA2は相同組換えとS期チェックポイントの制御に関与していると考えられており、BRCA2の変異や欠損は腫瘍形成と強く関連している。[ 36 ]
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