分子生物学

分子生物学 / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər /は、生体分子の合成、修飾、メカニズム、相互作用など、細胞内および細胞間の生物学的活動の分子的基礎を理解することを目指す生物学の分野です。 ^{[1] [2] [3]}

細胞やその他の微細構造は18世紀にはすでに生体内で観察されていましたが、その動作を支配するメカニズムや相互作用に関する詳細な理解は、物理学や化学の技術が生物学への応用を可能にするほど進歩した20世紀まで生まれませんでした。「分子生物学」という用語は、1945年に英国の物理学者ウィリアム・アストベリーによって初めて使用され、彼はこれを、生物学的現象の根底を理解する、つまり生物学的分子の物理的・化学的構造と特性、および他の分子との相互作用、そしてこれらの相互作用が、より大規模でより高レベルの組織化における生物学的プロセスを研究するいわゆる古典的生物学の観察をどのように説明するかを明らかにすることに重点を置いたアプローチであると説明しました。^[4] 1953年、フランシス・クリック、ジェームズ・ワトソン、ロザリンド・フランクリンと彼らの医学研究評議会ユニット、キャベンディッシュ研究所の同僚は、デオキシリボ核酸（DNA）の化学構造の二重らせんモデルを初めて記述しました。これは、核酸が生物学的遺伝の主要な物質であるというそれまで漠然とした考えを理解するための物理化学的基礎を提供したため、この初期の分野にとって画期的な出来事と見なされることがよくあります。彼らは、フランクリンが行った以前の研究に基づいてこの構造を提唱し、その研究はモーリス・ウィルキンスとマックス・ペルッツから伝えられました。^[5]彼らの研究は、他の微生物、植物、動物におけるDNAの発見につながりました。^[6]

分子生物学の分野には、科学者が分子プロセスについて学ぶことを可能にする技術が含まれます。^[7]これらの技術は、新薬を効率的に標的にしたり、病気を診断したり、細胞生理学をより深く理解したりするために使用されます。^{[8]分子生物学から生じる一部の臨床研究と医療療法は}遺伝子治療の範疇に入りますが、分子生物学または分子細胞生物学の医療への応用は現在、分子医学と呼ばれています。^[要出典]

分子生物学は生化学と遺伝学の交差点に位置します。20世紀にこれらの科学分野が出現し、発展するにつれて、両者とも重要な細胞機能の根底にある分子メカニズムを解明しようとしていることが明らかになりました。^{[9] [10]}分子生物学の進歩は、新しい技術の開発とその最適化に密接に関連しています。^[11]分子生物学は多くの科学者の研究によって解明されており、したがってこの分野の歴史はこれらの科学者とその実験の理解にかかっています。^[要出典]

遺伝学の分野は、生殖と遺伝の根底にある一連の規則と、遺伝子として知られる仮説上の遺伝単位の性質を理解しようとする試みから生まれました。グレゴール・メンデルは1866年にこの研究の先駆者となり、エンドウの交配研究で観察した遺伝の法則を初めて記述しました。^[12]遺伝のそのような法則の1つは分離の法則で、特定の遺伝子に対して2つの対立遺伝子を持つ二倍体の個体は、これらの対立遺伝子の1つを子孫に伝えると述べています。^{[13]彼の重要な研究により、遺伝の遺伝の研究は一般に}メンデル遺伝学と呼ばれています。^[14]

分子生物学における大きなマイルストーンは、DNAの構造の発見でした。この研究は、1869年にスイスの生化学者フリードリヒ・ミーシャーによって始まりました。彼は、現在ではデオキシリボ核酸、つまり DNA として知られているヌクレインと呼ばれる構造を初めて提唱しました。 ^[15]彼は、膿の詰まった包帯の成分を研究し、「リン含有物質」のユニークな特性に注目することで、このユニークな物質を発見しました。 ^[16] DNA モデルのもう 1 人の著名な貢献者は、酵母の生化学実験の結果として、1919 年に DNA の「ポリヌクレオチド モデル」を提唱したフィーバス・レヴィーンです。 ^[17] 1950 年に、アーウィン・シャルガフはレヴィーンの研究を拡張し、核酸のいくつかの重要な特性を解明しました。まず、核酸の配列は種によって異なるということです。^[18]第二に、プリン（アデニンとグアニン）の総濃度は、常にピリミジン（システインとチミン）の総濃度に等しい。^[15]これは現在シャルガフの法則として知られている。 1953年、ジェームズ・ワトソンとフランシス・クリックは、モーリス・ウィルキンスとマックス・ペルツから伝えられたロザリンド・フランクリンのX線結晶構造^解析に基づいて、DNAの二重らせん構造を発表した。^[5]ワトソンとクリックはDNAの構造を説明し、このユニークな構造がDNA複製の可能性のあるメカニズムにどのような影響を与えるかについて推測した。 ^[19]ワトソンとクリックは、DNAの構造モデルを提案したことにより、1962年にウィルキンスとともにノーベル生理学・医学賞を受賞した。 ^[6]

1961年、遺伝子がタンパク質をコードするとき、遺伝子のDNAの連続する3つの塩基がタンパク質の連続する各アミノ酸を指定することが実証されました。^[20]したがって、遺伝暗号はトリプレットコードであり、各トリプレット（コドンと呼ばれる）が特定のアミノ酸を指定します。さらに、タンパク質をコードするDNA配列ではコドンが互いに重複せず、各配列は固定された開始点から読み取られることが示されました。1962年から1964年にかけて、細菌ウイルスの条件付き致死変異体の使用を通じて、^[21] DNA複製、DNA修復、DNA組換え、および分子構造の組み立ての機構で使用されるタンパク質の機能と相互作用に関する理解が根本的に進歩しました。^[22]

1928年、フレデリック・グリフィスは、実験用ラットを死に至らしめていた肺炎球菌の毒性特性に遭遇した。当時一般的だったメンデルによれば、遺伝子伝達は親細胞から娘細胞にのみ起こると考えられていた。グリフィスは別の理論を提唱し、同世代のメンバー間で起こる遺伝子伝達は水平遺伝子伝達（HGT）として知られていると述べた。この現象は現在、遺伝子形質転換と呼ばれている。^[23]

グリフィスの実験は肺炎球菌を対象にしたもので、この菌には毒性があり滑らかな菌株と、非毒性があり粗い菌株の 2 種類がある。滑らかな菌株は、ある種の特殊な多糖類 (グルコースとグルクロン酸のカプセルのポリマー) があるため、光沢のある外観をしている。この細菌の多糖層のため、宿主の免疫系は細菌を認識できず、宿主は死滅する。非毒性で粗い菌株にはこの多糖類カプセルがなく、鈍くざらざらした外観をしている。^[要出典]

菌株における莢膜の有無は遺伝的に決定されることが知られている。滑面菌株と粗面菌株は、それぞれSI、S-II、S-IIIなど、RI、R-II、R-IIIなど、いくつかの異なるタイプで発生する。S菌とR菌のこれらのサブタイプはすべて、産生する抗原タイプが互いに異なる。^[6]

エイブリー・マクラウド・マッカーティの実験は、1944年に行われた画期的な研究で、細菌では遺伝情報を運ぶのはタンパク質だとそれまで考えられていたが、DNAであることを証明した。オズワルド・エイブリー、コリン・マンロー・マクラウド、マクリン・マッカーティは、マウスに肺炎を引き起こす可能性のある肺炎球菌株の抽出物を使用した。彼らは、抽出物から精製したDNAを細菌に注入することで、細菌の遺伝子変換が達成できることを示した。彼らは、抽出物中のDNAをDNaseで消化すると、無害な細菌が毒性の細菌に変化することがなくなることを発見した。これはDNAが遺伝物質であるという強力な証拠となり、タンパク質が原因であるという当時の通説に疑問を投げかけた。これは、その後ワトソンとクリックがDNAの構造を発見する基礎となった。

DNAが感染の原因となる遺伝物質であるという確証は、ハーシー・チェイス実験によって得られました。彼らは実験に大腸菌とバクテリオファージを使用しました。この実験は、キッチンブレンダーが主要な装置として使用されたため、ブレンダー実験としても知られています。アルフレッド・ハーシーとマーサ・チェイスは、ファージ粒子によって細菌に注入されたDNAには、子孫ファージ粒子の合成に必要なすべての情報が含まれていることを実証しました。彼らは放射能を使用して、バクテリオファージのタンパク質コートに放射性硫黄を、DNAに放射性リンをそれぞれ別の2本の試験管でタグ付けしました。バクテリオファージと大腸菌を試験管で混ぜた後、ファージが大腸菌細胞内の遺伝物質を変換するインキュベーション期間が始まります。次に、混合物を混ぜたり撹拌したりして、ファージを大腸菌細胞から分離します。混合物全体を遠心分離し、大腸菌細胞を含むペレットを確認し、上清を捨てました。大腸菌細胞は放射性リンを示し、これは、変換された物質がタンパク質の殻ではなく DNA であることを示しました。

変換されたDNAは大腸菌のDNAに付着し、放射能はバクテリオファージのDNAにのみ現れます。この変異したDNAは次の世代に受け継がれるため、形質導入の理論が生まれました。形質導入とは、細菌のDNAがバクテリオファージの断片を運び、それを次の世代に渡すプロセスです。これも水平遺伝子伝達の一種です。^[6]

メセルソン・スタール実験は、DNA の半保存的複製の証拠を提供した分子生物学における画期的な実験でした。1958 年にマシュー・メセルソンとフランクリン・スタールによって行われたこの実験では、窒素の重同位体 ( ¹⁵ N)を含む培地で大腸菌を数世代にわたって培養しました。これにより、新しく合成された細菌 DNA のすべてが重同位体と組み合わされました。

^{通常の窒素（ 14} N）を含む培地で細菌を増殖させた後、さまざまな時点でサンプルを採取しました。これらのサンプルは密度勾配遠心分離にかけられ、密度に基づいて DNA 分子が分離されました。

結果は、¹⁴ N 培地で 1 世代複製した後、DNA は純粋な¹⁵ N DNA と純粋な¹⁴ N DNA の中間の密度のバンドを形成することを示しました。これは、ワトソンとクリックが提唱した半保存的 DNA 複製を裏付けるもので、親 DNA 分子の各鎖が新しい相補鎖の合成のテンプレートとして機能し、その結果、それぞれが親鎖 1 本と新しく合成された鎖 1 本からなる 2 つの娘 DNA 分子が生成されます。

メセルソン・スタールの実験は、遺伝学と分子生物学の理解の基礎となる、DNA の半保存的複製に関する説得力のある証拠を提供しました。

2020年代初頭、分子生物学は垂直的および水平的な技術開発の両方によって定義される黄金時代に入った。垂直的には、新しい技術により、原子レベルでの生物学的プロセスのリアルタイムモニタリングが可能になっている。^[24]今日の分子生物学者は、ますます手頃な価格でより深いレベルのシーケンスデータにアクセスできるようになり、新しい非モデル生物における新しい遺伝子操作方法の開発を促進している。同様に、合成分子生物学者は、さまざまな原核生物および真核生物の細胞株に外因性の代謝経路を導入することで、小分子および高分子の工業生産を推進するだろう。^[25]

水平的に見ると、シーケンシングデータはより手頃な価格になり、さまざまな科学分野で利用されるようになっています。これにより、発展途上国の産業の発展が促進され、個々の研究者のアクセス性が向上します。同様に、CRISPR-Cas9遺伝子編集実験は、個人が新しい生物に対して1万ドル以下で考案し、実行できるようになり、産業および医療用途の開発が促進されます。^[26]

以下のリストは分子生物学と他の関連分野との学際的な関係についての視点を説明したものである。^[27]

• 分子生物学は、分子の合成、修飾、メカニズム、相互作用に焦点を当て、生物学的現象の分子的基礎を研究する学問です。
• 生化学は、生物体内で起こる化学物質と生命活動を研究する学問です。生化学者は、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸などの生体分子の役割、機能、構造に重点を置いています。 ^[28]
• 遺伝学は、遺伝的差異が生物にどのような影響を与えるかを研究する学問です。遺伝学は、突然変異、個々の遺伝子、遺伝的相互作用が表現型の発現にどのように影響するかを予測しようとします^[29]

研究者は分子生物学特有の技術を実践しているが、遺伝学や生化学の手法と組み合わせるのが一般的である。分子生物学の多くは定量的であり、最近ではバイオインフォマティクスや計算生物学などのコンピュータサイエンスの技術を使用してかなりの量の研究が行われてきた。遺伝子の構造と機能を研究する分子遺伝学は、2000年代初頭以来、分子生物学の最も顕著なサブフィールドの1つとなっている。生物学の他の分野は、細胞生物学や発生生物学のように分子自体の相互作用を直接研究するか、集団遺伝学や系統発生学などの進化生物学の分野のように分子技術を使用して集団や種の歴史的属性を推測する間接的な方法で、分子生物学から情報を得ている。また、生物物理学では、生体分子を「基礎から」、つまり分子レベルで研究する長い伝統もある。^[30]

分子クローニングは、目的のDNA配列を単離し、プラスミドベクターに移すために使用されます。^[31]この組み換えDNA技術は、1960年代に初めて開発されました。^[32]この技術では、目的のタンパク質をコードするDNA配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および/または制限酵素を使用して、プラスミド（発現ベクター）にクローニングします。プラスミドベクターは通常、少なくとも3つの特徴を持っています。複製起点、マルチクローニングサイト（MCS）、および選択マーカー（通常は抗生物質耐性）です。さらに、MCSの上流には、クローン化された遺伝子の発現を制御する プロモーター領域と転写開始部位があります。

このプラスミドは細菌細胞にも動物細胞にも挿入できる。細菌細胞へのDNAの導入は、裸のDNAの取り込みによる形質転換、細胞間接触による接合、またはウイルスベクターによる形質導入によって行うことができる。動物細胞などの真核細胞に物理的または化学的手段でDNAを導入することをトランスフェクションという。リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソームトランスフェクションなど、いくつかの異なるトランスフェクション技術が利用可能である。プラスミドはゲノムに組み込まれて安定したトランスフェクションとなる場合もあれば、ゲノムから独立して一時的に発現する場合もある（一過性トランスフェクションと呼ばれる） 。 ^{[33] [34]}

目的のタンパク質をコードする DNA が細胞内に入り、タンパク質を発現できるようになります。誘導プロモーターや特定の細胞シグナル伝達因子など、さまざまなシステムを利用して、目的のタンパク質を高レベルで発現させることができます。その後、細菌または真核細胞から大量のタンパク質を抽出できます。タンパク質はさまざまな状況下で酵素活性をテストしたり、結晶化して三次構造を研究したり、製薬業界ではタンパク質に対する新薬の活性を研究したりできます。^[35]

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAをコピーするための非常に用途の広い技術です。簡単に言えば、PCRは特定のDNA配列を所定の方法でコピーまたは変更することを可能にします。この反応は非常に強力で、完璧な条件下では、1つのDNA分子を2時間以内に10億7千万分子に増幅することができます。PCRには、遺伝子発現の研究​​、病原性微生物の検出、遺伝子変異の検出、DNAへの変異の導入など、多くの用途があります。^[36] PCR技術は、DNA分子の末端に制限酵素部位を導入したり、DNAの特定の塩基を変異させたりするために使用できます。後者は、部位特異的変異誘発と呼ばれる方法です。PCRは、 cDNAライブラリに特定のDNA断片が見つかるかどうかを判断するためにも使用できます。PCRには、RNAの増幅のための逆転写PCR（RT-PCR）や、最近ではDNAまたはRNA分子の定量測定を可能にする定量PCRなど、多くのバリエーションがあります。^{[37] [38]}

ゲル電気泳動は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルを使用して分子をサイズで分離する技術です。^[39]この技術は分子生物学の主要なツールの1つです。基本原理は、ゲルに電流を流すことでDNA断片を分離できることです。DNA骨格には負に帯電したリン酸基が含まれているため、DNAはアガロースゲルを通って電流の正の端に向かって移動します。^{[39]タンパク質は、} SDS-PAGEゲルを使用してサイズに基づいて分離することも、 2Dゲル電気泳動と呼ばれるものを使用してサイズと電荷に基づいて分離することもできます。^[40]

ブラッドフォードアッセイは、クマシーブリリアントブルーG-250と呼ばれる染料のユニークな特性を利用して、タンパク質分子の迅速かつ正確な定量を可能にする分子生物学技術です。 ^[41]クマシーブルーは、タンパク質に結合すると、赤褐色から明るい青色に目に見える色の変化を起こします。^[41]不安定なカチオン状態のクマシーブルーは、背景波長が465 nmで、赤褐色を発します。^[42]クマシーブルーが酸性溶液中のタンパク質に結合すると、背景波長が595 nmに変化し、染料が明るい青色を発します。^[42]アッセイ中のタンパク質は約2分でクマシーブルーに結合し、タンパク質-染料複合体は約1時間安定しますが、吸光度の測定は反応開始から5〜20分以内に行うことが推奨されます。^[41]ブラッドフォードアッセイにおけるタンパク質濃度は可視光分光光度計を使用して測定できるため、大規模な設備は必要ありません。^[42]

この方法は1975年にマリオン・M・ブラッドフォードによって開発され、ローリー法やビウレット法といった従来の方法に比べて大幅に高速で正確なタンパク質定量を可能にした。^[41]従来の方法とは異なり、ブラッドフォード法はエタノール、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムなどの非タンパク質分子による干渉を受けにくい。^{[41]しかし、}ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの強アルカリ緩衝剤の影響を受けやすい。 ^[41]

ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、イースタンブロッティングという用語は、もともとはエドウィン・サザーンがブロッティングしたDNAのハイブリダイゼーションのために説明した技術にちなんでサザンブロッティングという用語をもじった分子生物学のジョークであったものに由来している。後にノーザンブロットとして知られるようになったRNAブロットの開発者であるパトリシア・トーマスは、実際にはこの用語を使用していなかった。^[43]

発明者である生物学者エドウィン・サザンにちなんで名付けられたサザンブロット法は、DNAサンプル内の特定のDNA配列の存在を調べる方法である。制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）消化前または消化後のDNAサンプルはゲル電気泳動によって分離され、その後毛細管現象によるブロットによって膜に転写される。次に、膜は、対象のDNA上の配列と相補的な塩基配列を持つ標識DNAプローブにさらされる。^{[44]サザンブロット法は、} PCRなどの他の技術がDNAサンプルから特定のDNA配列を検出できるため、実験科学ではあまり使用されていない。ただし、これらのブロット法は、トランスジェニックマウスのトランスジーンコピー数の測定や、遺伝子ノックアウト胚性幹細胞株のエンジニアリングなど、一部の用途ではまだ使用されている。^[30]

ノーザンブロットは、一連の異なるRNAサンプル間の相対比較として、特定のRNA分子の存在を調べるために使用されます。これは本質的に、変性RNAゲル電気泳動とブロットを組み合わせたものです。このプロセスでは、RNAはサイズに基づいて分離され、次に膜に転写され、次に目的の配列のラベルされた相補体でプローブされます。結果は、使用されるラベルに応じてさまざまな方法で視覚化できますが、ほとんどの場合、サンプルで検出されたRNAのサイズを表すバンドが現れます。これらのバンドの強度は、分析されたサンプル内のターゲットRNAの量に関連しています。この手順は、転写後調節が行われず、mRNAのレベルが生成される対応するタンパク質の比例レベルを反映していると仮定して、さまざまなサンプルに存在するRNAの量を測定することにより、遺伝子発現がいつ、どの程度起こっているかを調べるためによく使用されます。これは、特定の遺伝子が生体組織でいつ、どのような条件下で発現するかを決定するための最も基本的なツールの1つです。^{[45] [46]}

ウエスタンブロットは、タンパク質の混合物から特定のタンパク質を検出する技術である。^[47]ウエスタンブロットは、単離されたタンパク質のサイズを決定し、その発現を定量化するために使用することができる。^{[48]ウエスタン}ブロット法では、タンパク質は最初にSDS-PAGEと呼ばれる技術で2枚のガラス板の間に挟まれた薄いゲル内でサイズによって分離される。次に、ゲル内のタンパク質はポリフッ化ビニリデン（PVDF）、ニトロセルロース、ナイロン、またはその他の支持膜に転写される。次に、この膜を抗体溶液でプローブすることができる。目的のタンパク質に特異的に結合する抗体は、着色製品、化学発光、またはオートラジオグラフィーを含むさまざまな技術によって視覚化することができる。多くの場合、抗体は酵素で標識されている。化学発光 基質を酵素にさらすと、検出が可能になる。ウエスタンブロット法を使用すると、検出だけでなく定量分析も可能になる。ウエスタンブロット法に類似した方法を使用して、生細胞または組織切片内の特定のタンパク質を直接染色することができる。^{[47] [49]}

イースタンブロッティング法はタンパク質の翻訳後修飾を検出するために使用されます。PVDFまたはニトロセルロース膜にブロットされたタンパク質は、特定の基質を使用して修飾の有無を調べます。^[50]

DNA マイクロアレイは、顕微鏡スライドなどの固体支持体に付着したスポットの集まりで、各スポットには 1 つ以上の一本鎖 DNAオリゴヌクレオチド断片が含まれています。アレイにより、1 枚のスライドに非常に小さな (直径 100 マイクロメートル) スポットを大量に配置することができます。各スポットには、単一のDNA 配列に相補的な DNA 断片分子があります。この技術のバリエーションにより、特定の発達段階にある生物の遺伝子発現を評価できます (発現プロファイリング)。この技術では、組織内の RNA が分離され、ラベル付けされた相補的 DNA (cDNA) に変換されます。次に、この cDNA をアレイ上の断片とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションを視覚化できます。断片の位置がまったく同じ複数のアレイを作成できるため、健康な組織と癌組織など、2 つの異なる組織の遺伝子発現を比較するのに特に便利です。また、どの遺伝子が発現しているか、その発現が時間やその他の要因によってどのように変化するかを測定することもできます。マイクロアレイの製造方法は多岐にわたります。最も一般的なものは、シリコンチップ、直径約100マイクロメートルのスポットを持つ顕微鏡スライド、カスタムアレイ、多孔質膜上のより大きなスポットを持つアレイ（マクロアレイ）です。特定のアレイには100個のスポットから10,000個以上のスポットがあります。アレイはDNA以外の分子で作ることもできます。^{[51] [52] [53] [54]}

対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）は、PCRやゲル電気泳動を必要とせずに一塩基変異を検出できる技術である。短い（長さ20～25ヌクレオチド）標識プローブを断片化されていない標的DNAにさらすと、プローブの長さが短いため、高い特異性でハイブリダイゼーションが発生し、一塩基の変化でもハイブリダイゼーションが妨げられる。次に、標的DNAを洗浄し、ハイブリダイズしていないプローブを除去する。次に、標的DNAを放射能または蛍光でプローブの存在について分析する。この実験では、ほとんどの分子生物学技術と同様に、実験を成功させるためにコントロールを使用する必要があります。^{[55] [56]}

分子生物学では、手順や技術が絶えず開発され、古い技術は放棄されている。例えば、DNAゲル電気泳動（アガロースまたはポリアクリルアミド）の出現以前は、DNA分子のサイズは、通常、ショ糖勾配での沈降速度によって決定されていたが、これは時間と労力を要する技術で、高価な機器が必要であった。ショ糖勾配以前は、粘度測定法が使用されていた。歴史的な興味とは別に、古い技術について知っておくことは価値があることが多い。なぜなら、新しい技術が適さない別の新しい問題を解決するのに役立つことがあるからだ。^[57]

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