ブラッドフォードタンパク質アッセイ

ブラッドフォードタンパク質アッセイ（クマシータンパク質アッセイとも呼ばれる）は、1976年にマリオン・M・ブラッドフォードによって開発されました。 ^[1]これは、溶液中のタンパク質の濃度を測定するために使用される、迅速かつ正確な^[2] 分光分析手順です。反応は、測定されたタンパク質のアミノ酸組成に依存します。

ブラッドフォード法は比色タンパク質分析法で、クマシーブリリアントブルーG-250染料の吸光度シフトに基づいています。クマシーブリリアントブルーG-250染料には、陰イオン性（青）、中性（緑）、陽イオン性（赤）の3つの形態があります。^[3]酸性条件下では、染料の赤色形態は青色形態に変換され、分析対象のタンパク質に結合します。結合するタンパク質がない場合、溶液は茶色のままです。染料は、ファンデルワールス力によってタンパク質のカルボキシル基と、静電相互作用によってアミノ基と強力な非共有結合複合体を形成します。^[1]この複合体の形成中に、クマシー染料の赤色形態は最初にタンパク質上のイオン化可能基に自由電子を供与し、これによりタンパク質の本来の状態が乱され、その結果疎水性ポケットが露出します。タンパク質の三次構造にあるこれらのポケットは、第一結合相互作用（ファンデルワールス力）を介して染料の非極性領域に非共有結合し、正のアミン基を染料の負電荷の近くに配置します。結合は、2つの間の第二結合相互作用であるイオン相互作用によってさらに強化されます。染料がタンパク質に結合すると、465 nmから595 nmにシフトするため、吸光度は595 nmで測定されます。^[4]

陽イオン（非結合）形態は緑/赤で、歴史的に465 nmで吸収スペクトルの最大値を持つと考えられています。疎水性およびイオン性相互作用によって結合した染料の陰イオン結合形態は、歴史的に595 nmで吸収スペクトルの最大値を持つと考えられています。^[5] 595 nmでの吸光度の増加は結合した染料の量に比例し、したがってサンプル中に存在するタンパク質の量（濃度）に比例します。^[6]

他のタンパク質アッセイとは異なり、ブラッドフォードタンパク質アッセイは、タンパク質サンプル中に存在する可能性のあるナトリウム、カリウム、さらにはスクロースのような炭水化物などのさまざまな化合物による干渉を受けにくい。^[2] 注目すべき例外は、界面活性剤の濃度が高い場合である。一般的な界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS) は、膜脂質二重層を破壊して細胞を溶解し、 SDS-PAGE用にタンパク質を変性させるために使用されるため、タンパク質抽出物中に存在する可能性がある。他の界面活性剤は高濃度でアッセイを妨害するが、SDS によって引き起こされる干渉には 2 つの異なるモードがあり、それぞれ異なる濃度で発生する。クマシー染料溶液中の SDS 濃度が臨界ミセル濃度(CMC として知られる、0.00333%W/V ～ 0.0667%) を下回ると、界面活性剤はタンパク質と強く結合する傾向があり、染料試薬のタンパク質結合部位を阻害する。これにより、溶液中のタンパク質濃度が過小評価される可能性がある。 SDS濃度がCMCを超えると、洗剤はクマシー染料の緑色の形態と強く結びつき、平衡が変化して青色の形態がより多く生成されます。これにより、タンパク質の存在に関係なく、595 nmでの吸光度が増加します。^[6]

その他の干渉は、タンパク質サンプルを調製する際に使用される緩衝液から発生する可能性があります。緩衝液の濃度が高いと、緩衝液の共役塩基によって溶液中の遊離プロトンが枯渇するため、タンパク質濃度が過大評価されます。タンパク質（続いて緩衝液）の濃度が低い場合は、この問題は発生しません。^[6]

無色化合物の吸光度を測定するには、ブラッドフォード法を行う必要があります。タンパク質などの一部の無色化合物は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなどの芳香族環が存在するため、280 nmの光学密度で定量化できますが、これらのアミノ酸が存在しない場合は、280 nmで吸光度を測定することはできません。^[7]

多くのタンパク質含有溶液は、分光光度計の紫外線領域である 280 nm で吸収が最も高くなります。このため、紫外線領域で測定できる分光光度計が必要ですが、多くの分光光度計では測定できません。さらに、280 nm で吸収が最大になるには、タンパク質にチロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン (W) などの芳香族アミノ酸が含まれている必要があります。すべてのタンパク質にこれらのアミノ酸が含まれているわけではないため、濃度測定がゆがんでしまいます。サンプルに核酸が含まれている場合、核酸も 280 nm で光を吸収するため、結果がさらにゆがんでしまいます。ブラッドフォード タンパク質アッセイを使用すれば、タンパク質サンプルをクマシー ブリリアント ブルー G-250 染料 (ブラッドフォード試薬) と混合し、可視領域である 595 nm で吸光度を測定するだけで、これらの複雑さをすべて回避できます^[8]。モバイル スマートフォン カメラを使用して正確に測定できます^{[9] 。}

ブラッドフォードタンパク質アッセイの手順は非常に簡単でシンプルです。ブラッドフォード試薬をサンプルとともに試験管に加える 1 ステップで行われます。よく混ぜると、混合物はほぼ即座に青色に変わります。約 2 分かかるプロセスを経て染料がタンパク質に結合すると、酸性溶液中の染料の吸収極大が 465 nm から 595 nm に変化します。^[2]さらに、タンパク質結合によりメタクロマティック反応が誘発され、595 nm 付近の光を吸収する種の出現によって証明されます。これは非プロトン化形態を示します^[10]この染料は、アミノ基およびカルボキシル基との静電相互作用、ならびにファンデルワールス相互作用を介して、タンパク質と強力な非共有結合を形成します。溶液中のタンパク質に結合する分子のみがこの吸収の変化を示すため、染料の結合していない分子が実験的に得られた吸収の読み取り値に寄与する可能性があるという懸念はありません。この方法は、他の方法よりも安価で、使いやすく、タンパク質に対する染料の感度が高いため、より有益である。^[11]

5分間培養した後、分光光度計または携帯電話のカメラ（RGBradford法）を使用して595 nmで吸光度を読み取ることができます。 ^[9]

このアッセイは、タンパク質に対して行われるアッセイの中で最も速いものの一つです。^[12]アッセイの準備と完了にかかる合計時間は30分未満です。^[13]実験全体は室温で行われます。

ブラッドフォードタンパク質アッセイは、1～20μgという少量のタンパク質を測定することができます。^[14]これは非常に感度の高い技術です。

染料試薬はリン酸で調製された、すぐに使用できる安定した製品です。分解が始まるまで、室温で最大 2 週間保存できます。

タンパク質サンプルには通常、塩、溶媒、緩衝剤、防腐剤、還元剤、金属キレート剤が含まれています。これらの分子はタンパク質を可溶化および安定化するために頻繁に使用されます。BCAやローリーなどの他のタンパク質アッセイは、還元剤などの分子がアッセイに干渉するため効果がありません。^[15]ブラッドフォード法を使用すると、これらの分子は互いに互換性があり干渉しないため、有利になる可能性があります。^[16]

アッセイから得られた直線グラフ（吸光度とタンパク質濃度（μg/mL））は、直線の傾きを使用して簡単に外挿し、タンパク質の濃度を決定することができます。

^{これは感度の高い技術です。また、非常に簡単で、5分間のインキュベーション後に595 nmでODを測定するだけです。この方法では、Vis分光光度計[17]}やモバイルスマートフォンカメラ（RGBradford法）も使用できます。 ^[9]

ブラッドフォード法は、通常 0 μg/mL から 2000 μg/mL までの短い範囲で直線性を示すため、分析前にサンプルを希釈する必要がある場合がよくあります。これらの希釈を行うと、1 回の希釈での誤差がその後の希釈で加算され、直線関係が常に正確であるとは限りません。

塩基性条件やSDSなどの洗剤は、染料が側鎖を介してタンパク質に結合する能力を妨げる可能性がある。^[12]

この方法の試薬は試験管を汚す傾向がある。同じ試験管を使うと、汚損が吸光度の測定に影響する。また、この方法は時間に敏感である。複数の溶液を試験する場合、正確な比較を行うために、すべてのサンプルを同じ時間インキュベートすることが重要です。^[18]

クマシーベースのタンパク質測定染料を使用する際の制限要因は、異なるタンパク質間で観察される色の収量に大きなばらつきがあることに起因します^[19]この制限要因は、膵臓抽出物のようなコラーゲンを豊富に含むタンパク質サンプルで顕著であり、ローリー法とブラッドフォード法の両方でタンパク質含有量が過小評価される傾向があります。

この問題は、分析混合物にシクロデキストリンを添加することで軽減できるが、界面活性剤の存在によっても阻害される。^[20]

非線形性の多くは、タンパク質の添加によって乱される2つの異なる染料形態間の平衡に起因します。ブラッドフォードアッセイは、595対450 nmの吸光度の比を測定することで線形化します。この改良ブラッドフォードアッセイは、従来のものよりも約10倍感度が優れています。^[21]

オリジナルのブラッドフォード法でタンパク質に結合するために使用されたクマシーブルー G250 染料は、タンパク質のアルギニンおよびリジン グループに容易に結合します。染料がこれらのアミノ酸に結合する傾向があるため、異なるタンパク質間でアッセイの応答が異なる可能性があるため、これは不利です。この変動を修正するために、NaOH を追加して pH を上げる、または染料を追加するなどのオリジナルの方法の変更が行われました。これらの変更によりアッセイの感度が低下しますが、変更された方法はサンプルに干渉する可能性のある洗剤に対して敏感になります。^[22]

改良されたブラッドフォードタンパク質アッセイの新しい改良が進行中で、特にコラーゲンタンパク質の検出精度の向上に重点が置かれています。注目すべき改良の 1 つは、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を少量 (約 0.0035%) 組み込むことです。この SDS の組み込みにより、3 つの主要なコラーゲンタンパク質 (コラーゲン I、III、IV 型) の色応答が 4 倍に増加し、同時に非コラーゲンタンパク質の吸光度が減少することが示されています。^[19]

試薬の調製におけるこの単純な変更により、Bradford アッセイはコラーゲンと非コラーゲンタンパク質の両方に対して同様の応答曲線を生成するようになり、高コラーゲンタンパク質を含むサンプルでの Bradford アッセイの使用が拡大しました。

• 凍結乾燥牛血漿ガンマグロブリン
• クマシーブリリアントブルー1
• 0.15M NaCl
• 分光光度計とキュベットまたはスマートフォンのカメラ（RGBradford法）。^[9]
• マイクロピペット

1. 0.15 M NaCl で最終濃度 0 (ブランク = タンパク質なし)、250、500、750、1500 μg/mL になるように希釈した一連の標準液を準備します。また、測定する未知のサンプルの連続希釈液も準備します。
2. 上記の各 100 μL を別の試験管 ( Spectronic 20 を使用している場合は分光光度計チューブ) に追加します。
3. 各チューブにクマシーブルー 5.0 mL を加え、ボルテックスまたは転倒混和で混ぜます。
4. タンパク質を含まないチューブ（ブランク）を使用して、分光光度計を波長 595 nm に調整します。
5. 5 分待ってから、各標準と各サンプルを 595 nm の波長で読み取ります。
6. 標準物質の吸光度と濃度をプロットします。吸光係数を計算し、未知のサンプルの濃度を計算します。

1. 1、5、7.5、10 μg/mL のタンパク質標準濃度を準備します。NaCl のみのブランクを準備します。一連のサンプル希釈液を準備します。
2. 上記の各 100 μL を別のチューブ (マイクロ遠心チューブを使用) に追加し、各チューブに 1.0 mL のクマシーブルーを追加します。
3. 分光光度計をオンにして波長595 nmに調整し、1.5 mLキュベットを使用して分光光度計をブランクにするか、モバイルスマートフォンカメラ（RGBradford法）を使用します。^[9]
4. 2 分待ってから、各標準物質とサンプルの 595 nm での吸光度を読み取ります。
5. 標準物質の吸光度と濃度をプロットします。吸光係数を計算し、未知のサンプルの濃度を計算します。

要約すると、標準曲線を見つけるには、BSA（ウシ血清アルブミン）^[2]のさまざまな濃度を使用して、濃度をx軸にプロットし、吸光度をy軸にプロットした標準曲線を作成する必要があります。正確な標準曲線を作成するには、狭い濃度のBSA（2〜10 ug / mL）のみが使用されます。^[23]広範囲のタンパク質濃度を使用すると、未知のタンパク質の濃度を決定するのが難しくなります。この標準曲線は、未知のタンパク質の濃度を決定するために使用されます。以下では、標準曲線から未知の濃度に到達する方法について詳しく説明します。

まず、最適な直線、つまり線形回帰を追加し、その方程式をグラフに表示します。理想的には、R ²値は可能な限り 1 に近くなります。R は、各データ ポイントから差し引かれた適合値の二乗の合計を表します。したがって、R ²が 1 よりはるかに小さい場合は、より信頼性の高いデータを得るために実験をやり直すことを検討してください。^[24]

チャートに表示された方程式は、吸光度、ひいては未知サンプルの濃度を計算する手段を示しています。グラフ 1 では、x は濃度、y は吸光度であるため、方程式を変形して x について解き、測定した未知サンプルの吸光度を入力する必要があります。^[25]未知のサンプルの吸光度は標準の範囲外になる可能性があります。これらは計算に含めるべきではありません。なぜなら、与えられた方程式は制限外の数値には適用できないからです。大規模では、ランベルト・ビールの法則A=εLC を使用して吸光係数を計算する必要があります。ここで、A は測定された吸光度、ε は標準曲線の傾き、L はキュベットの長さ、C は測定する濃度です。^[26]マイクロ スケールではキュベットが使用できない場合があるため、方程式を変形して x について解くだけで済みます。

データに合致する濃度を得るためには、未知物質の希釈度、濃度、単位を正規化する必要があります (表 1)。これを行うには、濃度をタンパク質の容量で割って濃度を正規化し、希釈量を掛けて、アッセイを実行する前にタンパク質に生じた希釈を補正する必要があります。

代替のタンパク質アッセイには以下のものがあります。

• 紫外可視分光法
• RGブラッドフォード
• ビウレットタンパク質アッセイ
• ローリータンパク質アッセイ
• BCAタンパク質アッセイ
• アミドブラックタンパク質アッセイ
• コロイド金タンパク質アッセイ

• Bradford, MM (1976)、「タンパク質-色素結合の原理を利用したマイクログラム量のタンパク質の迅速で高感度な定量法」、Anal. Biochem.、72 ( 1– 2): 248– 254、doi :10.1016/0003-2697(76)90527-3、PMID  942051、S2CID  4359292
• Zor, T.; Selinger, Z. (1996)、「Bradford タンパク質アッセイの線形化により感度が向上: 理論的および実験的研究」、Anal. Biochem.、236 (2): 302– 308、doi :10.1006/abio.1996.0171、PMID  8660509
• Noble, James E.; Bailey, Marc JA (2009)。「第 8 章 タンパク質の定量」。タンパク質精製ガイド、第 2 版。酵素学の方法。第 463 巻。pp.  73– 95。doi : 10.1016/S0076-6879(09) 63008-1。ISBN 9780123745361. PMID  19892168。
• アルブライト、ブライアン (2009)、Excel による数学モデリング、ジョーンズ & バートレット ラーニング、p. 60、ISBN 978-0763765668
• スティーブンソン、フランク・ハロルド（2003）、分子生物学とバイオテクノロジーのための計算：実験室での数学ガイド、アカデミックプレス、pp. 252、ISBN 978-0126657517
• デニソン、C. (2013)。タンパク質分離ガイド。シュプリンガーサイエンス＆ビジネスメディア。p. 39。ISBN 978-94-017-0269-0。
• イバニェス、ホルヘ G. (2007)、環境化学：基礎、p. 60、ISBN 978-0387260617

• ブラッドフォードアッセイ化学
• 可変光路長分光法
• オープンウェットウェア