DNAバーコーディング

バーコーディングは、対象試料の組織、複数の生物の混合物（バルクサンプル）、または環境サンプル（水や土壌など）に含まれるDNAから行うことができる。これらの異なる種類のサンプルでは、​​サンプリング、保存、分析の方法がそれぞれ異なる。

組織サンプル

対象標本から採取した組織サンプルにバーコードを付けるには、皮膚片、鱗片、脚、触角などの小さな断片で十分でしょう（標本の大きさによります）。汚染を防ぐため、サンプル採取ごとに使用した器具を滅菌する必要があります。1つの標本から2つのサンプルを採取することをお勧めします。1つは保存用、もう1つはバーコード処理用です。DNAの劣化を防ぐには、サンプルの保存が非常に重要です。

バルクサンプル

バルクサンプルとは、研究対象となる分類群に属する複数の生物を含む環境サンプルの一種です。ここでいうバルクサンプルと他の環境サンプルとの違いは、バルクサンプルは通常、良質なDNAを大量に提供する点にあります。バルクサンプルの例としては、キックネットで採取した水生大型無脊椎動物サンプルや、マレーズトラップで採取した昆虫サンプルなどが挙げられます。単細胞真核生物などの生物全体を含む、ろ過またはサイズ分画された水サンプルも、バルクサンプルとして定義されることがあります。このようなサンプルは、形態に基づく同定のための従来のサンプルを採取するのと同じ手法で採取できます。

eDNAサンプル

環境DNA（eDNA）法は、環境サンプル（水や土壌など）中に存在する細胞残骸や細胞外DNAから、バーコーディングやメタバーコーディングによって種を検出・同定する非侵襲的な手法です。この手法は、すべての生物が環境中にDNAを残し、この環境DNAは存在量が非常に少ない生物でも検出できるという事実に基づいています。したがって、フィールドサンプリングでは、対象生物のDNAが少量しか存在しない可能性がある場合、汚染を避けるために、各サンプリングサイトまたはサンプルでDNAフリーの材料とツールを使用することが最も重要です。一方、eDNAサンプルには常に全細胞、つまり生きた微生物のDNAが含まれており、これらはしばしば大量に存在します。そのため、自然環境で採取された微生物サンプルもeDNAサンプルと呼ばれますが、対象生物の量が多いため、この文脈では汚染の問題は少なくなります。eDNA法は、水、土壌、糞便、胃内容物、血液など、ほとんどのサンプルタイプで使用できます^{[ 14 ]。}

DNAバーコーディングには、サンプル中のDNAを抽出する必要がある。DNA抽出方法にはいくつかの種類があり、コスト、時間、サンプルタイプ、収量などの要因が最適な方法の選択に影響を与える。

生物またはeDNAサンプルからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用してDNAを増幅する場合、サンプルに含まれる阻害分子によって反応が悪影響を受ける可能性があります。^{[ 15 ]}これらの阻害物質を除去することは、その後の分析に高品質のDNAが利用できるようにするために重要です。

抽出したDNAの増幅は、DNAバーコーディングに必要なステップです。通常、DNAバーコードを取得するために、全DNA材料のごく一部（通常400～800塩基対）のみがシーケンスされ、増幅はプライマーペアを使用してその断片に限定されます。^{[ 16 ]} eDNA材料の増幅は、通常、より小さな断片サイズ（<200塩基対）に焦点を当てています。これは、eDNAが他のソースのDNA材料よりも断片化されやすいためです。しかし、アンプリコンサイズとeDNAの検出率の間には関係がないと主張する研究もあります。^{[ 17 ] [ 18 ]}

DNAバーコードマーカー領域が増幅されたら、次のステップはDNAシーケンス法を用いてマーカー領域の配列を決定することです。^{[ 19 ]}さまざまなシーケンスプラットフォームが利用可能であり、技術開発は急速に進んでいます。

DNAバーコーディングに使用されるマーカーはバーコードと呼ばれます。DNAバーコードに基づいて種を適切に特徴付けるには、情報量の多いDNA領域の選択が重要です。優れたDNAバーコードは、種内変異が少なく種間変異が大きい^{[ 12 ]}こと、および幅広い分類学的応用のためのユニバーサルPCRプライマーを開発するための保存された隣接部位を持つ必要があります。目標は、研究対象の生物群のほとんどまたはすべての種を検出および識別できるプライマーを設計することです（高い分類学的解像度）。バーコード配列の長さは、現在のサンプリングソース、 DNA抽出、増幅、およびシーケンス法で使用できるほど短くする必要があります。^{[ 20 ]}

ウイルスから植物、動物まで、すべての分類群に対して単一の遺伝子配列を使用できればより効率的である。しかし、そのような遺伝子領域はまだ発見されていないため、生物群ごと、あるいは研究課題に応じて異なるバーコードが使用されている。

動物の場合、最も広く使用されているバーコードはミトコンドリアのシトクロムcオキシダーゼI（COI）遺伝子座です。^{[ 21 ]} Cytb、12S、16Sなどの他のミトコンドリア遺伝子も使用されています。ミトコンドリア遺伝子は、イントロンがないこと、半数体遺伝様式であること、組換えが限られていることから、核遺伝子よりも好まれています。^{[ 21 ] [ 22 ]}さらに、各細胞にはさまざまなミトコンドリア（数千個まで）があり、それぞれに複数の環状DNA分子が含まれています。したがって、サンプル組織が限られている場合でも、ミトコンドリアは豊富なDNA源を提供できます。

しかし、植物では、ミトコンドリア遺伝子は変異率が低いため、DNAバーコーディングには適していません。^{[ 23 ]}葉緑体ゲノムにはいくつかの候補遺伝子が見つかっており、最も有望なのは、単独または他の遺伝子と組み合わせたマチュラーゼK遺伝子（matK ）です。リボソーム内部転写スペーサー（ITS DNA）などのマルチローカスマーカーとmatK、rbcL、trnHなどの遺伝子も種の識別に使用されています。2つ以上の葉緑体「バーコーディング」遺伝子座を使用した場合、植物種間の最良の識別が達成されています。^{[ 24 ]}

細菌の場合、リボソームRNAの小サブユニット（16S）遺伝子は高度に保存されているため、さまざまな分類群に使用できます。^{[ 25 ]}いくつかの研究では、 COI ^{[ 26 ]}、II型シャペロニン（cpn60）^{[ 27 ]} 、またはRNAポリメラーゼのβサブユニット（rpoB）^{[ 28 ]}も細菌DNAバーコードとして機能する可能性があることが示唆されています。

真菌のバーコーディングはより困難であり、複数のプライマーの組み合わせが必要になる場合がある。^{[ 29 ]} COIマーカーは特定の真菌群では良好な性能を示すが、^{[ 30 ]}他の真菌群では同等の性能を示さない。^{[ 31 ]}そのため、 ITS rDNAや核リボソームRNAの大型サブユニット（28S LSU rRNA）などの追加マーカーが使用されている。 ^{[ 32 ]}

原生生物群においては、 28S rDNAのD1–D2領域またはD2–D3領域、 18S rRNA遺伝子のV4サブ領域、 ITS rDNA、COIなど、様々なバーコードが提案されている。さらに、光合成を行う原生生物には、リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ-オキシゲナーゼ遺伝子（rbcL）の大型サブユニットや葉緑体23S rRNA遺伝子など、特定のバーコードが使用できる。

2007年に開始されたBarcode of Life Data System (BOLD) ^{[ 36 ]}は、2022年時点で約78万のBIN（バーコードインデックス番号）を含む、最大規模のデータベースの1つです。これは、バーコード研究のための標本と配列レコードの自由にアクセス可能なリポジトリであり、バーコードデータの管理、品質保証、分析を支援するワークベンチでもあります。このデータベースには主に、COI遺伝子マーカーに基づく動物のBINレコードが含まれています。植物の識別には、BOLDはmatKとrbcLの配列を受け入れます。

UNITEデータベース^{[ 37 ]}は2003年に開設され、核リボソーム内部転写スペーサー（ITS）遺伝子マーカー領域を用いた真菌（2018年以降はすべての真核生物）種の分子同定のための参照データベースです。このデータベースは種の仮説という概念に基づいており、 作業したい割合を選択すると、専門家によって同定された標本から得られた配列と比較して配列がソートされます。

Diat.barcode は珪藻のデータベースです。^{[ 38 ]}これは、フランス国立農業研究所 (INRA) の水生生物学ステーションにあるトノン培養コレクション (TCC) と NCBI (国立生物工学情報センター) のヌクレオチドデータベースの 2 つのソースからのデータを基に、2016 年に R-syst::diatom ^{[ 39 ]}という名前で最初に公開されました。Diat.barcode は、 rbcL (リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ、葉緑体) と 18S (18S リボソーム RNA、核)の 2 つの遺伝子マーカーのデータを提供します。 このデータベースには、形態的特徴 (生物量、サイズ寸法など)、生活型 (移動性、コロニータイプなど)、生態学的特徴 (汚染感受性など) など、種に関する追加の特性情報も含まれています。

OTUの種への分類学的割り当ては、配列を参照ライブラリと照合することによって行われます。Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) は、サンプルからの配列リードを参照データベースの配列と比較することにより、配列間の類似領域を特定するためによく使用されます。^{[ 49 ]}

データベースが目的の配列と完全に一致する結果を返した場合、種レベルまで特定できる。非常に類似した配列であっても、各分類群の慣例によっては同一種として扱われる場合がある。

十分に類似した一致が見つからない場合は、返された一致を分類学的「アンカー」とみなすことで、科や綱などのより上位の分類レベルへの同定が可能になる場合があります。配列は特定の操作的分類単位（OTU）に割り当てられ、他の分類学的方法と組み合わせることで、新しい分類群を記述し、データベースに新しいエントリとして追加することができます。サンプル配列と一致する配列の系統樹を作成することで、一致を文脈化できることがよくあります。^{[ 50 ]}

細菌などの一部の生物群では、未記載の種や未知の種が多数存在するため、種レベルでの分類学的割り当てが不可能な場合が多い。ダークタクサも参照のこと。

BLASTは類似配列を見つけるための単純な方法です。処理速度が遅く、偽陽性率が高く、最良のヒットが必ずしも系統発生上の近隣種であるとは限りません。改良された方法としては、マーカー遺伝子のデータベースでトレーニングされたナイーブベイズ分類器やランダムフォレスト分類器などがあります。原核生物16S、節足動物CO1、真菌LSUなど、多くの種類のバーコードに対して事前トレーニングされた分類器が利用可能です。 ^{[ 51 ]}

ゲノムの標準化された領域からの特定の短いDNA配列またはマーカーは、種を識別するためのDNAバーコードを提供することができます。^{[ 55 ]}分子生物学的手法は、従来の方法が適用できない場合に特に有用です。DNAバーコーディングは、一般的に診断特性がほとんどない幼虫の識別や、多くの動物の異なる生活段階（幼虫と成虫など）の関連付けに非常に有効です。^{[ 56 ]}バーコーディング技術を使用して絶滅のおそれのある野生動植物の種の国際取引に関する条約（CITES）の附属書に記載されている種を識別することは、違法取引の監視に使用されます。^{[ 57 ]}

外来種はバーコーディングによって検出できます。^{[ 58 ] [ 59 ]}バーコーディングは、例えば国境管理における種の検出に適しています。国境管理では、異なる種間の類似性、十分な診断特性の欠如^{[ 58 ]} 、および/または分類学的専門知識の欠如により、迅速かつ正確な形態学的識別がしばしば不可能です。バーコーディングとメタバーコーディングは、生態系を侵入種についてスクリーニングし、侵入種と形態的に類似した在来種を区別するためにも使用できます。 ^{[ 60 ]} DNA識別の効率の高さは、従来の生物侵入の監視と比較して示されています。^{[ 61 ]}

DNA バーコーディングにより、隠蔽種の識別と認識が可能になる。^{[ 62 ]}しかし、DNA バーコーディング分析の結果は分析方法の選択に依存するため、DNA バーコードを使用して隠蔽種を区別するプロセスは、他の分類法と同様に主観的になる可能性がある。Hebert ら (2004) は、コスタリカ北西部の蝶Astraptes fulgerator は実際には 10 つの異なる種で構成されていると結論付けた。 ^{[ 63 ]}しかし、これらの結果は後に Brower (2006) によって異議を唱えられ、分析の多くの重大な欠陥が指摘され、元のデータは 10 種の隠蔽種ではなく、3 ～ 7 の隠蔽分類群の可能性しか支持できないと結論付けられた。^{[ 64 ]} Smith ら(2007) は、コスタリカ北西部のグアナカステ保護区 (ACG) でイモムシ (鱗翅目) から飼育された Belvosia 属寄生バエ (双翅目: ヤドリバエ科) の 20 形態種の種同定に、シトクロム c オキシダーゼ I DNA バーコードを使用した。これらの著者は、バーコーディングによって種の数が 32 に増加することを発見した。これは、これまで汎食性と考えられていた 3 種の寄生バエが、実際には宿主特異性の高い隠蔽種の集合体であることが明らかになったためである。 [ 65 ] DNAバーコーディングによって研究され^{た南極深海}底生生物の多毛類 15 形態種については、50% のケースで隠蔽種の多様性が発見された。さらに、これまで見過ごされていた 10 形態種が検出され、サンプル全体の種の豊富さが 233% 増加した。 ^{[ 66 ]}同様に、ソコトラ島の爬虫類のDNAバーコーディング研究では、いくつかの分類群で予想外に高い種内分岐が明らかになり、種の豊富さが13.8～54.4%過小評価されている可能性があると推定された。^{[ 67 ]}

DNAバーコーディングとメタバーコーディングは食性分析研究で有用であり、^{[ 68 ]}形態学的特徴に基づいて捕食対象を識別できない場合によく使用されます。^{[ 69 ] [ 70 ]食性分析にはさまざまなサンプリング方法があります。DNAメタバーコーディングは、胃の内容物、 [ 71 ]}糞便、^{[ 70 ] [ 72 ]}唾液^{[ 73 ]}または全身分析に対して実施できます。 ^{[ 52 ] [ 74 ]}糞便サンプルや高度に消化された胃の内容物では、単一種の組織を区別することが不可能な場合が多く、そのためメタバーコーディングが代わりに適用されます。^{[ 70 ] [ 75 ]}糞便や唾液は非侵襲的なサンプリング方法を表していますが、全身分析では、多くの場合、まず個体を殺す必要があります。小型生物の場合、胃の内容物のシーケンスは、多くの場合、動物全体をシーケンスすることによって行われます。

DNAバーコーディングは、食品の品質を評価するための重要なツールです。その目的は、食品のトレーサビリティを保証し、食品の盗用を最小限に抑え、地域特有の農産物生産を評価することです。また、公衆衛生を守ることも目的の一つです。例えば、メタバーコーディングによって、食事の残りからシガテラ中毒を引き起こすハタを特定したり^{[ 76 ]}、毒キノコと食用キノコを区別したりすることが可能になります（参考文献）。

DNAバーコーディングは、保全活動のための絶滅危惧種の存在を評価するために使用でき（参考文献）、あるいは、例えば過剰な栄養分や低酸素レベルといった特定の生態学的条件を反映する指標種の存在を評価するためにも使用できる（参考文献）。

DNAバーコーディングは、法医学事件における種の特定によく使用されます。犯罪現場で未知の動物や植物のサンプルが発見、収集、特定され、容疑者と結び付けて有罪判決を得ることが期待されます。^{[ 77 ]}密猟、絶滅危惧種の殺害、動物虐待は、動物のDNAがしばしば発見されるため、DNAバーコーディングが使用される犯罪の例です。^{[ 54 ] [ 78 ]}一方、植物のDNAは通常、容疑者を犯罪現場に結びつける微量証拠として使用されます。 ^{[ 79 ]}

従来の生物評価方法は国際的に確立されており、例えばEU指令WFDおよびMSFDにおける水生生物評価のように、生物モニタリングに役立っています。しかし、DNAバーコーディングは、以下の理由から従来の方法を改善できる可能性があります。DNAバーコーディングは、(i)分類学的解像度を高め、識別が困難または専門家が不足している分類群の識別を調和させることができます、(ii)環境要因を特定の分類群により正確かつ精密に関連付けることができます、(iii)地域間の比較可能性を高めることができます、(iv)初期生活段階や断片化した標本を含めることができます、(v)隠蔽種/希少種の境界を定めることができます、(vi)ストレス要因に敏感または耐性がある可能性のある希少種/隠蔽種などの新しい指標を開発することができます、(vii)処理できるサンプル数を増やし、処理時間を短縮することで、種の生態に関する知識を増やすことができます、(viii) eDNA法を使用する場合、非侵襲的なモニタリング方法です。^{[ 80 ]}

DNAバーコーディングには利点があるにもかかわらず、DNAバーコーディングは従来の形態学的方法の補完として使用するのが最も良いという意見もある。^{[ 80 ]}この推奨事項は、複数の課題が認識されていることに基づいている。

メガバーコーディングは、昆虫のDNAバーコード参照データの不足を補い、種の発見を加速させ、[ ^{113 ] [ 114 ]種}の多様性のパターンを理解し、^{[ 115 ] [ 116 ] [ 117 ]}種の豊富さを評価し、^{[ 118 ]}生物多様性の種の目録を迅速に作成し、^{[ 119 ]}ベースラインの変化を追跡し、^{[ 120 ]}生活史段階を一致させるのに役立ちます。^{[ 121 ]}

メタバーコーディング手順は、一般的なバーコーディングと同様に、 DNA抽出、PCR増幅、シーケンス、データ解析のステップを網羅しています。バーコードは、分類学的割り当てに役立つ短い可変遺伝子領域（たとえば、さまざまなマーカー/バーコードを参照）と、プライマー設計に使用できる高度に保存された遺伝子領域で構成されています。^{[ 122 ]}単一の種をバーコード化するか、複数の種をメタバーコード化するかによって、使用される遺伝子が異なります。後者の場合、より普遍的な遺伝子が使用されます。メタバーコーディングでは、単一の種のDNA/RNAを起点として使用するのではなく、1つの環境サンプルまたはバルクサンプルから得られた複数の異なる生物のDNA/RNAを使用します。

メタバーコーディングは生物多様性の測定を補完し、場合によってはそれらに取って代わる可能性を秘めている。特に、技術が進歩し、手順が徐々に安価で最適化され、普及するにつれてその可能性は高まる。^{[ 123 ] [ 124 ]}

DNAメタバーコーディングの応用例としては、陸上および水生環境における生物多様性のモニタリング、古生物学および古代生態系、植物と送粉者の相互作用、食性分析、食品安全などが挙げられる。

上記で概説したバーコーディングの一般的な利点と欠点は、メタバーコーディングにも当てはまります。メタバーコーディング研究の特に大きな欠点は、eDNAメタバーコーディングに適用する最適な実験設計とバイオインフォマティクス基準に関してまだコンセンサスが得られていないことです。^{[ 125 ]}しかし、EU COSTネットワークDNAqua-Netなど、バイオモニタリングのベストプラクティス基準を確立するために経験と知識を交換することで前進しようとする共同の試みが現在行われています。^{[ 80 ]}