DNA抽出

デオキシリボ核酸（DNA）の最初の単離は、1869年にフリードリヒ・ミーシャーによって行われました。^[1] DNA抽出は、サンプル（通常は血液、唾液、組織など）から分離された生物の細胞からDNAを単離するプロセスです。細胞を破壊し、タンパク質やその他の汚染物質を除去し、DNAを精製して他の細胞成分を排除します。精製されたDNAは、PCR、^[2] シーケンシング、クローニングなどの下流のアプリケーションに使用できます。現在、分子生物学や法医学分析では日常的な手順となっています。

このプロセスは、サンプルの種類と下流のアプリケーションに応じていくつかの方法で実行できます。^[3]最も一般的な方法は、機械的、化学的、酵素的溶解、沈殿、精製、および濃縮です。フェノールクロロホルム抽出、アルコール沈殿、またはシリカベースの精製など、DNAを抽出するために使用される特定の方法。^[4]

化学的方法では、抽出にさまざまなキットが使用され、適切なキットを選択することで、キットの最適化と抽出手順にかかる時間を節約できます。PCR感度検出は、市販のキット間のばらつきを示すと考えられています。^[5]

DNA を抽出する方法は多種多様ですが、一般的な手順は次のとおりです。

1. 溶解: このステップでは、細胞を破壊して DNA を放出します。たとえば、細菌細胞の場合、洗剤と塩の溶液 ( SDSなど) を使用して細胞膜を破壊し、DNA を放出することができます。植物細胞や動物細胞の場合、機械的方法または酵素的方法がよく使用されます。
2. 沈殿: DNA が放出されたら、タンパク質やその他の汚染物質を除去する必要があります。これは通常、アルコール (エタノールやイソプロパノールなど) や塩 (酢酸アンモニウムなど) などの沈殿剤を追加することで行われます。DNA は溶液の底に沈殿しますが、汚染物質は液体中に残ります。
3. 精製: DNA が沈殿した後、通常はカラムベースの方法を使用してさらに精製されます。たとえば、シリカベースのスピンカラムを使用して DNA を結合し、汚染物質を洗い流すことができます。または、遠心分離ステップを使用して DNA をチューブの底まで回転させて精製することもできます。
4. 濃縮: 最後に、残っている液体を除去することで DNA の量を増やすのが一般的です。これは通常、真空遠心分離または凍結乾燥 (フリーズドライ) の手順で行われます。

これらの手順は、DNA抽出プロトコルに応じていくつかのバリエーションが使用される場合があります。さらに、特定の種類のサンプルに特化した試薬とプロトコルを含むキットが市販されています。^[6]

DNA 抽出は、環境ウイルスや細菌を特定し、病気や遺伝性疾患を診断するために使用される多くの診断手順の予備ステップとしてよく使用されます。これらの方法には、以下のものがありますが、これらに限定されません。

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）技術は1980年代に開発されました。基本的な考え方は、顕微鏡スライドに付着した間期細胞または中期染色体の核DNAを核酸プローブでハイブリダイズすることです。これは、特に特定の細菌群を認識して数えるために使用される分子的方法です。^[1]

海洋細菌プランクトン群集の地理的および時間的パターンを認識、定義、定量化するために、研究者は末端制限断片長多型 (T-RFLP) と呼ばれる手法を採用しています。

配列決定: ゲノム全体または一部とその他の染色体構成要素。以前に公開された配列との比較のために終了しました。

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• 研究対象となる細胞を収集する必要があります。
• 細胞膜を破壊すると、細胞質とともに DNA が露出します (細胞溶解)。
  • 細胞膜と核の脂質は 洗剤と界面活性剤によって分解されます。
  • プロテアーゼを加えてタンパク質を分解します（オプション）。
  • RNaseを追加してRNA を分解します(オプション)。
• 溶液を濃縮塩溶液（生理食塩水）で処理し、壊れたタンパク質、脂質、RNAなどの破片を凝集させます。
• 溶液を遠心分離し、凝集した細胞残骸を DNA から分離します。
• 細胞溶解ステップでは、洗剤、タンパク質、塩、試薬からの DNA 精製が使用されます。最も一般的に使用される手順は次のとおりです。
  • エタノール沈殿は通常、氷冷したエタノールまたはイソプロパノールで行います。DNA はこれらのアルコールに不溶性であるため、凝集し、遠心分離するとペレットになります。DNA の沈殿は、通常酢酸ナトリウムを添加してイオン強度を高めることで改善されます。
  • フェノールクロロホルム抽出では、フェノールがサンプル中のタンパク質を 変性させます。サンプルを遠心分離した後、変性したタンパク質は有機相に残り、核酸を含む水相はクロロホルムと混合され、溶液からフェノール残留物が除去されます。
  • ミニカラム精製は、緩衝液のpHと塩濃度に応じて核酸が固相（シリカまたはその他）に結合（吸着）する可能性があるという事実に依存しています。

DNA に結合した細胞タンパク質およびヒストンタンパク質は、プロテアーゼを添加するか、タンパク質を酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムで沈殿させるか、 DNA 沈殿の前にフェノール-クロロホルム混合物で抽出することによって除去できます。

分離後、DNA は弱アルカリ性の緩衝液（通常はTE 緩衝液）または超純水に溶解されます。

DNA 抽出に使用される最も一般的な化学物質は次のとおりです。

1. SDS や Tween-20 などの洗剤は、細胞を破壊して DNA を放出するために使用されます。
2. プロテアーゼ K などのプロテアーゼ酵素は、DNA に結合する可能性のあるタンパク質を消化するために使用されます。
3. フェノールとクロロホルムは、DNA を他の細胞成分から分離するために使用されます。
4. DNA を沈殿させるために使用されるエタノールまたはイソプロパノール。
5. DNA を溶解し、その安定性を維持するためによく使用される NaCl などの塩。
6. EDTA は、DNA に損傷を与える可能性のある金属イオンをキレート化するために使用されます。
7. DNA 抽出に最適な条件で pH を維持するために使用される Tris-HCL。

最も一般的なDNA抽出法には、有機抽出、Chelex抽出、固相抽出などがあります。^[8]これらの方法では一貫して単離されたDNAが得られますが、得られるDNAの品質と量は異なります。DNA抽出法を選択する際には、コスト、時間、安全性、汚染のリスクなど、考慮すべき要素が複数あります。

有機抽出には、複数の異なる化学溶液での培養の追加が含まれます。^[8]溶解ステップ、フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿、および洗浄ステップが含まれます。有機抽出は、安価で大量の純粋なDNAが得られることから、研究室でよく使用されます。簡単ですが、多くのステップが含まれており、他の方法よりも時間がかかります。また、有毒化学物質であるフェノールとクロロホルムが好ましく使用され、複数のチューブ間でDNAを移動することによる汚染のリスクが高まります。^[9] DNAの有機抽出に基づくいくつかのプロトコルは数十年前に効果的に開発されましたが、^[10]これらのプロトコルの改良されたより実用的なバージョンもここ数年で開発され、公開されています。^[11]

Chelex抽出法では、サンプルにChelex樹脂を加え、溶液を沸騰させ、ボルテックスと遠心分離を行う。細胞物質はChelexビーズに結合し、DNAは上清に存在する。^{[9] Chelex法は有機抽出法よりもはるかに高速で簡単であり、必要なチューブは1本だけなので、DNA汚染のリスクが低減する。残念ながら、Chelex抽出ではそれほど多くの量が得られず、得られるDNAは一本鎖であるため、} PCRベースの分析にしか使用できず、 RFLPには使用できない。^[9]

スピンカラムベースの抽出法などの固相抽出では、DNAがシリカに結合するという事実を利用しています。DNAを含むサンプルをシリカゲルまたはシリカビーズとカオトロピック塩を含むカラムに加えます。カオトロピック塩は鎖間の水素結合を破壊し、核酸を疎水性にすることでDNAとシリカの結合を促進します。これによりリン酸残基が露出し、吸着できるようになります。^[12] DNAはシリカに結合し、残りの溶液はエタノールを使用して洗い流され、カオトロピック塩やその他の不要な成分が除去されます。^[8]次に、DNAを低塩水溶液で再水和してビーズからDNAを 溶出させることができます。

この方法では、 PCRとRFLP分析の両方に使用できる、高品質で主に二本鎖のDNAが得られます。この手順は自動化でき^{[9] 、}フェノールクロロホルム法よりは低いものの、スループットは高くなります。これはワンステップ法であり、手順全体が1本のチューブで完了します。これにより汚染のリスクが低くなり、DNAの法医学的抽出に非常に役立ちます。複数の固相抽出市販キットがさまざまな会社によって製造および販売されていますが、唯一の問題は、有機抽出やChelex抽出よりも高価なことです。

一部のサンプルから DNA を分離するには、特定の技術を選択する必要があります。DNA の分離が複雑な典型的なサンプルは次のとおりです。

• 部分的に分解されたDNAを含む考古学的サンプルについては、古代DNAを参照^[13]
• その後の分析手順の阻害物質、特にPCR阻害物質（土壌由来のフミン酸、藍やその他の布地染料、血液中のヘモグロビンなど）を含むサンプル
• 厚い細胞壁を持つ微生物のサンプル、例えば酵母
• 複数のソースからの混合DNAを含むサンプル

染色体外 DNA は一般に分離が容易で、特にプラスミドは細胞溶解とそれに続くタンパク質沈殿によって容易に分離できます。これにより染色体 DNA が不溶性画分に捕捉され、遠心分離後に可溶性画分からプラスミド DNA を精製できます。

ハート DNA 抽出は、哺乳類細胞内のすべての染色体外 DNAを分離するものです。ハート抽出プロセスでは、高分子量の核 DNAが除去され、細胞内に存在する 低分子量のミトコンドリア DNAとウイルスエピソームのみが残ります。

ジフェニルアミン(DPA) 指示薬でDNA の存在を確認します。この手順では DNA の化学的加水分解が行われます。酸で加熱 (例: ≥95 °C) すると、反応にはデオキシリボース糖が必要になるため、DNA に特異的です。これらの条件下では、2-デオキシリボースは w-ヒドロキシレブリニルアルデヒドに変換され、これが化合物ジフェニルアミンと反応して青色の化合物を生成します。DNA 濃度は、分光光度計で 600 nm での溶液の吸光度を測定し、既知の DNA 濃度の標準曲線と比較することで判定できます。

DNA 純度の尺度として、波長260 nm と 280 nmでの DNA 溶液の吸光度の強度を測定する方法が使用されます。DNA を制限酵素で切断し、アガロースゲルで流し、エチジウムブロマイド (EtBr)または別の染色剤で染色し、DNA の強度を既知濃度の DNA マーカーと比較することで、DNA を定量化できます。

サザンブロット法を使用すると、この定量化された DNA を分離し、 PCRおよびRFLP分析を使用してさらに調査することができます。これらの手順により、ゲノム内の反復配列を区別することができます。法医学者はこれらの技術を使用して比較、識別、分析を行います。

この方法では、植物の核は物理的に組織を粉砕し、無傷の核を独自の核分離緩衝液（NIB）で再構成することによって分離されます。プラスチドDNAは細胞小器官から放出され、洗浄と遠心分離によって浸透圧緩衝液で除去されます。精製された核は溶解され、有機抽出によってさらに洗浄され、ゲノムDNAは高濃度CTABで沈殿されます。高純度で高分子量のgDNAが核から抽出され、高pH緩衝液に溶解され、安定した長期保存が可能になります。^[14]

DNAの保存は、下流のアプリケーションのために抽出されたDNAの完全性と安定性を保証するため、DNA抽出プロジェクトにとって重要な側面です。^[15]

DNA 保存の一般的な方法の 1 つはエタノール沈殿です。これは、抽出した DNA にエタノールと塩化ナトリウムや酢酸カリウムなどの塩を加えて、溶液から沈殿させる方法です。次に、DNA を遠心分離でペレット化し、70% エタノールで洗浄して、残っている汚染物質を除去します。次に、DNA ペレットを空気乾燥し、Tris-EDTA (TE) バッファーなどのバッファーに再懸濁して保存します。

もう 1 つの方法は、TE バッファーなどのバッファー、またはグリセロールや DMSO などの凍結防止剤で、-20 度または -80 度で DNA を凍結することです。この方法は DNA の完全性を維持し、DNA を分解する可能性のある酵素の活動を遅くします。

保存バッファーと保存条件の選択は、DNA の用途に応じて異なります。たとえば、DNA を PCR に使用する場合は、TE バッファーで 4 ℃ で保存し、長期保存や輸送に使用する場合は、エタノールで -20 ℃ で保存します。抽出した DNA は、ゲル電気泳動や分光光度計で定期的に品質と完全性をチェックする必要があります。温度や湿度などの保存条件も記録して管理する必要があります。

また、DNA の長期的な安定性と、時間の経過による劣化の可能性を考慮することも重要です。抽出した DNA はできるだけ短期間保存し、劣化のリスクを最小限に抑えるように保存条件を選択する必要があります。

一般的に、抽出された DNA は、下流のアプリケーションでの安定性と完全性を確保するために、可能な限り最良の条件で保存する必要があります。

抽出されたDNAの品質を保証するために使用される品質管理技術はいくつかあり、その中には次のようなものがある。^[16]

• 分光光度法：これはDNAサンプルの濃度と純度を測定するために広く使用されている方法です。分光光度法は、通常260 nmと280 nmの異なる波長でのサンプルの吸光度を測定します。260 nmと280 nmでの吸光度の比は、DNAサンプルの純度を決定するために使用されます。^[17]
• ゲル電気泳動：この技術は、DNAサンプルのサイズと完全性を視覚化し比較するために使用されます。DNAをアガロースゲルに載せ、電界をかけると、DNAがゲル内を移動します。DNAの移動は、DNAに挿入され、紫外線下で蛍光を発するエチジウムブロマイドを使用して視覚化できます。^[18]
• 蛍光測定法: 蛍光測定法は、特定の波長の光で励起されたサンプルの蛍光を測定することで核酸の濃度を測定する方法です。蛍光測定法では、核酸に特異的に結合し、高い蛍光強度を持つ染料を使用します。
• PCR: ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、DNA の特定の領域を増幅する技術です。また、DNA の小さな断片を増幅する QC 方法としても使用されます。増幅が成功すれば、抽出された DNA は高品質であり、劣化していないことを意味します。
• Qubit蛍光計： Qubit蛍光計は蛍光染料を使用してサンプル中のDNAとRNAの濃度を測定する装置です。これはDNAサンプルの濃度を決定するために使用できる迅速かつ高感度な方法です。^[16]
• バイオアナライザー: バイオアナライザーは、電気泳動を使用して DNA、RNA、タンパク質のサンプルを分離および分析する機器です。DNA サンプルのサイズ、完全性、純度に関する詳細な情報を提供できます。

• ブーム方式
• DNA指紋
• DNA配列解析
• DNA構造
• エタノール沈殿
• プラスミド調製
• ポリメラーゼ連鎖反応
• SCODA DNA精製

• Li, Richard (2015).法医学生物学. ボカラトン: CRC Press, Taylor & Francis Group. ISBN 9781439889701 . 
• Sambrook, Michael R.; Green, Joseph (2012).分子クローニング(第 4 版). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. ISBN 1936113422 . OCLC  774021237. 

• 生物からDNAを抽出する方法
• DNA抽出バーチャルラボ