微生物DNAバーコーディング

微生物DNAバーコーディングは、DNAメタバーコーディングを使用して微生物の混合物の特徴を明らかにすることです。DNAメタバーコーディングは、普遍的な遺伝子マーカーを使用して生物の混合物のDNAを識別するDNAバーコーディングの方法です。^[1]

微生物群集を評価するためにメタバーコーディングを 使用する方法は長い歴史があります。1972年に、Carl Woese、Mitchell Sogin、Stephen Soginが初めて5S rRNA遺伝子を使用して細菌内のいくつかのファミリーを検出しようとしました。^[2]そのわずか数年後、3つのドメインを持つ新しい生命の樹が再びWoeseと同僚によって提案されました。彼らはリボソームRNAの小サブユニット（SSU rRNA）遺伝子を使用して細菌、古細菌、真核生物を区別した最初の人々でした。^{[3]このアプローチから、SSU rRNA遺伝子は、}原核生物（16S rRNA）と真核生物（18S rRNA ）の両方で最も頻繁に使用される遺伝子マーカーになりました。シーケンシング技術の着実な改善により、シーケンシングのためにそれらのDNA断片をクローニングする面倒なプロセスは迅速化されました。 2000 年代初頭のHTS (ハイスループット シーケンシング)の開発と、最新のバイオインフォマティクスとクラスター アルゴリズムを使用してこの膨大なデータを処理する能力により、微生物の調査ははるかに容易になりました。

遺伝的多様性は種によって異なります。したがって、ゲノムの標準部分から短い DNA 配列を復元することで、異なる種を識別することができます。この短い配列はバーコード配列として定義されます。ゲノムの特定の部分がバーコードとして機能するための要件は、2 つの異なる種の間で大きな変異がある一方で、同じ種の 2 つの個体間で遺伝子にあまり違いがなく、個々の種を区別しやすくすることです。^{[4] [5]}細菌と古細菌の両方で 16S rRNA/rDNA 遺伝子が使用されます。これはすべての原核生物に共通するハウスキーピング遺伝子であるため、原核生物の多様性を評価するための標準バーコードとして使用されます。原生生物の場合、対応する 18S rRNA/rDNA 遺伝子が使用されます。^[6]真菌の異なる種を区別するために、リボソームシストロンのITS (内部転写スペーサー) 領域が使用されます。^[7]

微生物界の多様性はまだ完全には解明されていませんが、主に細菌、真菌、単細胞真核生物で構成されていることはわかっています。^[4]微生物真核生物の分類上の同定には、非常に熟練した専門知識が必要であり、生物のサイズが小さい、個体が断片化している、多様性が隠れている、種が隠されているなどの理由で困難な場合が多いです。^{[8] [9]}さらに、原核生物は小さすぎて形態的に区別がつかないため、顕微鏡などの従来の方法では分類学的に割り当てることができません。 そのため、DNAメタバーコーディングを使用すると、短いハイスループットシーケンス（HTS）由来の遺伝子断片をNCBIなどの参照シーケンスデータベースと照合することで、分類学の専門知識がなくても生物を識別できます。^[10]これらの特性により、DNAバーコーディングは従来の方法と比較して費用対効果が高く、信頼性が高く、時間のかからない方法となり、大規模な環境アセスメントの増大するニーズに対応できます。

Woese らによる最初の使用に続いて多くの研究が行われ、現在ではさまざまな用途をカバーしています。メタバーコーディングは生物学や生態学の研究だけに使用されるのではありません。医学や人間の生物学でも、細菌バーコードが使用されています。たとえば、正常および肥満の双子におけるヒトの腸内のマイクロバイオームと細菌のコロニー形成の調査^[11]や、新生児、子供、成人の腸内細菌組成の比較研究などです。^{[12]さらに、バーコーディングは、河川や小川のバイオモニタリング[13]や草原の再生[14]}において重要な役割を果たしています。保全寄生虫学、環境寄生虫学、古寄生虫学でも、病気の調査と管理における有用なツールとしてバーコーディングが使用されています。^[15]

シアノバクテリアは光合成を行う原核 生物のグループです。他の原核生物と同様に、DNA配列を用いたシアノバクテリアの分類は、主に16Sリボソーム遺伝子内の類似性に基づいています。^[16]そのため、シアノバクテリアの識別に使用される最も一般的なバーコードは16S rDNAマーカーです。原核生物内の種を定義することは困難ですが、16Sマーカーは個々の操作的分類単位（OTU）を決定するために使用できます。場合によっては、これらのOTUは従来定義された種にリンクすることもでき、したがって進化関係の信頼できる表現と見なすことができます。^[17]

しかし、シアノバクテリア群集全体の分類構造や生物多様性を分析する場合（ DNAメタバーコーディングを参照）、シアノバクテリアに特有のマーカーを使用する方が有益です。ユニバーサル16S細菌プライマーは、環境サンプルからシアノバクテリアのrDNAを分離するために効果的に使用されていますが、多くの細菌配列も回復します。^{[18] [19]シアノバクテリア特異的[20]}または植物特異的16Sマーカーの使用は、シアノバクテリアのみに焦点を当てるためによく使用されます。^[21]このようなプライマーのいくつかのセットは、環境サンプルのバーコーディングまたはメタバーコーディングにテストされており、良好な結果が得られ、非光合成生物または非シアノバクテリア生物の大部分を除外しました。^{[22] [21] [23] [24]}

データベースで利用可能な配列決定されたシアノバクテリアゲノムの数は増加している。^[25]そのため、16Sマーカーの他に、系統学的研究には、タンパク質コード遺伝子の配列（gyrB、rpoC、rpoD、^[26] rbcL、hetR、^[27] psbA、^{[28] [29]} rnpB、^[30] nifH、^[31] nifD ^[32]）、リボソームRNA遺伝子の内部転写スペーサー（16S-23S rRNA-ITS）^{[33] [25]}またはフィコシアニン遺伝子間スペーサー（PC-IGS）^[33]などのより可変的な配列も含めることができる。しかし、nifDとnifHは窒素固定シアノバクテリア株の同定にのみ使用できる。

シアノバクテリアのDNAバーコーディングは、さまざまな生態学的、進化学的、分類学的研究に応用できます。例としては、シアノバクテリアの多様性と群集構造の評価、^[34]生態学的および経済的に重要な水域における有害なシアノバクテリアの特定^[35]、海洋無脊椎動物におけるシアノバクテリアの共生生物の評価などがあります。^{[24]これは、シアノバクテリアの発生を日常的に}監視するプログラムの一部として、また水域における潜在的に有毒な種の早期検出に役立つ可能性があります。これにより、有害種が大量発生する前に検出し、水管理戦略を改善するのに役立つ可能性があります。環境DNAに基づく種の同定は、顕微鏡を使用した従来の同定が困難なため、シアノバクテリアに特に役立つ可能性があります。種の境界の基礎となる形態学的特徴は、成長条件によって変化します。^{[20] [36]}顕微鏡による同定には時間がかかり、そのため比較的コストがかかります。分子的方法では、従来の識別方法よりもサンプル内のシアノバクテリア細胞の濃度がはるかに低くても検出できます。

参照データベースは、種または機能のいずれかに割り当てられた DNA 配列のコレクションです。これは、生物の分子配列を既存の分類にリンクするために使用できます。NCBIプラットフォームなどの一般的なデータベースには、全ゲノムまたはすべての生物の特定のマーカー遺伝子など、あらゆる種類の配列が含まれています。また、菌類配列専用の UNITE データベース^{[37]や原生生物}リボソーム配列専用の PR2 データベース^[38]など、特定の生物グループの配列のみが保存されているさまざまなプラットフォームもあります。一部のデータベースはキュレーションされており、キュレーションされていないデータベースを参照として使用する場合よりも高い精度で分類の割り当てを行うことができます。

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