背景 細胞外の胎児DNAが母体の血流中に放出される。 cffDNAは胎盤 栄養膜細胞 に由来する。[ 1 ] [ 2 ] 流 に放出されると胎児DNAは断片化する。[ 3 ]
cffDNA断片は約200塩基対（bp）の長さです。これらは母体DNA断片 よりもかなり小さいです。[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]
母体血中の無細胞DNAの約11～13.4%は胎児由来である。その量は妊婦によって大きく異なる。[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]
cffDNAの分析は、現在の技術よりも早期に胎児の状態を診断できる可能性がある。cffDNAは母体血中に存在するため、サンプリングに伴う自然流産 のリスクはない。[ 10 ] [ 11 ] [ 12][13 ] [ 14 ] cffDNA 分析 は 、羊水穿刺 や絨毛膜絨毛採取 などの他の技術と同様の倫理的および実際的な問題 を抱えている。[ 15 ]
cffDNAを採取する際の欠点としては、母体血中のcffDNA濃度が低いこと、個人間でcffDNAの量にばらつきがあること、母体血中のcffDNAと比較して母体無細胞DNAの濃度が高いことなどが挙げられる。[ 16 ]
新たな証拠によれば、体外受精妊娠では自然妊娠と比較して、cffDNA検査の失敗率が 高く、胎児分画（母体血液サンプル中の胎児DNAと母体DNAの比率）が低く、18トリソミー、13トリソミー、SCAのPPVが低下していることが示されている。[ 17 ]
実験室法 遺伝子異常の無細胞胎児DNAスクリーニングのための多くの実験室的方法が開発されてきた。主なものとしては、（1）大規模並列ショットガンシーケンシング （MPSS）、（2）ターゲット大規模並列シーケンシング（t-MPS）、（3）一塩基多型 （SNP）に基づくアプローチがある。[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]
妊娠約10週目に、母親の末梢血サンプルを静脈穿刺によって採取する。 [ 21 ]
cffDNAの分離 実験室用遠心分離機を用いて 血漿を 分離する。次にcffDNAを分離・精製する。[ 22 ] この手順の標準化されたプロトコルは、科学文献 の評価に基づいて作成された。cffDNA抽出の最高収量は「QIAamp DSP Virus Kit」で得られた。[ 23 ]
母体血サンプルにホルムアルデヒド を加えると、cffDNAの収量が増加する。ホルムアルデヒドは無傷の細胞を安定化させるため、母体DNAのさらなる放出を阻害する。ホルムアルデヒドを加えると、母体血サンプルから回収されるcffDNAの割合は0.32%から40%の間で変動し、平均は7.7%である。[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]
cffDNAの回収率は、DNA断片の長さに関係している可能性がある。胎児DNAを増やすもう一つの方法は、DNA断片の物理的な長さに基づいている。より小さな断片は、母体血サンプル中の全無細胞DNAの最大70%を占める可能性がある。
cffDNAの解析 リアルタイムPCRでは、蛍光プローブを用いて増幅産物 の蓄積をモニタリングします。レポーター蛍光シグナルは、生成された増幅産物の数に比例します。最適なリアルタイムPCRプロトコルは、検出対象となる特定の変異または遺伝子型に応じて設計されます。点変異は、アレル 特異的プローブを用いた定性リアルタイムPCRで解析されます。挿入 および欠失は 、定量リアルタイムPCRを用いた用量測定によって解析されます。
cffDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR）によって父親由来のDNA配列を検出することによって検出される可能性がある。[ 27 ] [ 28 ]
ネステッドPCR 母体血漿中のcffDNA中のY染色体特異的シグナルを検出することにより性別を判定するために、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応 （ネステッドPCR）の使用が評価された。ネステッドPCRは55人の男児胎児のうち53人を検出した。女児胎児を持つ25人の女性のうち3人の血漿中のcffDNAにはY染色体特異的シグナルが含まれていた。この実験におけるネステッドPCRの感度は 96%であった。特異度 は88%であった。[ 30 ]
mRNA 胎盤で発現する遺伝子のmRNA転写産物は母体血漿中で検出可能である。[ 40 ] RNA を抽出する。RT -PCRは 、選択されたRNAの発現を検出するために使用される。例えば、ヒト胎盤ラクトゲン （hPL）およびβ-hCG mRNAは母体血漿中で安定しており、検出可能である（Ngら、2002）。これは、母体血漿中のcffDNAの存在を確認するのに役立つ。[ 16 ]
アプリケーション
父子鑑定 出生前DNA親子鑑定は 市販されている。この検査は妊娠9週目から実施可能である。
異数性 性染色体 母体血清cffDNAのハイスループットシーケンスによる解析は、ターナー症候群 、クラインフェルター症候群 、トリプルX症候群 などの一般的な胎児性染色体 異数性 を検出できますが、この手順の陽性予測値は 低いです。[ 59 ]
トリソミー21（ダウン症候群 ）の出生前遺伝子検査の適応を決定するためのアルゴリズムの一例として、遺伝子血液検査 （中央）は母親の血液サンプル中のcffDNAを検出することによって行われる。[ 60 ] 21トリソミー 胎児の21番 染色体トリソミーはダウン症候群の原因です。このトリソミーは、母体血中のcffDNAを大規模並列ショットガンシーケンス（MPSS）で分析することにより検出できます。[ 61 ] [ 61 ] [ 61 ] [ 62 ]
13トリソミーと18トリソミー 母体血漿中のcffDNAをMPSSで分析して13トリソミーまたは18トリソミーを探すことは可能である[ 63 ]。
感度と特異性を制限する要因としては、母体血漿中のcffDNAのレベルや、母体染色体のモザイク 現象などが挙げられる。[ 64 ]
異数体染色体由来の胎児核酸 分子は多数検出可能であり、これにはSERPINEB2 mRNA、clad B、 18番染色体 由来の低メチル化SERPINB5 、胎盤特異的4（PLAC4）、12番染色体 由来の高メチル化ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）、c21orf105 mRNAが含まれる。[ 65 ] 感度が 96～100%、特異度が 94～100%と推定されています。妊娠 10週で実施可能です。[ 66 ] 偽陽性 率が0.3%、陽性予測値 が80%と推定されています。[ 67 ]
歴史 1997年、香港の分子生物学者デニス・ロー とそのチームは、Y-PCRアッセイを初めて用いて、母体血漿サンプル中の胎児Y染色体配列（Y特異的配列は母体ゲノムには存在しない胎児の遺伝子配列であるため[ 73 ] [ 74 ] [ 75 ]
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